Name: TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprende el protocolo tChIP-Seq para analizar modificaciones epigenéticas específicas de neuronas en ratón. Este método permite aislar cromatina de células objetivo y estudiar patrones de histonas con alta especificidad celular.

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Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Iwasaki para lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (26113005 # S.N. y JP17H05679 a S.I.); subvenciones para jóvenes científicos (A) (JP17H04998 a S.I.) del Ministerio de educación, ciencia, deportes y cultura de Japón (MEXT); y la pionera proyectos "Evolución celular" y todos los proyectos RIKEN "Enfermedad y epigenoma" de RIKEN (a MATR y S.I.).

Todos los métodos descritos han sido aprobados por la división de seguridad de RIKEN (H27-EP071) y llevado a cabo con reglamentos y directrices pertinentes.
1. disección del tejido
<ol><li>Disecar los tejidos de interés en pequeños pedazos (aproximadamente < 3 mm2) con unas tijeras finas primavera. Nota: Fragmentos de tejidos más grandes tardan más tiempo en congelarse, y piezas más pequeñas se transportan a mayores volúmenes de buffer, que pueden afectar los resultados.</li>
	<li>Añadir los fragmentos de tejido disecado a un recipiente limpio llenado de nitrógeno líquido y recogerlas en tubos con 2 mL (1 pieza por tubo) lleno de nitrógeno líquido. Nota: Los tubos con una superficie hidrofílica se recomiendan para este paso.</li>
	<li>Colocar los tubos a-80 º C durante > 5 min con la tapa abierta para evaporar nitrógeno líquido restante. Nota: Después de cerrar la tapa, fragmentos de tejido pueden almacenarse a-80 ° C durante un mes antes de su uso.</li>
</ol>2. fijación de la célula
Nota: Para este paso utilizamos un práctico molino criogénico. Puede utilizarse un aparato alternativo.
<ol><li>Lugar los 2 mL-proteínas baja de Unión tubos con las muestras de tejido en un estante del hielo de metal enfriada en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Coloque una bala de metal en un 1,5 mL-tubo y frío con nitrógeno líquido. Coloque en el estante del hielo de metal.</li>
	<li>Abrir el tubo de 2 mL y colocar la bala metal prechilled en el tubo. Cierre la tapa, coloque los tubos de 2 mL en el sostenedor del tubo de un práctico molino criogénico e inmediatamente sumerja el soporte del tubo montado en nitrógeno líquido durante 1 minuto.</li>
	<li>Inserte el soporte de tubo congelado en el casete externo del práctico molino criogénico y agite vigorosamente 60 veces durante 30 s.</li>
	<li>Desmontar el soporte del tubo, quitar la bala de metal y prechilled mL tubo lugar el 2 en una muestra de refrigerador a-20 ° C.</li>
	<li>Coloque la muestra en frío a-20 ° C por 15 min evitar la congelación de fijador en el paso siguiente.</li>
	<li>Traer la muestra más fresca en el Banco, abra la tapa del tubo y goteo inmediatamente 900 μl de formaldehído al 1% en él. Después de haber efectuado varias veces, transfiera la suspensión a nuevo 2 mL tubo con 900 μl de formaldehído al 1% y solución para 10 min. con rotación suave en una incubadora a 23 º C. PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y nocivo.</li>
	<li>Para detener la reacción de fijación, añada 100 μl de glicina de 2,5 M a cada tubo y centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 1 mL de helado salina tamponada con fosfato (PBS), centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Repita este paso dos veces (3 lavados en total). Nota: Muestras fijadas pueden ser flash-congelado por nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C.</li>
	<li>Agregar 500 μl de tampón de lisis 1 (ácido de-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido 50 mM 4 (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM etilendiaminotetracético ácido (EDTA) (pH 8.0), w/v glicerol al de 10%, 0.5% w/v NP-40, inhibidor de la proteasa de 0.25% w/v Triton X-100 y 0.1 x cóctel) para la pelotilla, pipeta varias veces y rotar durante 10 min a 4 ° C. Nota: Tampón de lisis 1 debe ser filtrada y almacenada a 4 ° C antes de usar.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tampón de lisis 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA y 0.1 x inhibidor de la proteasa cóctel) para la pelotilla, vortex y rotar durante 10 min a 4 ° C. Nota: Tampón de lisis 2 debe ser filtrada y almacenada a 4 ° C antes de usar.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 800 μl de tampón de ensayo (RIPA) radioinmunoprecipitación con inhibidor de la proteasa de la 1 x cóctel a la pastilla y resuspender el precipitado mediante pipeteo.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 500 μl de tampón RIPA con 1 inhibidor de proteasa x cóctel.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tampón RIPA con 1 inhibidor de proteasa x cóctel. Proceder inmediatamente al siguiente paso.</li>
</ol>3. cromatina de corte
<ol><li>Transferir el lisado a un tubo del sonicador y coloque el tubo en un ultrasonicador.</li>
	<li>Distorsionar la cromatina con los siguientes valores: temperatura: 4 ° C; energía incidente máxima: 175 W; factor de servicio: 10%; ciclos/ráfaga: 200; y tiempo: 2.400 s.</li>
	<li>Transferir la muestra a un 1,5 mL-proteína vinculante bajo tubo y centrifugar durante 5 min a 20.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo de unión baja de proteína. Nota: La muestra puede ser flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenada a-80 ° C.</li>
</ol>4. cheque de calidad de ADN (reticulación inversa)
<ol><li>Mezcla 20 μl del lisado y 180 μl de tampón de elución de ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM de NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) y 1% w/v sodio dodecil sulfato (SDS)) en un tubo de reacción en cadena (PCR) polimerasa. Incubar la muestra a 65 ° C en un termociclador durante 6 h con la tapa de Termociclador abierta. Mantenga la tapa del termociclador abierto para evitar excesiva desnaturalización. Nota: El tampón de elución de ChIP debe ser filtrado y almacenado a temperatura ambiente antes de usar. Esta incubación puede extenderse para toda la noche.</li>
	<li>Añadir 1 μl de 10 mg/mL Rnasa, vortex e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
	<li>Añadir 6,5 μl de 15 mg/mL proteinasa K, vortex e incubar a 55 ° C durante 60 minutos.</li>
	<li>Transferencia de la reacción a un tubo de unión baja de ADN, añadir 4 μL de glucógeno de 5 mg/mL y agitar. Luego, añada 200 μL de fenol/cloroformo/isoamyl alcohol (25:24:1) y centrifugar durante 5 min a 18.000 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de baja obligatoria de ADN. Agregar 200 μL de tampón Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8.0) y 200 mM NaCl) a la solución de fenol/cloroformo/isoamyl alcohol restante y centrifugar durante 5 min a 18.000 x g a temperatura ambiente. Recoger el sobrenadante y mezclar con el sobrenadante de la primera.</li>
	<li>Agregar 900 μl de etanol helada e incubar 1 h a-20 ° C. Nota: La incubación puede prolongarse hasta 4 - 6 h.</li>
	<li>Centrifugar por 30 min a 18.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante. Añadir 1 mL de etanol 75% helada a la pelotilla y centrifugar por 30 min a 18.000 x g a 4 ° C. Repita este paso (dos lavados en total).</li>
	<li>Descartar cuidadosamente el sobrenadante y secar al aire durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Agregar 50 μl de tampón Tris-EDTA (TE) y disolver el ADN por incubar a temperatura ambiente durante 30 min o a 4 ° C durante la noche. Evite un vórtex o pipeteando. Mantenga este ADN como "entrada" y utilizar para la preparación de la biblioteca, si es necesario.</li>
	<li>Medir la concentración de ADN con un fluorómetro según las instrucciones del fabricante (véase tabla de materiales) y la distribución de tamaño con un equipo de electroforesis de microfluidos (ver datos representativos se muestra en la figura de 2A). uso 10 ng o menos ADN para este ensayo. Nota: Fragmentos de 100 a 500 pares de bases (bp) deben ser 50% o más de la DNA.</li>
</ol>5. purificación de afinidad por los anticuerpos de anti-FLAG
Nota: Para la neurona tChIP-Seq, los tejidos del cerebro de 8 ratones se utilizan típicamente para una muestra de tChIP-Seq para preparar 2 ng de DNA purificado por tándem inmune-purificación (ver paso 7.1). En nuestras manos, 0,1 ng de DNA todavía proporcionado alta calidad bibliotecas de ADN para ChIP-Seq (peores, inédito). Así, en teoría, un ratón puede ser suficiente para llevar a cabo la neurona tChIP-SS. La cantidad necesaria debe ser optimizada para el tipo de tejidos y células de interés. Para el control negativo del experimento de imumuno-purificación, lisado de ratones sin ninguna expresión de H2B-bandera de tejido cerebral debe ser preparado y utilizado.
<ol><li>Pipetee 200 μL de las bolas magnéticas conjugado con inmunoglobulinas de anti-ratón ovejas G (IgG) en un tubo de unión baja a proteínas.</li>
	<li>Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere 1 minuto para el sobrenadante a quedado claro. Eliminar el sobrenadante, agregar 1 mL de PBS helado y vortex. Repita este paso (dos lavados en total).</li>
	<li>Añadir 20 μl del anticuerpo de anti-FLAG 1 mg/mL y rotarla durante 5 h a 4 ° C. Nota: Esta incubación puede extenderse para toda la noche.</li>
	<li>Lavar los granos tras paso 5.2. Coloque los granos en un tubo de 15 mL.</li>
	<li>Resuspender los granos en 1110 μl de tampón de RIPA y luego agregar 900 μl de 10 x bloqueo reactivo 180 μl de 50 x solución de Denhardt, 10 μl de 100 x inhibidor de la proteasa cóctel y 6,8 mL de lisado elaborado en el paso 3. Dividir esta mezcla en 5 tubos de unión baja de proteína. Gire durante 6 h a 4 ° C. Nota: Esta incubación puede extenderse para toda la noche.</li>
	<li>Coloque el tubo en el soporte magnético y espere 1 minuto para el sobrenadante a quedado claro. Eliminar el sobrenadante, agregar 1 mL de tampón RIPA y mezclar suavemente. Repita este paso 5 veces (6 lavados en total). Piscina, todos los granos en un tubo de unión baja proteína sola.</li>
	<li>Añadir 200 μL de tampón de elución de ChIP y gire durante 15 min a temperatura ambiente. Comprobar la calidad del ADN como se describe en el paso 4.11 (ver datos representativos que se muestra en la figura 2B y C). Proceder inmediatamente al siguiente paso.</li>
</ol>6. afinidad purificación por anticuerpos Anti-H3K4me3 y reticulación inversa
Nota: El siguiente grano preparación que pasos (6.1-6.4) deben realizarse antes de paso 5.7.
<ol><li>Pipeta de 40 μl de bolas magnéticas conjugado anti-ratón ovejas IgG en un tubo de 2 mL-proteínas de unión baja.</li>
	<li>Coloque el tubo en el soporte magnético y espere 1 minuto para el sobrenadante a quedado claro. Eliminar el sobrenadante, agregar 1 mL de PBS helado y mezclar suavemente. Repita este paso (dos lavados en total).</li>
	<li>Añadir 4 μL del anticuerpo anti-H3K4me3 de 1 mg/mL y rotarla durante 6 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar los granos tras paso 6.2. Coloque los granos en un tubo de 2 mL-proteínas de unión baja.</li>
	<li>Suspender los granos en 1558 μl de tampón de RIPA y luego añadir 200 μL de 10 x bloqueo reactivo, 40 μl de 50 x solución de Denhardt, 2 μl de 100 x inhibidor de la proteasa cóctel y 200 μL de eluido en paso 5.7. Gire durante la noche a 4 ° C. Nota: El SDS en el tampón de elución de la viruta se diluyó más de 10 veces en la incubación.</li>
	<li>Coloque el tubo en el soporte magnético y espere 1 minuto para el sobrenadante a quedado claro. Eliminar el sobrenadante, agregar 1 mL de tampón RIPA y mezclar suavemente. Repetir este paso 4 veces (5 lavados en total). Después del último lavado, transferencia de los granos en un tubo de unión baja de ADN y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 200 μL de tampón de elución de ChIP y gire durante 15 min a temperatura ambiente. Transferir el efluente a un nuevo bindingTube baja de la DNA. Nota: El efluente puede ser almacenado a-80 ° C.</li>
	<li>Siga el paso 4 para decrosslinking de la DNA. Resuspender el DNA purificado en 20 μl de tampón TE.</li>
	<li>Comprobar la calidad del ADN como se describe en el paso 4.11 (ver datos representativos que se muestra en la Figura 2D). (opcional) Realizar análisis de enriquecimiento por PCR cuantitativa como se describió anteriormente2. Diez veces o mayor enriquecimiento debe ser observado.</li>
</ol>7. Biblioteca construcción
<ol><li>Para cada entrada y ChIP DNA muestra, calcular la proporción de DNA en la región de 100-500-bp usando la función de análisis del borrón de transferencia del software de la máquina de electroforesis de microfluidos. Estimar el volumen de muestra requerido para obtener 2 ng de 100 – 500 bp DNA. Utilice 20 ng de ADN en el rango de 100 – 500-bp como muestra "entrada".</li>
	<li>Pipetear las muestras de ADN en tiras de 8 tubos PCR y agregar H2O para llevar el volumen total a 10 μl. (opcional) si el volumen de ADN excede 10 μl, escalado proporcionalmente la siguiente reacción de reparación final y la selección de tamaño.</li>
	<li>Preparar mezcla master final-reparación (véase Tabla de materiales). Añadir 4 μL de la mezcla principal final de reparación del ADN e incubar 30 min a 20 ° C.</li>
	<li>Añadir 36 μl de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 y 0,6 x volumen (30 μL) del sólido fase granos magnéticos inmovilización reversible (SPRI) e incube durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere hasta que el sobrenadante sea claro.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, añadir 1,2 volúmenes de x (60 μL) de granos magnéticos de SPRI e incubar 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere hasta que el sobrenadante sea claro.</li>
	<li>Lavar los granos dos veces con 200 μL de 80% EtOH, sujetando el tubo en el imán.</li>
	<li>Centrifugar brevemente el tubo para recoger el EtOH residual en la parte inferior y coloque en el imán. Extraiga cuidadosamente el EtOH residual.</li>
	<li>Deje la tapa de tubo abierta durante 1-2 minutos permitir que el EtOH se evapore.</li>
	<li>Cierre la tapa y mantenga el tubo en hielo. Nota: Ahora han obtenido ADN seleccionado de tamaño de 100-500 bp en los granos. Pueden encontrar más detalles acerca de la selección de tamaño doble en la web del fabricante (www.beckman.com).</li>
	<li>Preparar A tizón master mix (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Resuspender los granos (de paso 7.10) con 10 μl de la mezcla principal A tizón e incubar 30 min a 30 ° C.</li>
	<li>Añadir volumen x 1.8 (18 μL) de polietilenglicol (PEG) / solución de NaCl e incubar 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Siga los pasos 7.7-7.11 para purificar el DNA.</li>
	<li>Preparar mezcla de tampón de ligadura (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Pipeta 8 μl de mezcla de tampón de ligadura en los granos (de paso 7.14), añadir 1 μl de adaptador de 1 μm y suspender las cuentas. Use 1 μl de adaptador μm 5 para la muestra de entrada. Considere el uso de adaptadores diferentes para cada muestra de multiplexación.</li>
	<li>Añadir 1 μl de ADN ligasa e incubar por 15 min a 20 ° C.</li>
	<li>Añadir 1,0 x volumen (10 μl) de solución de PEG/NaCl, suspender los granos e incubar 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Siga los pasos 7.7 7.10 para purificar el DNA.</li>
	<li>Pipetear 25 μl de 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 en el tubo y resuspender los granos.</li>
	<li>Añadir 1,0 x volumen (25 μl) de solución de PEG/NaCl e incubar 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Siga los pasos 7.7 7.10 para purificar el DNA.</li>
	<li>Pipeta de 11 μl de 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 en el tubo y resuspender los granos.</li>
	<li>Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere hasta que el sobrenadante sea claro.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante en un tubo PCR de nuevo 8-tira.</li>
	<li>Preparar la mezcla principal de PCR en tiempo real (ver materiales para más detalles).</li>
	<li>Pipetee 8,5 μl de mezcla principal en tiempo real de PCR en una placa PCR (qPCR) 384-bien cuantitativa y añadir 1,5 μl del adaptador ligarse DNA (de paso 7,26).</li>
	<li>Pipetear 10 μl de cada norma fluorescente en los pocillos vacíos.</li>
	<li>Realizar PCR en tiempo real con el siguiente programa: (98 ° C por 45 s) x 1 ciclo, (98 ° C por 15 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C por 30 s) x 20 ciclos, y (72 ° C durante 60 s) x 1 ciclo.</li>
	<li>Determinar el número de ciclos PCR necesarios para alcanzar la intensidad de fluorescencia de los fluorescentes estándar 2.</li>
	<li>Preparar al maestro de la PCR (véase Tabla de materiales) de la mezcla.</li>
	<li>Pipetee 11.5 μl de la mezcla principal de PCR en el restante ADN ligada adaptador (de paso 7,26) y realizar la PCR como se indica en el paso de las 7: 30 con los ciclos PCR en paso 7.31.</li>
	<li>Añadir 1,0 x volumen (20 μl) de solución de PEG/NaCl e incubar 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Siga los pasos 7.7 7.10 para purificar el DNA.</li>
	<li>Pipetear 20 μl de 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 en el tubo y resuspender los granos.</li>
	<li>Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere hasta que el sobrenadante sea claro.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante en un tubo de 1,5 mL-DNA obligatorio bajo nuevo.</li>
	<li>Compruebe la calidad de la biblioteca como se describe en el paso 4.11 (ver datos representativos que se muestra en la Figura 2E y F). Use 1 μl de la muestra de ADN de la biblioteca. (opcional) Realizar análisis de enriquecimiento por qPCR como se describió anteriormente 2. Diez veces o mayor enriquecimiento debe ser observado.</li>
</ol>8. la secuencia
<ol><li>Las bibliotecas en un secuenciador de última generación de la secuencia (ver datos representativos se muestra en la figura 3). Nota: La profundidad de secuencia suficiente para el análisis de datos variará dependiendo del tamaño del genoma del organismo3. Para el ser humano y ratón, se recomienda obtener al menos 20 millones de solo-fin Lee. Según la producción de Lee, multiplexación puede ser rentable.</li>
</ol>

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<li>Kadota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+binding+landscape+in+jawless+fish+with+reference+to+Hox+cluster+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestro protocolo se ha optimizado para las neuronas del cerebro de ratón, en el que la expresión de tagged bandera H2B es inducida por inyección de tamoxifeno. Promotores para expresión H2B, partida materiales de tejido y la cantidad de los tejidos son parámetros fundamentales para éxito tChIP-SS. Por lo tanto, la optimización de estos factores debe considerarse para cada tipo de célula de interés.
Un paso fundamental entre los procedimientos utilizados en el presente Protocolo es el ADN de c...

Los tejidos de los animales consisten en tipos de células diferentes. La regulación del gene en cada célula define el tipo de célula. Modificaciones de la cromatina - ADN metilación e histona modificación - ser la base de la especificidad del tipo de la célula de la expresión génica. Así, la medición de la regulación epigenética en cada tipo de célula ha sido deseada, pero ha sido un desafío técnico.
Para investigar la epigenética en un tipo de célula particular, la secuencia de inmunoprecipitación de cromatina tándem (tChIP-Seq) fue recientemente desarrollado ()figura 1)1. En tChIP, proteína núcleo etiquetado del epítopo de histona H2B se expresa de un promotor de la célula-tipo-específico. Esta característica permite el aislamiento del chromatins de las células de interés, aunque el material comienza a partir de una mezcla de diversos tipos celulares. Siguiente ChIP-Seq, purificación de la cromatina a través de una marca de histonas modificadas y secuenciación profunda generación de aislado ADN, podemos monitorear el estado epigenético del tipo objetivo de la célula en forma de todo el genoma.
Usando esta técnica, hemos investigado recientemente la trimetilación de neurona-específica de la histona H3 proteína en lisina 4 (H3K4me3) marcas. En ese estudio, desarrollamos un ratón knock-in en que C-terminal H2B tagged bandera proteína se expresó sobre recombinación mediada por la Cre (Rosa26CAG floxed pA H2B-bandera). Por cruce con un ratón que poseen el gen Cre-endoplasmic del endoplásmico (ER) bajo el control del promotor CamK2a, la línea de ratón obtenidos induce H2B-bandera en neuronas activas sobre tamoxifeno inyección (Camk2aH2B-bandera)1. A partir de cerebro de la línea de ratón establecido, realizamos tChIP-Seq con anticuerpo anti-H3K4me3. Desde marcas H3K4me3 corresponden a menudo a regiones promotoras, podríamos descubrir cientos de mRNAs expresado específicamente en las neuronas1.
Aquí, describimos un método típico tChIP-Seq que cubre los pasos de la disección del tejido a la construcción de la biblioteca ()figura 1). El objetivo final de este protocolo es compartir nuestras mejores prácticas para la ejecución de tChIP-Seq y la futura aplicación de este método a otros tipos celulares y modificaciones de las histonas.

<table><tbody><tr><td>Tubo LoBind de proteínas, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108132</td><td>Para lisis celular</td></tr><tr><td>Tubo LoBind de proteínas, 1,5 mL</td><td>Nº Eppendorf</td><td> 0030108116</td><td>Para ChIP y preparación de bibliotecas</td></tr><tr><td>Tubo LoBind de ADN, 1,5 mL</td><td>Nº Eppendorf</td>&<td>nbsp; 0030108051</td><td>Para ChIP y preparación</td></tr><tr><td>de bibliotecas Tubo de PCR de 8 tiras</td><td>BIO-BIK</td><td>3247-00</td><td>Para ChIP y preparación de bibliotecas</td></tr><tr><td>SK Mill</td><td>TOKKEN</td><td>SK-200</td><td>Práctico molinillo criogénico para hacer polvo de células para la fijación</td></tr><tr><td>Bala de metal</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-DLC10</td><td>Accesorio de SK Mill</td></tr><tr><td>Tubo de acero inoxidable de 2 mL</td><td>TOKKEN</td><td>TK-AM5-SUS</td><td>Una opción para la célula lisis</td></tr><tr><td>2 mL soporte de tubo de acero inoxidable</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-TL</td><td>Una opción para la lisis celular</td></tr><tr><td>16% formaldehído (p/v), sin metanol</td><td>Pierce</td><td>28906</td><td>Para fijar células. Prepare la solución al 1% antes de usar.</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-35</td><td>Preparar 2,5 M de stock</td></tr><tr><td>D-PBS (-)(1x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td>Para el lavado de lisado y ADN purificado</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02443-05</td><td>Para tampón de lisis 1. Preparar 1 M, pH 7,5 caldo.</td></tr><tr><td>5 M NaCl, grado de biología molecular</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06900-14</td><td>para tampón de lisis 1, tampón de lisis 2, tampón de elución ChIP y tampón Tris-EDTA-NaCl</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, grado de biología molecular</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>311-90075</td><td>Para tampón de lisis 1, tampón de lisis 2, tampón de elución ChIP y tampón Tris-EDTA-NaCl</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>072-04945</td><td>Para tampón de lisis 1</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25223-75</td><td>Para tampón de lisis 1</td></tr><tr><td>Triton X-100, grado de biología molecular</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-32</td><td>Para tampón de lisis 1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-91</td><td>Para tampón de lisis 2, tampón de elución ChIP y tampón Tris-EDTA-NaCl. Prepare caldo de 1 M, pH 8.0.</td></tr><tr><td>0.1 M EGTA pH neutro</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08947-35</td><td>Para tampón de lisis 2</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa (100x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25955-24</td><td>Para bloquear la degradación de proteínas</td></tr><tr><td>Tampón RIPA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td>Para lisis celular y lavado</td></tr><tr><td>milliTUBE 1 mL AFA Fiber</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td>Tubo sonicador. Accesorio de ultrasonido enfocado</td></tr><tr><td>ultrasonido enfocado</td><td>Covaris</td><td>S220 o E220</td><td>Para digerir el ADN en el tamaño adecuado para ChIP-Seq</td></tr><tr><td>UltraPure 10% SDS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15553-027</td><td>para ChIP Tampón de elución</td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30141-14</td><td>Para purificar el ADN del lisado</td></tr><tr><td>Proteinasa K, recombinante, Grado PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115887001</td><td>Para purificar el ADN del etanol lisado</td></tr><tr><td></td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>054-07225</td><td>Hacer una solución al 70%</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 producido en ratón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Para purificar la cromatina expresada en células de interés</td></tr><tr><td>Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11201D</td><td>Esto se puede utilizar para anti-FLAG IP y anti-H3K4me3 IP</td></tr><tr><td>Anti-tri-metilhistona H3 (K4), anticuerpo monoclonal de ratón</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>301-34811</td><td>Cualquier otro anticuerpo que funcione para el análisis de ChIP funcionará</td></tr><tr><td>10x Reactivo de bloqueo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>11096176001 Para el bloqueo durante la purificación por afinidad</td></tr><tr><td>Denhardt' s solución</td><td>Nacalai Tesque</td><td>10727-74</td><td>Para el bloqueo durante la purificación por afinidad</td></tr><tr><td>Glucógeno (5 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td>Para purificar ADN a partir de lisado</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorímetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td>Para la cuantificación de ADN aislado</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>Para la cuantificación de ADN aislado</td></tr><tr><td>Tubo de 0,5 mL</td><td>Axygen</td><td>10011-830</td><td>Para cuantificación por Qubit</td></tr><tr><td>Fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25970-56</td><td>Para purificar el ADN del lisado</td></tr><tr><td>Cuentas AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>SPRI perlas magnéticas para la preparación de bibliotecas</td></tr><tr><td>Cubitera metálica</td><td>Funakoshi</td><td>IR-1</td><td>Para mantener congelado el lisado celular</td></tr><tr><td>Enfriador</td><td>de muestras New England Biolabs</td><td>T7771S</td><td>Ayuda a reparar las células con un daño mínimo</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>Para comprobar la calidad de los fragmentos de ADN aislados. Se puede utilizar otro analizador de fragmentos.</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100 Expert Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2946CA</td><td>suministra con el kit de</td></tr><tr><td>ADN de alta sensibilidad</td> Bioanalyzer <td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Para comprobar la calidad de los fragmentos de ADN aislados</td></tr><tr><td>KAPA LTP Library Preparation Kit</td><td></td> Roche <td>07961898001</td><td>Se suministra con 10 tampones de reparación de extremos KAPA, mezcla de enzimas de reparación de extremos KAPA, tampón de cola A de KAPA, enzima de cola KAPA, tampón de ligadura de KAPA, ligasa de ADN KAPA y solución de PEG / NaCl</td></tr><tr><td>Códigos de barras de ADN NEXTflex Adaptador</td><td>BIOO Scientific</td><td>NOVA-514101</td><td>para la preparación de bibliotecas. Se suministra con adaptadores de código de barras DNA y mezcla de cebador.</td></tr><tr><td>Kit de amplificación de biblioteca en tiempo real KAPA</td><td>Roche 07959028001</td><td></td><td>suministrado con 2 mezclas maestras de PCR en tiempo real KAPA HiFi HS, mezcla de cebadores de PCR y estándares fluorescentes</td></tr><tr><td>2 KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Roche</td><td>KM2602</td><td>para la preparación de bibliotecas. Además, esta enzima puede ser necesaria para el kit de amplificación de biblioteca en tiempo real KAPA</td></tr><tr><td>Tampón EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8,5 para la elución de ADN</td></tr><tr><td>Placa qPCR de 386 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td>para PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>QuantStudio 7 Flex Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485701</td><td>Para cuantificar</td></tr><tr><td>la película adhesiva óptica MicroAmp de ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>Para PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>MicroAmp Película adhesiva transparente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td>para el sellado de placas</td></tr><tr><td>Mezcla</td><td></td><td></td> maestra de reparación final <td>Combine 1.4 &micro; L de 10x Tampón de reparación de extremos KAPA, 1 &micro; L de KAPA End Repair Enzyme Mix, y 1.6 &micro; L de H2O</td></tr><tr>Mezcla <td></td><td></td><td>maestra A-taling</td><td>Combine 1 &micro; L de tampón de relaves KAPA A, 0,6 y micro; L de la enzima de cola KAPA A, y 8.4 &micro; L de H2O</td></tr><tr>Mezcla <td></td><td></td><td>tampón de ligadura</td><td>Combine 2 &micro; L de tampón de ligadura KAPA y 6 &micro; L de H2O</td></tr><tr>Mezcla <td></td><td></td><td>maestra de PCR en tiempo real</td><td>Combine 5 &micro; L de 2x KAPA HiFi HS PCR en tiempo real Master Mix, 0.35 y micro; L de mezcla de cebadores para PCR (10 y micro; M cada uno de los cebadores delanteros AATGATACGGCGACCACCGAG y cebadores inversos (CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), y 3.15 &micro; L de H2O</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td></td><td></td><td>Combine 10 &micro; L de 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 y micro; L de mezcla de cebadores PCR, y 0,6 y micro; L de H2</td></tr><tr><td>O Visor de Genómica Integrativa</td><td>Broad Institute</td><td>IGV_2.3.88</td><td>Navegador de genoma para visualizar datos de secuenciación</td></tr><tr><td>Oligionucleótido de ADN: 5&prime;-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>Un cebador para amplificar la región promotora del</td></tr><tr><td>olgionucleótido de ADN GAPDH: 5&prime;-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>Un cebador para amplificar la región promotora de GAPDH</td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara</td><td>RR420L</td><td>Para cuantificar el ADN correspondiente a la región promotora de GADPH</td></tr><tr><td>Termociclador Dice</td><td>Takara</td><td>TP870</td><td>Para cuantificar el ADN correspondiente a la región promotora de GADPH</td></tr></tbody></table>

tchip-seq: perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Regulación epigenética juega un papel central en la expresión génica. Puesto que la modificación de las histonas se descubrió en la década de 1960, sus funciones fisiológicas y patológicas se han estudiado ampliamente. De hecho, la llegada de próxima generación secuenciación profunda e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) mediante anticuerpos de modificación específica de la histona ha revolucionado nuestra visión de la regulación epigenética a través del genoma. Por el contrario, tejidos consisten en típicamente tipos celulares diferentes, y su mezcla compleja plantea desafíos analíticos a investigar el epigenoma en un tipo de célula particular. Para abordar el estado de cromatina tipo específico de célula en forma de genoma, recientemente desarrollamos tándem cromatina inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq), que se basa en la purificación selectiva de la cromatina por las proteínas de histona etiquetado núcleo de célula tipos de interés, seguido por ChIP-seq. El objetivo de este protocolo es la introducción de mejores prácticas de tChIP-SS. Esta técnica proporciona una herramienta versátil para la investigación de tejidos específicos epigenoma en modificaciones de las histonas diversas y organismos modelo.

Aquí, describimos la disección del tejido, fijación, lisis celular, purificación del tándem de cromatina y preparación de biblioteca de DNA para secuenciadores de última generación. Durante los procedimientos, uno puede probar la calidad de la DNA, que es la clave para la secuencia del éxito, en varios pasos (figura 2). Puesto que un nucleosoma solo es rodeada típicamente por 147 bp DNA 4, esquilado ADN no debe ser menor que el tamaño....

Se describe un protocolo paso a paso para cromatina tándem inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq) que permite el análisis de modificaciones específicas del tipo de célula genoma histona.

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, como la cantidad de modificaciones cromáticas reguladas de una manera específica de tipo celular junto con los genomas. La principal ventaja de esta técnica es que podemos aislar la cromatina de las células objetivo y luego seguir la corriente típica gitana aguas abajo. Así que este método puede proporcionar información sobre el trimincil específico de la neurona, lysinc 4, opisoncilly.También se puede aplicar a otras modificaciones de histonas, otros tipos de células y, a continuación, otros organismos modelo. Demostrando el procedimiento estará Mari Mito, una técnico de mi laboratorio. Para empezar, utilice tijeras de resorte fino para diseccionar el tejido de interés en trozos pequeños.Agregue los fragmentos de tejido a un recipiente limpio lleno de nitrógeno líquido. Luego, transfiera los fragmentos de tejido a dos tubos mililitros llenos de nitrógeno líquido. Almacene los tubos a menos 80 grados centígrados durante cinco minutos con la tapa abierta para evaporar el nitrógeno líquido.Coloque los tubos que contienen las muestras de tejido en un estante de hielo metálico refrigerado. A continuación, coloque una bala metálica en un tubo de 1,5 mililitros y enfríe con nitrógeno líquido. Coloque la bala de metal refrigerado en uno de los tubos de muestra.Cierre la tapa y ajuste el tubo en el soporte del tubo de una amoladora criogénica. Inmediatamente, sumerja el soporte del tubo montado en nitrógeno líquido durante un minuto. Inserte el soporte del tubo congelado en el cassette exterior de la amoladora criogénica.Y agítalo vigorosamente durante 30 segundos, 60 veces. Después de esto, desmontar la amoladora criogénica, quitar la bala de metal. Y coloque el tubo en un enfriador de muestra pre-refrigerado.Almacene el refrigerador a 20 grados Celsius negativos durante 15 minutos. A continuación, agregue 900 microlitros de 1%formaldehído al tubo y pipeta para mezclar. Transfiera la suspensión a un nuevo tubo de dos mililitros con 900 microlitros de 1% de formaldehído.A continuación, fijar la suspensión durante 10 minutos con rotación suave a 23 grados Celsius. Para detener la reacción de fijación, añada 100 microlitros de 2,5 molares de glicina al tubo. Y centrifugar a 3.000 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Después de esto, desecha el súper sobrenadante. Agregue un mililitro de PBS al tubo y el vórtice para mezclar. Centrifugar a 3.000 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Repita este paso de lavado, dos veces más. A continuación, agregue 500 microlitros de tampón de lysis uno al pellet y pipeta para mezclar. Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 3.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados y deseche el sobrenadante.Agregue un mililitro de tampón de lelisis dos al pellet y el vórtice para mezclar. Luego, centrifuga la suspensión durante cinco minutos a 3.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados y deseche el sobrenadante. Después de esto, añadir 800 microlitros de tampón de ensayo de inmunoprecipitación por radio con cóctel inhibidor de la proteasa al pellet y pipeta para mezclar.Centrifugar la suspensión durante cinco minutos a 3.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados y deseche el sobrenadante. A continuación, añadir 500 microlitros de tampón RIPA con cóctel inhibidor de la proteasa al pellet. Luego, centrifuga la suspensión durante cinco minutos a 3.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados y deseche el sobrenadante.Añadir un mililitro de tampón RIPA con cóctel inhibidor de la proteasa. Inmediatamente después de añadir el tampón RIPA con el cóctel inhibidor de la proteasa, transfiera el izado a un tubo sonicador. Y coloque el tubo en un ultrasonicador.Usando los ajustes descritos en el protocolo de texto, corta la cromatina. A continuación, transfiera la muestra a un tubo de baja unión de 1,5 mililitros de proteína. Y centrifugarlo durante cinco minutos a 20.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados.Recoger el sobrenadante de la muestra y transferirlo a un nuevo tubo de baja unión proteica. En este protocolo, se introdujo y demostró la secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina en tándem. Durante el procedimiento, la calidad del ADN se probó en varios pasos.Inmediatamente después de la sonicación, el ADN cizallado fue aislado y probado con máquina de electroforesis microfluídica. Después de utilizar anticuerpos anti-FLAG y anti-H3K3me3 para realizar la purificación de afinidad, se volvió a comprobar la calidad del ADN. La especificidad de la purificación inmune del ADN en H2B-FLAG se confirmó con muestras de control negativo.Donde se detectaron cantidades insignificantes de ADN. Más adelante en el protocolo, se verificó la calidad de la biblioteca de secuenciación. El éxito de ChIP y T-ChIP se evidenciaron mediante análisis de enriquecimiento utilizando imprimaciones dirigidas a la región promotora del gen GAPDH.Se obtuvieron redistribuciones representativas a lo largo de tres genes de neuronas. Y se observó el enriquecimiento de lecturas en los cinco extremos principales de los genes por neurona T-ChIP buscar sobre todo el cerebro T-ChIP buscar. Después de un estabilismo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo epigenético exploren la modificación específica de la histona del tipo celular general ampliamente en las neuronas en ratones.No olvide que trabajar con formaldehído puede ser extremadamente peligroso y tomar precauciones como usar ropa de goma y gafas siempre debe tomarse mientras se realiza este procedimiento.

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