Fabricación de dispositivos emparejados de índice refractivo para microfluidos biomédica

Este método puede ayudar a abordar un desafío importante al combinar la microscopía con la microfluídica al permitir la coincidencia del índice de refracción entre la estructura del microcanal y los medios acuosos dentro del canal. La principal ventaja de esta técnica es que es compatible con los métodos de fabricación comúnmente utilizados para crear dispositivos microfluídicos. Otra ventaja clave de nuestro enfoque es el método utilizado para sellar microcanales hechos de materiales con baja adherencia, que es un problema común entre los polímeros de índice de refracción de pozo.

La demostración visual de este método es crucial, ya que los pasos para sellar el canal pueden ser difíciles de hacer correctamente. Por ejemplo, es importante que los depósitos no estén obstruidos durante la sujeción. Comience este procedimiento con la fabricación de polidimetilsiloxano, o PDMS, negativo, como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, rellene el negativo PDMS con 400 microlitros de MY-133-V-2000. El negativo debe estar ligeramente sobrellenado. Coloque el negativo PDMS relleno MY-133-V-2000 en la cámara de vacío durante dos horas para eliminar las burbujas.

Después de retirar el MY-133-V-2000 de la cámara de vacío, presione un portaobjetos de vidrio contra la parte superior del negativo ligeramente sobrellenado para crear una superficie plana de MY-133-V-2000 y evitar que el oxígeno inhiba la polimerización. A continuación, inserte el MY-133-V-2000 en un horno UV de 400 vatios. Ajuste la radiación UV al 50% de la intensidad máxima durante 300 segundos para curar el microcanal.

Se trata de una potencia aproximada de 4,5 julios por centímetro cuadrado, aproximadamente el doble de la potencia de curado mínima recomendada por el fabricante. Después de cortar el acrílico como se describe en el protocolo de texto, coloque dos gotas pequeñas en el borde del acrílico y luego use una herramienta desechable para esparcir uniformemente el pegamento. Coloque el sustrato de vidrio sobre el acrílico y deje que el pegamento se seque usando el peso del vidrio para mantenerlo en su lugar.

Cubra el vidrio expuesto con 100 microlitros de PDMS utilizando una pipeta de desplazamiento positivo. Luego, inserte la capa base en un recubridor giratorio al vacío para cubrir uniformemente el vidrio con una película PDMS de aproximadamente 10 micrómetros de espesor usando una velocidad de 1500 RPM durante dos minutos. Retire la capa base del recubridor giratorio y limpie con cuidado cualquier exceso de PDMS que recubrió el acrílico con acetona y toalla de papel.

Tenga cuidado de no alterar el PDMS sin curar. Ahora, hornee la capa base con el PDMS en un horno a 65 grados centígrados durante dos horas para curar el PDMS. Pipetee un mililitro de PDMS en un portaobjetos de vidrio y luego use otro portaobjetos de vidrio para esparcir uniformemente el PDMS hasta que comience a supurar por los lados.

Cura esto en una placa caliente a 150 grados centígrados durante 10 minutos. Corte el PDMS curado en un rectángulo con las mismas dimensiones que el dispositivo MY-133-V-2000. Luego, usando la capa intermedia del acrílico como molde, perfore agujeros para el depósito y corte una ventana de visualización cuadrada en el PDMS para hacer la junta del PDMS.

Ahora, retire el MY-133-V-2000 curado del horno UV y retire el canal del negativo y colóquelo sobre un sustrato plano con el lado del canal hacia arriba. Retire la capa base que contiene el PDMS curado del horno a 65 grados y colóquela sobre el sustrato. A continuación, coloque el sustrato con el canal MY-133-V-2000 y la capa base en el limpiador de plasma de oxígeno.

Ajuste la presión de vacío a 200 militorr y el nivel de radiofrecuencia a alto. Proceda a tratar la superficie del canal y el sustrato de vidrio durante 30 segundos. El plasma de oxígeno debe iluminarse en azul cuando se enciende el limpiador de plasma.

Después de 30 segundos, retire tanto el microcanal como la capa base del limpiador de plasma. Con unas pinzas, coloque inmediatamente el MY-133-V-2000 con el canal hacia abajo en el recorte rectangular de la capa base de acrílico, de modo que entre en contacto con el PDMS. Ahora, coloque la junta PDMS en la parte superior del dispositivo MY-133-V-2000, alineando los orificios de la junta con los depósitos del dispositivo.

El uso de esta junta PDMS es crucial porque el PDMS es más elástico que el MY-133-V-2000 y, por lo tanto, se puede comprimir más. Esto permite que la fuerza se transfiera del acrílico al microcanal sin romper el vidrio. En este punto, coloque el dispositivo sin terminar en una plataforma elevada sobre el banco para proporcionar una superficie de sujeción para el ensamblaje del dispositivo.

Luego, extraiga tres mililitros de cemento acrílico con una jeringa. Distribuya suficiente cemento acrílico sobre la capa base para proporcionar una capa delgada. Haz que el pelaje sea lo más uniforme posible y no dejes que el material se filtre en el canal.

Ahora, coloca la pieza acrílica de la capa intermedia encima del acrílico de la capa base. Asegúrese de que los orificios estén alineados con los depósitos del canal MY-133-V-2000. Sujeta la capa intermedia a la capa base lo más fuerte posible y sujétala durante dos minutos mientras el cemento se endurece para unir las piezas de acrílico.

Asegúrese de que los depósitos no estén obstruidos durante este paso para evitar que el aire quede atrapado debajo del dispositivo MY-133-V-2000. El aire atrapado entre el MY-133-V-2000 y el sustrato permanecerá atrapado si los depósitos están obstruidos. Esto causará fugas en el dispositivo terminado.

Por lo tanto, es fundamental que los orificios no se obstruyan durante este paso. Después de que el cemento se endurezca, elimine la presión del dispositivo. Coloque el cemento acrílico en la capa intermedia en los lugares de contacto anticipado con la capa superior del acrílico.

Ahora, coloque la capa superior del acrílico en la pieza de la capa intermedia del acrílico, asegurándose de que los agujeros estén alineados con los depósitos. Déjalo reposar en el banco durante dos minutos mientras se seca el cemento acrílico. Pruebe el dispositivo MY-133-V-2000 agregando 10 microlitros de colorante alimentario o agua desionizada en uno de los orificios del depósito para probar la adherencia y el flujo.

Inserte un tubo en el depósito opuesto y conecte el otro extremo a una trampa de vacío. Encienda la aspiradora para tirar del tinte o el agua a través del canal para asegurarse de que se haya creado un dispositivo exitoso. Revise bajo un microscopio para verificar que no haya fugas en el canal o depósito.

Con la aspiradora, retira el tinte de ambos depósitos. Luego, enjuague los depósitos con etanol. Coloque el etanol en un depósito.

Tire del etanol a través de la aspiradora. Deje que el etanol se asiente a temperatura ambiente durante 10 minutos. Rocíe el canal a fondo con etanol y colóquelo en un plato de poliestireno estéril.

Envuélvalo bien con Parafilm y guárdelo hasta que lo necesite. El mapa de calor que se muestra aquí representa la masa de las células MCF-7 adherentes a FOD en un microcanal. Pocos artefactos son visibles cerca de las paredes del microcanal.

En esta medición, se puede ver una sola célula MCF-7 diferente en el borde del microcanal junto a la pared. La falta de artefactos cerca de la pared permite obtener mediciones cuantitativas precisas, incluso cuando las células están muy cerca de la pared del canal. Esta última figura muestra un par de células MCF-7 situadas cerca de la pared del microcanal.

La masa de estas células en cada píxel se puede medir con precisión mediante microscopía de fase cuantitativa. Al seguir este protocolo, es importante no obstruir los depósitos al sujetar el dispositivo mientras se seca el cemento acrílico. La obstrucción de los orificios atrapa el aire entre el MY-133-V-2000 y el sustrato.

Esto causará fugas en el canal durante el flujo. El uso de MY-133-V-2000 como material de fabricación para dispositivos microfluídicos proporciona una ventaja distintiva sobre los materiales tradicionales al reducir en gran medida los artefactos cerca de las paredes de los microcanales. Esto permite realizar mediciones cuantitativas muy cerca de las estructuras de los microcanales.

Los dispositivos fabricados con este protocolo son compatibles con cualquier técnica de microscopía comúnmente utilizada. Este protocolo se basa en la patología celular, por lo que es compatible con otras técnicas microfluídicas avanzadas, como los clasificadores de células o los generadores de gradientes, para estudiar el comportamiento celular. En general, esta técnica dota a los investigadores de una nueva herramienta para los ensayos microfluídicos biomédicos basados en la microscopía.

La precisión adicional que otorga a las mediciones cuantitativas en microcanales tiene aplicaciones importantes en muchos campos, incluido el descubrimiento de fármacos y el análisis de células individuales.