Name: Potenciación de la eficacia del anticuerpo contra el cáncer por fármacos antineoplásicos: detección de anticuerpos-droga sinergia utilizando la ecuación de índice de combinación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Aprende a evaluar la sinergia entre anticuerpos antitumorales y fármacos antineoplásicos utilizando la ecuación de índice de combinación de Chou-Talalay en modelos preclínicos. Este protocolo permite cuantificar interacciones sinérgicas para optimizar terapias oncológicas combinadas.

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Concesión de la ayuda: Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, les Bagouz' à Manon, La Ligue contre le cáncer comité de Loire-Atlantique, comité de Morbihan y comité de Vendée, une rose pour S.A.R.A.H, L'Etoile de Martin y la Société Française de Lutte contre les Los cánceres et les leucémies de l ' enfant et de L'adolescent (SFCE). M.B. y J.F. son apoyados por La Ligue Contre Le cáncer. Los autores agradecen a la UTE-instalación de la estructura Fédérative de Recherche François Bonamy. Los autores también agradecen el Dr. S. Suzin (Inserm, París) para proporcionar las células IMR5 y Sra. H. Estéphan su asistencia técnica.

Alojamiento de los animales y procedimiento experimental fueron aprobados por el gobierno francés (acuerdos #C44-278 y #APAFIS 03479.01). Procedimientos y cuidado de los animales se realizaron bajo Directiva UE 2010/63/UE y ley #2013-118 sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos.
1. evaluación de la interacción entre el medicamento mAb 8B6 y Topotecan In Vitro
<ol><li>preparación de la muestra de 96 pocillos PRECAUCIÓN: Consulte con la Comisión de salud y seguridad de la institución y reglas de regulación local relacionados con la seguridad en el laboratorio. Revise la información Material y ficha de seguridad antes de trabajar con los medios de comunicación, líneas celulares o reactivos. Utilizar técnica estéril adecuada y trabajar en campana de flujo laminar. Todas soluciones/equipos que se utilizan para manipular las células deben ser estériles. Nota: El siguiente protocolo fue diseñado para uso con las células adherentes. Modificaciones están obligadas a aplicar el método a nonadherent células en suspensión; Este protocolo utiliza cuadruplicado para cada condición experimental.<ol>
<li>Crecen las células IMR5 en un matraz T75.</li>
		<li>En el primer día (día 0), observar el cultivo de células bajo un microscopio para verificar la confluencia celular. Aspire el medio celular del frasco, lavar con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y añadir 3 mL de 0.05% ácido etilendiaminotetracético (EDTA) / solución de PBS. Vuelva el matraz a la incubadora por 3 min (37 ° C, 5% CO2).</li>
		<li>Examinar la cultura de célula bajo el microscopio para la separación de la célula. Nota: Si es necesario, retomar la cubeta de la incubadora durante un min de 3 a 5 adicional, dependiendo del tipo de tumor de la célula.</li>
		<li>Añadir 10 mL de medio completo celular al matraz y transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL estéril. Centrifugar las células durante 5 min a 300 x g. Contar las células usando un hemocitómetro.</li>
		<li>Retire y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en el medio de cultivo completo. Ajustar el volumen del medio para obtener una concentración final de 1 x 105 células/mL.</li>
		<li>Pozos de una placa de cultivo de 96 pocillos con 104 células cada uno, que es 100 μl de suspensión celular de semillas 84. Seguir el diseño experimental que se muestra en la figura 2.</li>
		<li>Incube las células durante 18 horas en la incubadora de la célula (37 ° C, 5% CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la solución de droga Nota: Para los estudios de sensibilización de drogas/mAb, modificar el tiempo, la longitud y el tratamiento de la concentración a la droga/mAb particular en cuestión. Tenga en cuenta que la concentración inicial es 3 x la concentración final.<ol>
<li>A la mañana siguiente (día 1), preparar las siguientes soluciones de drogas utilizando medio de cultivo completo.<ol>
<li>
preparación de solución de mAb
			<ol>
<li>Diluir el mAb en 500 μl de medio de cultivo completo para obtener una solución de trabajo de anticuerpos con una concentración de mAb de 240 μg/mL.</li>
				<li>Realizar cinco diluciones dobles en serie como se indica en la figura 2.</li>
			</ol>
</li>
			<li>
Preparación de solución de topotecán
			<ol>
<li>Diluido, como arriba, la droga en 500 μl de medio de cultivo completo para obtener una solución de trabajo de medicamentos con una concentración final de 120 nM.</li>
				<li>Realizar cinco diluciones dobles en serie como se indica en la figura 2.</li>
			</ol>
</li>
			<li>
Preparación de solución de anticuerpo y medicamento
			<ol>
<li>Diluir las soluciones de drogas y mAb en 500 μl de medio de cultivo completo para obtener una solución de 120 drogas de nM y mAb de 240 μg/mL (solución de trabajo).</li>
				<li>Realizar cinco diluciones dobles en serie como se indica en la figura 2.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para llegar a la concentración final, transferir 50 μl de cada solución de la droga en los pocillos correspondientes, como se indica en el diseño experimental ( figura 2). Nota: Transferir 50 μl del medio de cultivo completo en los pocillos de untreated de la célula, como se indica en la figura 2.</li>
		<li>Incube las células durante 72 h en la incubadora (37 ° C, 5% CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo MTT
	<ol>
<li>Añadir 10 μl de solución de reactivo MTT en cada pozo.</li>
		<li>Incubar a 37 ° C por 4 h.</li>
		<li>Añada 100 μl de solución de lisis (10% SDS en 0.01 M HCl) en cada pocillo, utilizando una pipeta multicanal y homogeneizar mediante pipeteo.</li>
		<li>Incubar a 37 ° C por 4 h en una cámara humidificada (95% de humedad).</li>
		<li>Leer la absorbancia a 570 nm (un570) y 620 nm (un620) utilizando un espectrofotómetro. Nota: Mezcle cada muestra otra vez transfiriendo antes de leer la absorbancia; absorbancia a 620 nm permite la corrección de los valores de fondo no específicas.</li>
		<li>Calcular la absorbancia corregida: corregida absorbancia = un570- A620.</li>
		<li>Calcular la viabilidad celular como sigue: viabilidad celular = 100 x (promedio de absorbancia corregida de la muestra / absorbancia media corregida de control).</li>
		<li>Calcular los valores afectados por la fracción (Fa) mediante la siguiente ecuación: 1 - (absorbancia media corregida de la muestra / absorbancia media corregida de control).</li>
	</ol></li>
	<li>Software de simulación análisis de interacción de drogas individual y estudios de la combinación de medicamentos
	<ol>
<li>Ejecute el software de simulación para abrir la ventana de inicio.</li>
		<li>Haga clic en el botón Nuevo experimento para abrir la ventana principal .</li>
		<li>Escriba el nombre del experimento en la ventana de nombre . Nota: Puede añadirse una fecha en la ventana de fecha .</li>
		<li>Haga clic en el botón Nueva droga sola .</li>
		<li>Escriba el nombre en la ventana de Nombre completo .</li>
		<li>Escriba la abreviatura en la ventana de la abreviatura .</li>
		<li>Escriba la unidad de concentración de droga en la ventana unidades .</li>
		<li>Introduzca Datos punto 1 dosis y el valor de Fa, presione entrar.</li>
		<li>Repita este paso hasta que todos los puntos de datos se introducen.</li>
		<li>Haga clic en el botón terminado .</li>
		<li>Siga los mismos pasos para introducir puntos de datos de mAb. Nota: Utilice la misma unidad de concentración utilizada por droga.</li>
		<li>Haga clic en el botón de Nuevo una combinación de medicamentos .</li>
		<li>Seleccione medicamentos y mAb.</li>
		<li>Seleccione la Constante relación y haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Escriba el nombre en la ventana de Nombre completo .</li>
		<li>Escriba la abreviatura en la ventana de la abreviatura .</li>
		<li>Escriba la relación droga/mAb en la ventana de relación .</li>
		<li>Introduzca Datos punto 1 dosis y presiona Enter. Nota: El programa calculará automáticamente las dosis de mAb y Combo.</li>
		<li>Introduzca el valor de Datos punto 1 Fa y presiona Enter.</li>
		<li>Repita este paso hasta que todos los puntos de datos se introducen.</li>
		<li>Haga clic en el botón terminado y, a continuación, haga clic en el botón Generar informe .</li>
		<li>Seleccione medicamentos y mAb y, a continuación, haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Seleccione el Combo y, a continuación, haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Seleccione encabezado, tabla de CIy cuadro resumen. A continuación, haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Escriba el nombre de archivo del archivo de análisis y haga clic en Guardar para generar el informe. Nota: Después de hacer clic en Aceptar, el informe se abrirá automáticamente en el explorador de web predeterminado de la computadora.</li>
		<li>Para imprimir el informe, elija Imprimir del menú de archivo del navegador web. El informe contiene una sección de la tabla resumen que incluye título, fecha, nombre del archivo, Descripción Nota, parámetros (m, Dm y r), ED50 para cualquier agente utilizado en monoterapia o en combinación y la tabla de CI para cada combinación en ED50, ED 75, ED90y ED95. Nota: Un CI valor de < 1 indica sinergismo, CI valor = 1 indica la aditividad y un valor de CI de > 1 indica que el antagonismo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. generación de xenoinjertos de Neuroblastoma humano en ratones de Scid Gamma Nonobese NOD diabética (NSG ratones)
Nota: Excluye cualquier contaminación de la cultura de célula. Puesto que la matriz de la membrana del sótano forma un gel por encima de 5 ° C, todos los cultureware o los medios de comunicación entre en contacto con el reactivo de la matriz de la membrana del sótano deben ser prechilled/ice-cold. Mantener la matriz de la membrana del sótano en el hielo durante todo el proceso.
<ol><li>
Preparación de la suspensión de células de IMR5
	<ol>
<li>Descongelar el reactivo de la matriz de la membrana del sótano una noche sumergiendo el frasco en el hielo en un refrigerador de 4 ° C antes de usar.</li>
		<li>En el día 0, cosecha las IMR5 células cultivadas como se detalla arriba.</li>
		<li>Transferir las células a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante. Lavar las células 2 x con 15 mL de PBS helado y preparar una suspensión de 5 x 107 células/mL en PBS helado. Nota: Si es necesario, transferir la suspensión de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Agitar el frasco de la matriz de la membrana del sótano. Nota: El reactivo de la matriz de la membrana del sótano debe ser descongelado y dispersos.</li>
		<li>Añadir un volumen de reactivo de la matriz de la membrana del sótano y mezclar mediante pipeteo para obtener una suspensión de 2.5 x 107 células /mL.</li>
		<li>Mantener la suspensión de células en el hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de los ratones Nota: Los ratones deben ser de seis a siete semanas de edad.<ol>
<li>Mantener los ratones bajo la condición de libre de patógenos específica.</li>
		<li>Permitir un período de aclimatación de tres a cinco días después de han llegado los ratones.</li>
		<li>En el día de la inoculación, afeitarse el flanco donde la inyección será (ver paso 2.3.6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la inyección de células de tumor Nota: Mantenga la suspensión de células de matriz de la membrana del sótano helado aséptica durante el procedimiento.<ol>
<li>Mezcle las células y extraer cuidadosamente la suspensión de células en una jeringa de 1 mL con una aguja de 21 G.</li>
		<li>Verifique para asegurarse que no hay ninguna burbuja de aire en la jeringa.</li>
		<li>Desinfectar la zona de inoculación del ratón con una solución antiséptica.</li>
		<li>Apriete suavemente la piel del ratón en el flanco entre los dedos, en el sitio de inyección.</li>
		<li>Inserte la aguja exactamente en el pliegue de la piel. No coloque la aguja en el tejido para asegurar una inyección subcutánea.</li>
		<li>Inyectar 100 μl de suspensión de células de IMR5 (es decir, 2.5 x 106 células) por vía subcutánea en el flanco derecho más bajo de los ratones.</li>
		<li>Rotar la jeringa para evitar la fuga y retirar la aguja.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Monitoreo de cambios de peso y crecimiento del tumor
	<ol>
<li>Medir la longitud (A) y el ancho (B) del tumor con una pinza.</li>
		<li>Calcular el volumen del tumor mediante la fórmula (A x B2) x 0.5.</li>
		<li>Iniciar el tratamiento cuando los tumores han alcanzado un volumen promedio de ~ 50-60 mm3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. drogas y la administración de anticuerpos en ratones
<ol><li>
Administración intravenosa de mAb 8B6
	<ol>
<li>Cuidadosamente llene una jeringa de 1 mL con una aguja de 25 G con solución de mAb.</li>
		<li>Coloque el ratón bajo una lámpara de calor durante 10 minutos dilatar la vena de la cola.</li>
		<li>Refrenar el ratón en un limitador de roedor.</li>
		<li>Desinfectar la zona de inoculación del ratón con una solución antiséptica.</li>
		<li>Inserte la aguja paralela a la vena de la cola, penetrante 2-4 mm en la luz, manteniendo el bisel de la cara de la aguja hacia arriba (Figura 3A).</li>
		<li>Inyectar 100 μl de solución de anticuerpos por vía intravenosa (i.v.).</li>
		<li>Una vez terminada la inyección, presionar suavemente el sitio de la inyección para prevenir el sangrado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Administración intraperitoneal de topotecán
	<ol>
<li>Extraer la solución de la droga en una jeringa de 1 mL con una aguja de 25 G.</li>
		<li>Mantenga el ratón en una posición supina, con su extremo posterior levemente elevada.</li>
		<li>Desinfectar la zona de inoculación del ratón con una solución antiséptica.</li>
		<li>Busque la línea media del abdomen del ratón y mentalmente divida el abdomen en cuadrantes. Localizar el sitio de inyección en el cuadrante inferior derecho o izquierdo (figura 3B).</li>
		<li>Inserte la aguja en el abdomen (5 mm de profundidad) en ángulo de ~ 10°, en el cuadrante inferior derecho o izquierdo.</li>
		<li>Inyectar 100 μl de solución de droga por vía intraperitoneal (i.p.).</li>
		<li>Desinfectar el sitio de inoculación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+basis%2C+experimental+design%2C+and+computerized+simulation+of+synergism+and+antagonism+in+drug+combination+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies.</a> Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).</li>
<li>Bayat Mokhtari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+in+combating+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Combination therapy in combating cancer.</a> Oncotarget. 8 (23), 38022-38043 (2017).</li>
<li>Zahreddine, H., Borden, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+insights+into+drug+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and insights into drug resistance in cancer.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 28(2013).</li>
<li>Martin, T. P., Baguley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re%3A+%22Postoperative+validation+of+bone-anchored+implants+in+the+single-sided+deafness+population.%22+Snapp+et+al.+Otol+Neurotol+2012%3A+33%3B291-6%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Re: "Postoperative validation of bone-anchored implants in the single-sided deafness population." Snapp et al. Otol Neurotol 2012: 33;291-6.</a> Otol Neurotol. 34 (4), 777-778 (2013).</li>
<li>Choi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+lung+cancer+cells+by+altered+dimerization+of+HSP27%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sensitization of lung cancer cells by altered dimerization of HSP27.</a> Oncotarget. 8 (62), 105372-105382 (2017).</li>
<li>Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies%3A+versatile+platforms+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 317-327 (2010).</li>
<li>Mellor, J. D., Brown, M. P., Irving, H. R., Zalcberg, J. R., Dobrovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+the+role+of+Fc+gamma+receptor+polymorphisms+in+the+response+to+monoclonal+antibodies+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">A critical review of the role of Fc gamma receptor polymorphisms in the response to monoclonal antibodies in cancer.</a> Journal of Hematology & Oncology. 6, 1(2013).</li>
<li>Kowalczyk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GD2-specific+14G2a+monoclonal+antibody+induces+apoptosis+and+enhances+cytotoxicity+of+chemotherapeutic+drugs+in+IMR-32+human+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The GD2-specific 14G2a monoclonal antibody induces apoptosis and enhances cytotoxicity of chemotherapeutic drugs in IMR-32 human neuroblastoma cells.</a> Cancer Letters. 281 (2), 171-182 (2009).</li>
<li>Retter, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+proapoptotic+antiganglioside+GM2+monoclonal+antibody+and+evaluation+of+its+therapeutic+effect+on+melanoma+and+small+cell+lung+carcinoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a proapoptotic antiganglioside GM2 monoclonal antibody and evaluation of its therapeutic effect on melanoma and small cell lung carcinoma xenografts.</a> Cancer Research. 65 (14), 6425-6434 (2005).</li>
<li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+induction+of+human+lung+cancer+cell+line+in+multicellular+heterospheroids+with+humanized+antiganglioside+GM2+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis induction of human lung cancer cell line in multicellular heterospheroids with humanized antiganglioside GM2 monoclonal antibody.</a> Cancer Research. 59 (20), 5323-5330 (1999).</li>
<li>Cochonneau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+and+apoptosis+induced+by+O-acetyl-GD2-specific+monoclonal+antibody+8B6+inhibits+tumor+growth+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest and apoptosis induced by O-acetyl-GD2-specific monoclonal antibody 8B6 inhibits tumor growth in vitro and in vivo.</a> Cancer Letters. 333 (2), 194-204 (2013).</li>
<li>Chou, T. C., Martin, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChou%2C+TC+%22CompuSyn+for+drug+combinations%3A+PC+software+and+user%E2%80%99s+guide%3A+a+computer+program+for+quantitation+of+synergism+and+antagonism+in+drug+combinations%2C+and+the+determination+of+IC50+and+ED50+and+LD50+values%22">CompuSyn for drug combinations: PC software and user’s guide: a computer program for quantitation of synergism and antagonism in drug combinations, and the determination of IC50 and ED50 and LD50 values</a>. , ComboSyn Inc. Paramus, NJ. (2005).</li>
<li>Alvarez-Rueda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+to+O-acetyl-GD2+ganglioside+and+not+to+GD2+shows+potent+anti-tumor+activity+without+peripheral+nervous+system+cross-reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody to O-acetyl-GD2 ganglioside and not to GD2 shows potent anti-tumor activity without peripheral nervous system cross-reactivity.</a> PLoS One. 6 (9), e25220(2011).</li>
<li>Faraj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma+chemotherapy+can+be+augmented+by+immunotargeting+O-acetyl-GD2+tumor-associated+ganglioside%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma chemotherapy can be augmented by immunotargeting O-acetyl-GD2 tumor-associated ganglioside.</a> Oncoimmunology. 7 (1), e1373232(2017).</li>
<li>Ishikawa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+functional+human+blood+and+immune+systems+in+NOD%2FSCID%2FIL2+receptor+%7Bgamma%7D+chain%28null%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice.</a> Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).</li>
<li>Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+condition+scoring%3A+a+rapid+and+accurate+method+for+assessing+health+status+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice.</a> Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).</li>
<li>Teicher, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+in+vitro+and+in+vivo+synergy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assays for in vitro and in vivo synergy.</a> Methods in Molecular Medicine. 85, 297-321 (2003).</li>
<li>White, D. B., Slocum, H. K., Brun, Y., Wrzosek, C., Greco, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+nonlinear+mixture+response+surface+paradigm+for+the+study+of+synergism%3A+a+three+drug+example%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A new nonlinear mixture response surface paradigm for the study of synergism: a three drug example.</a> Current Drug Metabolism. 4 (5), 399-409 (2003).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Huyck, L., Ampe, C., Van Troys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+XTT+cell+proliferation+assay+applied+to+cell+layers+embedded+in+three-dimensional+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">The XTT cell proliferation assay applied to cell layers embedded in three-dimensional matrix.</a> Assay and Drug Development Technologies. 10 (4), 382-392 (2012).</li>
<li>Thompson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+of+topotecan+in+combination+with+vincristine+for+treatment+of+pediatric+solid+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Synergy of topotecan in combination with vincristine for treatment of pediatric solid tumor xenografts.</a> Clinical Cancer Research. 5 (11), 3617-3631 (1999).</li>
<li>Tan, M., Fang, H. B., Tian, G. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+design+and+sample+size+determination+for+testing+synergism+in+drug+combination+studies+based+on+uniform+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Statistic+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Experimental design and sample size determination for testing synergism in drug combination studies based on uniform measures.</a> Statistic in Medicine. 22 (13), 2091-2100 (2003).</li>
<li>Tang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+EPHB6%2C+EFNB2%2C+and+EFNB3+expressions+in+human+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Implications of EPHB6, EFNB2, and EFNB3 expressions in human neuroblastoma.</a> Proceding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10936-10941 (2000).</li>
<li>Mehta, R. R., Graves, J. M., Hart, G. D., Shilkaitis, A., Das Gupta, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+metastasis+of+human+breast+carcinomas+with+Matrigel+in+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Growth and metastasis of human breast carcinomas with Matrigel in athymic mice.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 25 (1), 65-71 (1993).</li>
<li>Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Matrigel+on+the+tumorigenicity+of+human+breast+and+ovarian+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines.</a> International Journal of Cancer. 67 (6), 816-820 (1996).</li>
<li>Feng, C., Tang, S., Wang, J., Liu, Y., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topotecan+plus+cyclophosphamide+as+maintenance+chemotherapy+for+children+with+high-risk+neuroblastoma+in+complete+remission%3A+short-term+curative+effects+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nan+Fang+Yi+Ke+Da+Xue+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">Topotecan plus cyclophosphamide as maintenance chemotherapy for children with high-risk neuroblastoma in complete remission: short-term curative effects and toxicity.</a> Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 33 (8), 1107-1110 (2013).</li>
<li>Cheung, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglioside+GD2+specific+monoclonal+antibody+3F8%3A+a+phase+I+study+in+patients+with+neuroblastoma+and+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clininical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Ganglioside GD2 specific monoclonal antibody 3F8: a phase I study in patients with neuroblastoma and malignant melanoma.</a> Journal of Clininical Oncology. 5 (9), 1430-1440 (1987).</li>
<li>Nair, A. B., Jacob, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+practice+guide+for+dose+conversion+between+animals+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Clinical+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">A simple practice guide for dose conversion between animals and human.</a> Journal of Basic Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).</li>
<li>Dayde, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+burden+influences+exposure+and+response+to+rituximab%3A+pharmacokinetic-pharmacodynamic+modeling+using+a+syngeneic+bioluminescent+murine+model+expressing+human+CD20%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tumor burden influences exposure and response to rituximab: pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling using a syngeneic bioluminescent murine model expressing human CD20.</a> Blood. 113 (16), 3765-3772 (2009).</li>
<li>Racki, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD-scid+IL2rgamma%28null%29+mouse+model+of+human+skin+transplantation+and+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection.</a> Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).</li>
<li>Sherif, A., Winerdal, M., Winqvist, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Responses+to+Neoadjuvant+Chemotherapy+in+Muscle+Invasive+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Bladder+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immune Responses to Neoadjuvant Chemotherapy in Muscle Invasive Bladder Cancer.</a> Bladder Cancer. 4 (1), 1-7 (2018).</li>
</ol>

S.Fa., J.F. y S.B. se señalan como inventores de pendientes patentes que cubren la aplicación clínica de anticuerpos terapéuticos anti-O-acetil-GD2.

Para predecir el efecto de la interacción con otros medicamentos, pueden utilizarse tres métodos: la metodología de isobologram17, la mezcla no lineal modelo18y la combinación índice1. Análisis de índice de combinación es el más comúnmente utilizado ya que su aplicación se simplifica por la disponibilidad de un programa informático fácil de usar. Para ello, primero hemos caracterizado la respuesta de dosis-efecto de cada agente utilizado solo o en co...

El enfoque convencional en el tratamiento de un gran número de diferentes tipos de cáncer se basaba en monoterapia. Aunque todavía se utiliza en muchos casos, este método reunieron varios obstáculos lleva a optar por terapias combinadas2. Particularmente, las células cancerosas son más susceptibles a desarrollar resistencia cuando se tratan con un solo medicamento por inducir supervivencia alternativos mecanismos3, resultando en fracaso terapéutico de pacientes4. Por otra parte, en monoterapia, medicamentos generalmente son administrados en una dosis alta. Esta situación a menudo resulta en la ocurrencia de fuertes efectos secundarios de dosis dependiente que puede ser intolerable y obligar a los médicos para detener el tratamiento2. Por estas razones, la Asociación de moléculas contra el cáncer ahora es preferido a la monoterapia.
Combinaciones de medicamentos ideal serían las que actúan en sinergia contra células tumorales, sin aumento de la toxicidad contra las células normales. Sinergia se refiere a la interacción de dos o más medicamentos que produce un efecto terapéutico mayor que la suma de cada droga individual actuando por separado. Estas interacciones pueden resultar en mayor eficacia terapéutica clínica2. Límites de la resistencia al tratamiento, aumenta la eficacia y también puede reducir la toxicidad2. De hecho, puede reducirse la dosis de cada medicamento para disminuir sus efectos secundarios apuntando a distintas vías. Además, una de las moléculas también puede servir como un agente de sensibilización contra las células cancerosas. El efecto de la segunda droga puede mejorarse en las células sensibilizadas y menos de la dosis puede ser utilizado5.
La terapia combinada puede incluir dos o más medicamentos quimioterapéuticos o biológicos, como anticuerpos monoclonales6. Estos mAbs apuntar específicamente las células que expresaban un antígeno de superficie de la célula de interés y son capaces de matar células tumorales a través de vías inmunológicas incluyendo la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), con la participación de las células efectoras inmunes 7y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)6. También puede actuar a través de un mecanismo no inmunológico mediado por apoptosis8,9,10,11. En este caso, la inducción del proceso de muerte celular programada puede sensibilizar las células de cáncer, debilitan su función y hacer el fármaco quimioterápico asociado más eficaz en una dosis más baja. Como tal, proapoptotic mAb son buenos candidatos para el diseño de regímenes de combinación con fármacos antineoplásicos.
Se han descrito diferentes modelos matemáticos para evaluar sinergismo de drogas; uno de ellos se basa en la combinación del método de índice1. Este método se basa en el principio de efecto mediano desarrollado por Chou1. La ecuación de la mediana-efecto correlaciona la dosis de droga y el efecto de la droga como sigue.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58291/58291eq1.jpg">
Aquí, D es la dosis de la droga; DM es la dosis mediana-efecto; FA es la fracción afectada por la dosis; m es un exponente que indica la forma de la dosis-efecto parcela1. La dosis mediana de efecto se utiliza para calcular la dosis de Dx de un fármaco que inhibe o mata a "x" por ciento de las células. Luego se calcula el valor de CI para evaluar el efecto aditivo de la combinación de drogas, de la siguiente manera1.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58291/58291eq2.jpg" style="font-size: 14px;">
CI el valor de 1 indica un efecto aditivo y un valor de CI de &lt; 1 indica un efecto sinérgico, mientras que un valor de CI de &gt; 1 indica antagonismo1. La aplicación de este método se facilita aún más la disponibilidad de un programa de computadora, CompuSyn, que determina el sinergismo y el antagonismo en las dosis o los niveles de efecto simularon automáticamente12.
Nuestro grupo ha desarrollado el mAb 8B6 específico del antígeno O-acetil-GD2 para neuroblastoma gangliósido (OAcGD2)13 y otros demostraron que esta mAb es capaz de inducir la muerte celular con atributos de apoptosis11. Para probar si mAb 8B6 puede sensibilizar las células del neuroblastoma en el topotecán agente antineoplásico, adaptamos el método antedicho, desarrollado por Chou1. En primer lugar, determinamos los dosis efectiva 50 (ED50) los valores de mAb 8B6 y topotecán. A continuación, las células de neuroblastoma con equipotente relaciones de los dos compuestos basados en ED50 valores están expuestas para determinar los valores de CI con el software de simulación antes mencionados. Este método nos permite demostrar sinergismo entre mAb 8B6 y topotecan in vitro. A continuación, se describe un protocolo para evaluar aún más la potencia y la seguridad de esta combinación régimen en vivo. Este protocolo se puede aplicar fácilmente para seleccionar combinaciones de agente quimioterapéutico y mAb anticáncer potente y seguro en estudios preclínicos. Una representación esquemática de este estudio se proporciona en la figura 1.

<table><tbody><tr><td>Kit de proliferación celular (MTT)</td><td>Roche</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>CompuSyn software</td><td>ComboSyn</td><td></td><td>Combosyn se puede descargar gratuitamente en http://www.combosyn.com</td></tr><tr><td>Afeitadora eléctrica</td><td>Bioseb</td><td>BIO-1556</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVFF00-01</td><td>10% de suero para terneros fetales inactivado por calor en RPMI 1640</td></tr><tr><td>Firefox&nbsp;</td><td>Mozilla Corporation</td><td></td><td>Firefox se puede descargar de forma gratuita en http://www.mozilla.org/en-US/firefox/</td></tr> <tr><td>Lámpara de calor</td><td>Verre& Quartz</td><td>4003/1R</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular de neuroblastoma humano IMR-5</td><td>Accegen Biotechnology</td><td>ABC-TC0450</td><td>IMR-5 es un clon de la línea celular de neuroblastoma humano IMR32 5459762. Las células IMR-5 fueron generosamente proporcionadas por el Dr. Santos Susin (U.872, París, Francia)</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>2 mM en solución de lisis RPMI 1640</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>mAb 8B6</td><td>Universidad de Nantes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning 354248</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC</td><td>Thermofischer Scientific&nbsp;</td><td>N08625</td><td></td></tr><tr><td>Aguja 21G 1 y frac12; &nbsp;</td><td>Aguja de</td><td>304432</td><td></td>BD Microlance</tr><tr><td>25G 1</td><td>Terumo</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>Ratones NSG</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell Microplacas de 96 pocillos</td><td>Thermofisher</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 0,05% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>PC que funciona Windows 7</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Windows 7 se puede comprar en http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 unidades/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina en RPMI 1640</td></tr><tr><td>Depósito de reactivos</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>8094</td><td></td></tr><tr><td>Protector de roedores</td><td>Bioseb</td><td>TV-150-SM</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 1 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Topotecan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2705</td><td></td></tr></tbody></table>

potenciación de la eficacia del anticuerpo contra el cáncer por fármacos antineoplásicos: detección de anticuerpos-droga sinergia utilizando la ecuación de índice de combinación

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potenciación de la hostiles anticuerpos monoclonales (mAb) por agentes quimioterapéuticos constituye una estrategia valiosa para el diseño de una terapia eficaz y segura contra el cáncer. Aquí proporcionamos un protocolo para identificar una combinación racional en la etapa preclínica. En primer lugar, se describe un ensayo basado en células para evaluar el sinergismo entre mAb contra el cáncer y las drogas citotóxicas, que utiliza la ecuación de índice de combinación de Chou y Talalay1. Esto incluye la medición del tumor celular drogas y anticuerpos-sensibilidad usando un análisis MTT, seguido de un análisis automatizado de la computadora para calcular los valores de índice (CI) de combinación. Valores de CI de < 1 indican sinergismo entre mAbs probado y agentes citotóxicos1. Para corroborar la en vitro resultados en vivo, además se describe un método para evaluar la eficacia del régimen de combinación en un modelo de xenoinjerto tumoral. En este modelo, el régimen combinado retrasa significativamente el crecimiento del tumor, que se traduce en una significativa supervivencia extendida en comparación con controles de agente único. Lo importante es la experimentación en vivo revela que el régimen de combinación es bien tolerado. Este protocolo permite la evaluación eficaz de combinaciones de fármacos contra el cáncer en modelos preclínicos y la identificación de una combinación racional para evaluar en ensayos clínicos.

Los resultados representativos y las figuras se adaptan con el permiso de trabajo anteriormente publicado14.
Anti-OAcGD2 mAb 8B6 aumenta sinérgicamente los efectos inhibitorios de topotecán en crecimiento de línea de células de Neuroblastoma:
Establecer el fármaco y las concentraciones de anticuerpo que se utilizará para la eval...

Este protocolo describe cómo evaluar sinergismo entre un anticuerpo contra el cáncer y fármacos antineoplásicos en modelos preclínicos mediante la ecuación de índice de combinación de Chou y Talalay.

Potenciación de la eficacia del anticuerpo contra el cáncer por fármacos antineoplásicos: detección de anticuerpos-droga sinergia utilizando la ecuación de índice de combinación

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

La inmunoterapia combinada con la quimioterapia representa un enfoque innovador para desarrollar una terapia eficiente en el cáncer. Los principales objetivos son lograr efectos sinérgicos, terapéuticos, reducción de dosis y toxicidad, y minimizar o retrasar la inducción de la resistencia a los medicamentos. Sin embargo, por razones prácticas y éticas, no es posible determinar el sinergismo en los pacientes. Por lo tanto, antes de la combinación directa en ensayos clínicos, se deben llevar a cabo estudios combinados de Prenicaptor, in vitro y/o en animales, para obtener la justificación de los estudios clínicos. Un método robusto simple para la cuantificación del sinergismo entre fármacos se basa en la ecuación de índice de combinación desarrollada por Shouan Talale, como se ilustra en este video. Usando este método, y su simulación computarizada, evidenciamos aquí, el sinergismo entre Monoclonal Anticuerpo 8B6, que es específico para el antígeno del neuroblastoma gangliosido O-acetil-GD2 y el fármaco quimioterático Topotecan en las células del neuroblastoma. Brevemente, después de determinar la dosis efectiva 50 valores de cada compuesto en la IMO humana, 5 línea celulares de neuroblastoma, estas células fueron intubadas con proporciones equitativas de los dos compuestos, y los valores del índice de combinación se calcularon utilizando la simulación por computadora automatizada. A continuación confirmamos estos resultados en Vivo, en un modelo xenograbado de 5 tumores de la OMI. Cultivamos células IMR-5 en un matraz T75, las observamos bajo un microscopio, para comprobar la confluencia celular. Medio de célula asperado del matraz, lavar con 5 ml de PBS. Añadir 3 ml de solución 0.05%EDTA/PBS. Vuelva a colocar el matraz en la incubadora durante 3 minutos. Examine el cultivo celular bajo un microscopio para el desprendimiento celular. Añadir 10 ml de medio celular completo al matraz y transferir la suspensión celular a un tubo cónico estéril de 15 ml. Centrifugar durante cinco minutos a 300 g.Contar células usando un hemocicómetro. Retire y deseche el sobrenadante. Re suspenda las células en el medio de crecimiento completo.Ajuste el volumen medio para obtener la concentración final de 100,000 células/ml.Semilla 84 pozos, placa de cultivo de 96 pozos con 10.000 células cada una, que es 100 microlitros de suspensión celular. Incubar células durante 18 horas en la Incubadora Celular.Diluir anticuerpo monoclonal en 500 microlitros de Complete Growth Medium para obtener una solución de trabajo de anticuerpos con una concentración de anticuerpos monoclonales de 240 micro-gramos por mL.Realizar 5 delirios seriales dobles como se indica en el protocolo. Diluir el fármaco en 500 microlitros de Complete Growth Medium para obtener una solución de trabajo farmacológico con una concentración final de 120 nanomolares. Realice 5 delirios seriales dobles como se indica en el protocolo. Diluir de la misma manera el medicamento más soluciones de anibodies monoclonales. Para llegar a la concentración final, transfiera 50 microlitros de cada solución farmacológica en los pozos correspondientes como se muestra en este diseño experimental. Incubar las células durante 72 horas en la incubadora. Agregue 10 microlitros de solución de reactivo MTT en cada pozo. Incubar a 37 grados centígrados durante 4 horas. Agregue 100 microlitros de solución de lycine a cada pozo utilizando una pipeta multicanal y mezcle bien pipeteando. Incubar a 37 grados centígrados durante 4 horas en una cámara humidificada. Deslícelo a los absorbentes a 570 y 620 nanómetros usando un espectrofotómetro. Calcule la viabilidad de la celda de la siguiente manera. Calcule los valores afectados por la fracción utilizando la siguiente ecuación. Ejecute el software de simulación, haga clic en el nuevo botón de experimento para obtener la ventana principal. Escriba el nombre del experimento. Haga clic en un nuevo medicamento individual. Escriba el nombre. Escriba la abreviatura. Escriba la unidad de concentración de drogas. Introduzca los datos 1 dosis y valor FA. Pulse Intro.Repetir este paso hasta que se introduzcan todos los puntos de datos. Haga clic en Finished.Follow en los mismos pasos para introducir puntos de datos de anticuerpos monoclonales. Haga clic en Nuevo medicamento Combo.Seleccione anticuerpos farmacológicos y monoclonales. Seleccione Ratio constante.Haga clic en Aceptar. Escriba el nombre. Escriba la abreviatura. Escriba la relación de anticuerpos monoclonales del medicamento. Introduzca los datos 1 dosis. Pulse Enter.The programa calculará automáticamente las dosis de Monoclonal Anticuerpo 8B6 y combo. Introduzca el valor de datos 1 FA.Pulse Intro.Repetir este paso hasta que se introduzcan todos los puntos de datos. Haga clic en Finished.Then, haga clic en Generate Report.Select drug and monoclonal antibody y, a continuación, haga clic en OK. Seleccione Combo y, a continuación, haga clic en Aceptar. Seleccione Encabezado, Tabla de CI y Tabla de resumen y, a continuación, haga clic en Aceptar. Escriba el nombre de archivo y el análisis y haga clic en Guardar para generar el informe. El informe se abre automáticamente en el navegador web predeterminado. El informe contiene una sección de tabla de resumen que incluye el título, la fecha, el nombre final, la nota de descripción, los parámetros m, Dm y r, la dosis efectiva 50 para cualquiera de los agentes utilizados como monoterapia o en combinación, y la tabla de índice de combinación para cada combinación a la dosis efectiva 50, 75, 90 y 95.A valor del índice de combinación menor que 1 indica sinergismo. Un valor es igual a uno indica aditividad. Un valor mayor que 1 indica antagonismo. Descongelar la matriz de membrana del sótano durante la noche sumergiendo el vial en hielo en un refrigerador de 4 grados C antes de usarlo. Todo el desgaste del cultivo, o los medios que entran en contacto con la métrica de membrana del sótano deben ser prequillantados. Cosechar la cultura IMR5. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 300 g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante. Lave las células con PBS helado de 15 ml dos veces. Preparar una suspensión celular para 5 millones de células por ml en PBS helada. Transfiera la suspensión celular a un microtubo de 1,5 ml. Vial de matriz de membrana del sótano giratorio. Añadir 1 volumen del reactivo de matriz de membrana del sótano, mezclado por pipeteo para obtener la suspensión celular de 2,5 millones de células por ml.Mantener la suspensión celular sobre hielo. Afeitar el flanco de donde se realizará la inyección. Mezcle las células y extraiga cuidadosamente la suspensión celular en una jeringa de 1 ml montada con una aguja de 21 g. Compruebe que no haya burbujas de aire en la jeringa. Desinfectar el área de inoculación de los ratones con una solución antiséptica. Apriete suavemente la piel del ratón en el flanco entre los dedos en el lugar de la inyección. Inserte la aguja exactamente en el pliegue de la piel. No coloque la aguja profundamente en el tejido para asegurar la inyección subcutánea. Inyectar 100 microlitros de suspensión celular IMR5 por vía subcutánea. Gire la jeringa para evitar que el líquido se propague y retire la aguja. Monitoriza a los ratones para detectar el peso corporal y el crecimiento del tumor. Mida la longitud y la anchura del tumor con un calibre. Calcule el volumen del tumor utilizando esta fórmula. Iniciar la terapia cuando los tumores hayan alcanzado un volumen promedio de 50 a 60 mm

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Investigación

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Investigación del cáncer

Se desarrolló un ensayo en tiempo real de alto rendimiento para identificar simultáneamente (1) antimicrobianos penetrantes en células eucariotas dirigidos a un patógeno bacteriano intracelular, y (2) evaluar la citotoxicidad de las células eucariotas. Posteriormente, se combinó una variación de la misma tecnología con la tecnología de dispensación digital para permitir estudios fáciles, de alta resolución, de dosis-respuesta y de sinergia bidimensional y tridimensional.

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Combinaciones de fármacos sinérgicos son difíciles y lleva mucho tiempo identificar empíricamente. Aquí, describimos un método para identificar y validar sinérgicas pequeñas moléculas.

Alto rendimiento identificación de combinaciones de fármacos sinérgicos por el método de superposición2

En este protocolo, describimos cómo hacer Loewe medidas de interacción de drogas basada en la aditividad pares y combinaciones de tres medicamentos.

Método diagonal a medida sinergia entre cualquier número de medicamentos

Prueba de sinergia antimicrobiana se utiliza para evaluar el efecto de dos o más antibióticos se usan en combinación y se realiza generalmente mediante uno de dos métodos: la matriz de tablero de ajedrez o el ensayo de tiempo de matar. Aquí, presentamos un automatizado, de inyección de tinta impresora-asistida tablero matriz sinergia técnica y un estudio clásico matar tiempo de sinergia.

Sinergia antimicrobiana prueba asistida por la impresora de inyección de tinta matriz tablero automatizado y el método Manual de tiempo de matar

Las pantallas genéticas grandes en organismos modelo han llevado a la identificación de interacciones genéticas negativas. Aquí, describimos un flujo de trabajo de integración de datos utilizando datos de pantallas genéticas en organismos modelo para delinear combinaciones de fármacos dirigidas a interacciones letales sintéticas en el cáncer.

Un flujo de trabajo de integración de datos para identificar combinaciones de fármacos dirigidas a interacciones letales sintéticas

Se desarrolló un sistema de ensayo de alto rendimiento in vitro de alta precisión para evaluar medicamentos contra el cáncer utilizando organoides tumorales (PDO) derivados del paciente, similares a los tejidos cancerosos, pero que no son adecuados para sistemas de ensayo de alto rendimiento in vitro con placas de 96 pocillos y 384 pocillos.

Ensayo in vitro de alto rendimiento utilizando organoides tumorales derivados del paciente

Este protocolo presenta una técnica automatizada de alto rendimiento basada en imágenes para identificar compuestos que modulan la destrucción de células de cáncer de mama mediada por células asesinas naturales en presencia de un anticuerpo terapéutico anti-HER-2.

Ensayo de cribado de alto contenido para la identificación de compuestos modificadores de citotoxicidad celular dependientes de anticuerpos

Aquí, presentamos un método para identificar compuestos que modulan el mecanismo ADCC, un importante mecanismo de destrucción de células cancerosas de anticuerpos antitumorales. El efecto citotóxico de las células NK se mide en esferoides de células de cáncer de mama en presencia de trastuzumab. El análisis de imágenes identifica células asesinas y diana vivas y muertas en esferoides.

Cuantificación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en un modelo de esferoide tumoral: aplicación para el descubrimiento de fármacos

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de citotoxicidad mediada por células (ADCC) dependiente de anticuerpos utilizando un kit de bioensayo ADCC. Este método ofrece una valiosa herramienta para dilucidar el mecanismo ADCC y evaluar el potencial terapéutico de los anticuerpos en la inmunoterapia contra el cáncer.

Evaluación de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos en células cancerosas mediante el bioensayo reportero de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos

Aquí se presenta un procedimiento para implantar células de cáncer de páncreas que expresan proteínas fluorescentes verdes (PANC-1 GFP) ortotópicamente en el páncreas de ratones Balb-c Ola Hsd-Fox1nu para evaluar la progresión tumoral y la metástasis.

Fluorescente modelo de ratón ortotópico de cáncer de páncreas

Aprende a evaluar la sinergia entre anticuerpos antitumorales y fármacos antineoplásicos utilizando la ecuación de índice de combinación de Chou-Talalay en modelos preclínicos. Este protocolo permite cuantificar interacciones sinérgicas para optimizar terapias oncológicas combinadas.

Potenciación de la eficacia del anticuerpo contra el cáncer por fármacos antineoplásicos: detección de anticuerpos-droga sinergia utilizando la ecuación de índice de combinación (Video) | JoVE Journal

Potenciación de la eficacia del anticuerpo contra el cáncer por fármacos antineoplásicos: detección de anticuerpos-droga sinergia utilizando la ecuación de índice de combinación

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