Name: Liposomas antigénicos para la generación de anticuerpos específicos de la enfermedad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprende a preparar nanopartículas liposómicas antigénicas para activar linfocitos B in vitro e in vivo. Este método robusto genera respuestas de anticuerpos específicos en un modelo murino de alergia al maní con menor variabilidad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Esta investigación fue apoyada por becas del Departamento de defensa (W81XWH-16-1-0302 y W81XWH-16-1-0303).

<ol><li>Gupta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence%2C+severity%2C+and+distribution+of+childhood+food+allergy+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States.</a> Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).</li>
<li>Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((US+prevalence+of+self-reported+peanut%2C+tree+nut%2C+and+sesame+allergy%3A+11-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).</li>
<li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublingual+immunotherapy+for+peanut+allergy%3A+clinical+and+immunologic+evidence+of+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).</li>
<li>Vickery, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+unresponsiveness+to+peanut+in+subjects+who+have+completed+peanut+oral+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468(2014).</li>
<li>Jones, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicutaneous+immunotherapy+for+the+treatment+of+peanut+allergy+in+children+and+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242(2017).</li>
<li>Varshney, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+controlled+study+of+peanut+oral+immunotherapy%3A+clinical+desensitization+and+modulation+of+the+allergic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).</li>
<li>Anagnostou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+efficacy+of+oral+immunotherapy+for+the+desensitisation+of+peanut+allergy+in+children+%28STOP+II%29%3A+a+phase+2+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial.</a> Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).</li>
<li>Sampson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Varying+Doses+of+Epicutaneous+Immunotherapy+vs+Placebo+on+Reaction+to+Peanut+Protein+Exposure+Among+Patients+With+Peanut+Sensitivity%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial.</a> The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).</li>
<li>Bednar, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD22+Inhibits+Murine+B+Cell+Receptor+Activation+in+a+Human+CD22+Transgenic+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model.</a> Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).</li>
<li>Macauley, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+liposomes+displaying+CD22+ligands+induce+antigen-specific+B+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis.</a> Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).</li>
<li>Orgel, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+CD22+on+antigen-specific+B+cells+to+prevent+allergy+to+the+major+peanut+allergen+Ara+h+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2.</a> Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).</li>
<li>Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-fixed+leukocytes+tolerize+Th2+responses+in+mouse+models+of+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).</li>
<li>Kulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2S+albumin+allergens+of+Arachis+hypogaea%2C+Ara+h+2+and+Ara+h+6%2C+are+the+major+elicitors+of+anaphylaxis+and+can+effectively+desensitize+peanut-allergic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice.</a> Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).</li>
<li>Dang, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+accuracy+of+peanut+allergy+diagnosis+by+using+Ara+h+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).</li>
<li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).</li>
<li>Sen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+plays+a+critical+role+in+peanut+allergen+stability+and+may+determine+immunodominant+IgE-binding+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes.</a> Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).</li>
<li>Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-selective+protein-modification+chemistry+for+basic+biology+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development.</a> Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).</li>
<li>Jimenez-Saiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifelong+memory+responses+perpetuate+humoral+TH2+immunity+and+anaphylaxis+in+food+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy.</a> Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).</li>
<li>Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Treatment+of+Peanut-Allergic+Mice+with+Bortezomib+Significantly+Reduces+Serum+Anti-Peanut+IgE+but+Does+Not+Affect+Allergic+Symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).</li>
<li>LaMothe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerogenic+Nanoparticles+Induce+Antigen-Specific+Regulatory+T+Cells+and+Provide+Therapeutic+Efficacy+and+Transferrable+Tolerance+against+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 281(2018).</li>
<li>Srivastava, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+peanut+oral+immunotherapy+with+CpG%2Fpeanut+nanoparticles+in+a+murine+model+of+peanut+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy.</a> J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).</li>
<li>Bellinghausen, I., Saloga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+allergic+immune+responses+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Analysis of allergic immune responses in humanized mice.</a> Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).</li>
<li>Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells and autoimmunity.</a> Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).</li>
<li>Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+myasthenia+gravis%3A+utility+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+General+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations.</a> International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).</li>
<li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+myasthenia+gravis.+A+murine+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental myasthenia gravis. A murine system.</a> J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).</li>
<li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+between+the+frequency+of+muscular+weakness+and+loci+that+regulate+immune+responsiveness+in+murine+experimental+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis.</a> J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).</li>
<li>Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autoantibodies+in+the+pathophysiology+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis.</a> Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos descritos aquí son un protocolo general para la conjugación de una proteína a un lípido que permite la visualización de la proteína en nanopartículas liposómicos. Para proteínas de multi-subunidades muy grandes, este protocolo puede haber limitado utilidad. El método ideal sería la introducción de una etiqueta específica que permite una estrategia de enlace químico biorthogonal ser utilizado. Si expresan la proteína por vía recombinante, esto puede ser posible utilizando estrategias específicas disponibles<su...

La alergia alimentaria afecta al 8% de los niños en los Estados Unidos y prevalencia se ha incrementado en los últimos decenio1. Alergia al maní afecta a 1% de los niños y no es típicamente pequeño2. Aunque varios prometedores ensayos clínicos están en marcha para el tratamiento de la alergia alimentaria, incluyendo inmunoterapia oral (OIT), la inmunoterapia sublingual (SLIT) y epicutánea inmunoterapia (EPIT), actualmente no hay estrategias de tratamiento aprobado por la FDA para individuos alérgicos a cacahuete3,4,5,6,7,8de desensibilización. Por lo tanto, personas alérgicas deben evitar estrictamente los alergenos para evitar la anafilaxia. Quedan muchos interrogantes en cuanto a vías de sensibilización y subyacente a los mecanismos de desarrollo de alergia alimentaria.
Modelos de ratón son una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos de la alergia, así como desarrollar nuevos tolerogénicas y desensibilización terapias9,10,11,12. Esto es particularmente cierto porque el alergénico principal del cacahuete (Ara h 2; Ah2) en seres humanos es también el alergeno dominante en varios descrito ratón modelos13,14. Mientras que los modelos de ratón de la alergia del cacahuete son invaluables en el estudio de los mecanismos de sensibilización y tolerancia, una desventaja es que puede ser variable y requieren el uso de adyuvantes. Inmunógenos más potente sería una forma de minimizar la variabilidad intrínseca de dichos modelos. Puesto que las células de B son fuertemente activadas por antígenos multivalentes, liposomas antigénicas mostrando el alérgeno son una buena opción debido a su capacidad para potencialmente activar células B a través de los receptores de células B (BCR) mientras que también tiene la propiedad de manera eficiente el compartimiento de las células T a través de ser tomado no específica de antígeno-presentación de cebado las células.
Aquí, describimos un protocolo detallado para antígenos de la proteína a la nanopartículas mediante una estrategia modular y fácil de conjugar. Utilizando un antígeno de suplente, fragmento Fab de anti-IgM, demostramos cómo potente estos liposomas antigénicas pueden ser en la activación de células B estimulante. Liposomas antigénicas con Ah2 antígeno fueron usados para desarrollar un nuevo modelo de ratón de confiere sensibilidad. En este modelo, los esplenocitos de ratones alérgicas cacahuetes verificadas, que contienen cacahuete específica memoria células B y T, se transfieren a ratones Congénicos de ingenuo. Inyección de liposomas conjugados con Ah2 en los ratones receptores, con el fin de inducir anticuerpos contra Ah2 induce respuestas de anticuerpos de memoria. Seguido por un único impulso con Ah2 soluble, anticuerpos específicos Ah2 dan lugar a una fuerte respuesta anafiláctica cuando estos ratones son desafiados posteriormente con Ah2. Ratones sometidos a la reacción alérgica responden de manera más uniforme y no han recibido un adyuvante, este enfoque es un modelo de alergia del cacahuete deseable y los resultados sugieren que puede tener utilidad en otros modelos de ratón impulsados por antígenos dirigidos a alérgenos y posiblemente autoantígenos.

<table><tbody><tr><td>Modelo 2110 Colector de fracciones</td><td>BioRad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>Cholestrol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Sigma grado 99%</td></tr><tr><td>SPDP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21857</td><td></td></tr><tr><td>DSPC</td><td>Avanti</td><td>850365</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG 18:0</td><td>Avanti</td><td>880120</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG Maleimida</td><td>Avanti 880126</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrusora</td><td>Avanti</td><td>610000</td><td>Jeringa de 1 mL con soporte/bloque calefactor</td></tr><tr><td>Filtros 0.1 y micro; m</td><td>Avanti</td><td>610005</td><td></td></tr><tr><td>Filtros 0.8 &micro; m</td><td>Avanti</td><td>610009</td><td></td></tr><tr><td>10 mm Soportes de filtro</td><td>Avanti</td><td>6100014</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio Matraz de fondo redondo</td><td>Sigma</td><td>Z100633</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de rotación</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P-301398</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P-198194</td><td></td></tr><tr><td>Leur Lock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>k4201634503</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50 Beads</td><td>GE Life Sciences</td><td>17004201</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G100 Beads</td><td>GE Life Sciences</td><td>17006001</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated Fetal Calf Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>1x tampón de lisis RBC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Indo-1</td><td>Invitrogen</td><td>I1203</td><td></td></tr><tr><td>CD5-PE</td><td>BioLegend</td><td>100608</td><td></td></tr><tr><td>B220-PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170112</td><td>sin calcio y magnesio</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Fab anti-ratón IgM</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-007-020</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 anti-ratón IgM</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-006-020</td><td></td></tr><tr><td>Harina de cacahuete</td><td>Golden Peanut Co.</td><td>521271</td><td>12% grasa tueste ligero, 50% proteína</td></tr><tr><td>Agujas de alimentación animal</td><td>Cadence Science</td><td>7920</td><td>22g x 1.5", 1.25 mm - recto</td></tr><tr><td>Termómetro de microsonda</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Sonda rectal para ratones</td><td>Physitemp</td><td>Ret-3</td><td></td></tr><tr><td>Toxina del cólera, de Vibrio cholera</td><td>List Biological Laboratories, Inc.</td><td>100B</td><td>Kit de ensayo de</td></tr><tr><td>proteínas BCA</td> sin azida <td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de carbonato-bicarbonato</td><td>Sigma</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>TMB Solución de parada</td><td>KPL</td><td>50-85-06</td><td></td></tr><tr><td>SureBlue TMB Microwell Sustrato de peroxidasa</td><td>KPL</td><td>5120-0077</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos, placa Immulon 4HBX Thermo</td><td>Scientific</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>Ara h 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>purificado como en: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology</td></tr><tr><td>HSA-DNP</td><td>Sigma</td><td>A-6661</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgE anti-DNP</td><td>Accurate Chemical</td><td>BYA60251</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-Mouse IgE</td><td>El sitio de unión</td><td>PC284</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilado Burro anti-ovejas IgG Preciso</td> JNS065003 <td>Químico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Protein, HRP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31001</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IgG1 anti-DNP</td><td>Preciso</td><td>MADNP105 Químico</td><td></td></tr><tr><td>HRP Cabra anti-ratón IgG1 Southern</td><td>Biotech</td><td>1070-05</td><td></td></tr> 1 <tr><td>mL Jeringas de Insulina</td><td>BD 329412</td><td></td><td>U-100 Insulina, 0,40 mm (27 G) x 16,0 mm (5/8")</td></tr><tr><td>Superfrost Portaobjetos de Microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-14</td><td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific 11875093</td><td></td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>70 &mu; m Nylon, Blanco, Estéril, Empaquetado individualmente</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>NP0322BOX 10 geles</td></tr><tr><td>Tampón NuPAGE LDS, 4x</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Pre-teñido estándar</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td>500 &micro; L</td></tr><tr><td>Tampón de funcionamiento NuPAGE MES/SDS, 20x</td><td>Invitrogen</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Stain Thermo Scientific</td><td>24590</td><td>500 mL</td></tr></tbody></table>

liposomas antigénicos para la generación de anticuerpos específicos de la enfermedad

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Respuestas de anticuerpos proporcionan inmunidad protectora crítica a una amplia gama de patógenos. Existe un gran interés en la generación de anticuerpos robustos para la vacunación, así como entender cómo patógeno anticuerpo respuestas desarrollan alergias y enfermedades autoinmunes. Generar respuestas de anticuerpos específicos del antígeno robusta no es siempre trivial. En modelos de ratón, a menudo requiere múltiples rondas de inmunización con adyuvante que conduce a una gran cantidad de variabilidad en los niveles de anticuerpos inducidos. Un ejemplo es en modelos de ratón de alergia a los cacahuates en modelos más robustos y reproducibles que minimicen el número de ratón y el uso de adyuvante sería beneficiosos. Presentado aquí es un modelo de ratón altamente reproducible de anafilaxis alergia del cacahuete. Este nuevo modelo se basa en dos factores clave: (1) específica de antígeno esplenocitos eventualmente se transfieren de un ratón sensibilizado de maní en un ratón receptor ingenuo, normalizando la cantidad de memoria específica de antígeno las células B y T a través de un gran número de ratones; y ratones receptores (2) posteriormente se refuerzan con un fuerte inmunógeno multivalente en forma de nanopartículas liposómicos mostrando el alergénico principal del cacahuete (Ara h 2). La gran ventaja de este modelo es su reproducibilidad, que en última instancia, disminuye el número de animales utilizados en cada estudio, al tiempo que minimiza el número de animales que recibieron las inyecciones múltiples de adyuvante. El montaje modular de estos liposomas inmunogénicas proporciona relativamente fácil adaptabilidad a otros modelos alérgicas o autoinmunes que involucran anticuerpos patógenos.

Conjugación de la proteína de interés con DSPE-PEG(2000) puede demostrar ejecutando una reducción mostrando un incremento en el peso molecular en comparación con la proteína no conjugada. Figura 1A muestra un gel representante de conjugación de fragmento de anti-ratón IgM F(ab) PEG-DSPE, que muestra un bandshift de 2 – 3 kDa de la proteína desnaturalizada. Tenga en cuenta que aproximadamente el 50% de la proteína parece ser modificado, que se espera que la es...

Descrito es la preparación de nanopartículas liposómicos antigénicas y su uso en estimular la activación de células B en vitro e in vivo. Respuestas de anticuerpos consistente y robusto condujeron al desarrollo de un nuevo modelo de la alergia del cacahuete. El protocolo para la generación de liposomas antigénicas puede ampliarse a los diferentes antígenos y vacunas.

Liposomas antigénicos para la generación de anticuerpos específicos de la enfermedad

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cómo se activan los glóbulos blancos, y cómo se desarrollan las alergias a los alérgenos individuales? La principal ventaja de este modelo de ratón de alergia robusto y reproducible es que se pueden utilizar menos ratones para producir una menor varianza con una población experimental. Las nuevas inmunoterapias para controlar las respuestas inmunitarias requieren modelos robustos de ratón como medio inicial de pruebas de eficacia in vivo.Por lo tanto, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia para alergias. Aunque este método puede proporcionar información sobre las alergias, también se puede aplicar a otros sistemas, como la autoinmunidad en la que las respuestas de anticuerpos no deseados juegan un papel clave en la enfermedad. Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán debido a la falta de experiencia en el trabajo con nanopartículas liposómicas o una inexperiencia con las técnicas requeridas en el trabajo del ratón.Comience añadiendo 2,5 molar equivalentes del reticulante heterobifuncional a la proteína y colocando la reacción en una coctelera os

antigenic-liposomes-for-generation-of-disease-specific-antibodies

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Los aspectos técnicos de la realización de los labios (Sistemas de luciferasa inmunoprecipitación) se describen. El enfoque general consiste en la expresión de genes quiméricos que codifican antígenos fusionados a Renilla luciferase (RUC) en células de mamíferos. Crudo Ruc-antígeno extractos son preparados y, sin purificación, empleados en ensayos de inmunoprecipitación para cuantificar anticuerpos.

Perfiles de anticuerpos por los sistemas de inmunoprecipitación luciferasa (LIPS)

Fuente: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramixovirus para la inmunomodulación dirigida a tumores: diseño y evaluación ex vivo. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la generación de virus del sarampión recombinantes utilizando liposomas para entregar plásmidos que codifican el antigenoma viral y proteínas auxiliares esenciales en células productoras. El ARN transcrito y replicado conduce a la formación de partículas virales que expresan proteínas inmunomoduladoras y proteínas reporteras...

Generación de un virus del sarampión recombinante que codifica una proteína inmunoestimuladora

Este video muestra la evaluación de la activación de las células B mediante la utilización de liposomas antigénicos. Las células B tratadas con colorante Indo-1 sensible al calcio se distinguen mediante citometría de flujo y se analiza su relación de fluorescencia violeta-azul. A medida que las células encuentran liposomas antigénicos, desencadenan la activación de las células B a través de la afluencia de calcio, mejorando progresivamente la relación de señal de fluorescencia violeta a azul...

Monitorización de la activación de células B con liposomas antigénicos mediante un ensayo de flujo de calcio

El objetivo de este protocolo es utilizar liposomas catiónicos/aniónicos con un péptido neuro-dirigido como sistema de administración del SNC para permitir que el siRNA atraviese la BBB.  La optimización de un sistema de administración de tratamientos, como el siRNA, permitiría más opciones de tratamiento para los priones y otras enfermedades neurodegenerativas.

Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas

Se presenta un protocolo optimizado para la generación de anticuerpos monoclonales basado en la tecnología de hibridomas. Los ratones fueron inmunizados con un inmunoconjugado. Las células del bazo se fusionaron mediante PEG y un impulso eléctrico con células de mieloma inmortal. Las células de hibridoma productoras de anticuerpos se seleccionaron mediante HAT y ELISA específico de antígeno.

Generación de anticuerpos monoclonales murino por el hibridoma Tecnología

Se describe un método para la producción de anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés, a partir de células B circulantes en la sangre humana. Generación de estos anticuerpos naturales es eficiente y rápido, y los anticuerpos obtenidos pueden discriminar entre antígenos muy similares.

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

Este artículo proporciona un protocolo detallado para la preparación y evaluación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales para su uso en inmunoensayos diferentes. Este procedimiento incluye vacunación, fusión celular, indirecta ELISA competitivo para clon positiva proyección y preparación de hibridomas monoclonal. También se proporcionan las especificaciones para la caracterización de anticuerpos mediante MALDI-TOF-MS y los análisis de ELISA.

Generación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales

Aquí se describe un protocolo para la generación de nanoliposomas catiónicos, que se basan en el método de película seca y pueden ser utilizado para la caja fuerte y una entrega eficiente de in vitro transcribe ARN mensajero.

Generación de nanoliposomas catiónicos para la entrega eficiente de In Vitro transcribe ARN mensajero

Este protocolo describe un método eficiente libre de células para la producción de proteoliposoma de alta calidad por el método de diálisis bicapa utilizando un sistema libre de células de trigo y liposomas. Este método proporciona medios adecuados para el análisis funcional de proteínas de membrana, detección de objetivos farmacológicos y desarrollo de anticuerpos.

Producción libre de células de proteoliposomas para análisis funcional y desarrollo de anticuerpos dirigidos a proteínas de membrana

Aquí, presentamos un protocolo para detectar epítopos de neutralización en partículas similares a virus (VLP) que muestran antígenos. La inmunoprecipitación de las VLP derivadas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se realiza utilizando anticuerpos monoclonales específicos de glicoproteínas de la envoltura acoplados a perlas magnéticas conjugadas con proteína g. Las VLP capturadas se someten posteriormente a SDS-PAGE y western blot-análisis empleando anticuerpos específicos de gag de...

Detección de epítopos sensibles a la neutralización en antígenos mostrados en vacunas basadas en partículas similares a virus (VLP) utilizando un ensayo de captura

Aprende a preparar nanopartículas liposómicas antigénicas para activar linfocitos B in vitro e in vivo. Este método robusto genera respuestas de anticuerpos específicos en un modelo murino de alergia al maní con menor variabilidad.

Liposomas antigénicos para la generación de anticuerpos específicos de la enfermedad

Explorar más videos