Name: Purificación de proteínas anaerobias y análisis cinético mediante electrodo de oxígeno para el estudio de la inhibición y la actividad de DesB dioxigenasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprende a purificar proteínas anaerobias y analizar la cinética enzimática de DesB dioxigenasa mediante electrodo de oxígeno. Este protocolo mantiene la actividad y estabilidad de enzimas sensibles al oxígeno.

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Nos gustaría agradecer a Dr. Camille Keller de la Universidad de Wesleyan por soporte técnico. Agradecimiento especial a profesor Lindsay D. Eltis y Jenna K. Capyk de la Universidad de Columbia Británica, así como Christian Whitman de la Universidad de Texas en Austin, por su asesoramiento sobre métodos de purificación de la proteína anaerobia y el uso de una O2 -electrodo sensible.

Los autores tienen ninguna competencia intereses financieros u otros conflictos de intereses.

Los pasos críticos en la obtención de proteína activa purificada DesB implican la formación y el mantenimiento de la reducción fe (II) activo en la enzima. Como tal, correcto funcionamiento de la inducción, purificación, concentración y desalación pasos son esenciales para obtener con éxito la enzima activa. Inducir la expresión de la proteína en presencia de sulfato de amonio ferroso 1 mM asegura que el fe (II) se incorpora correctamente en el sitio activo de DesB. Este método está inspirado en estudios como los metaloe...

Las enzimas que utilizan el hierro u otros metales para activar el oxígeno son a menudo susceptibles a la inactivación durante el proceso de purificación debido a su retiro del ambiente reduciendo de una célula. Por lo tanto, estas proteínas deben utilizarse como lysates de la célula, ser sometidas a agentes reductores externos o purificadas anaeróbicamente para asegurarse que tengan una óptima actividad enzimática1,2,3,4. Para las enzimas que son sensibles al oxígeno (específicamente hierro-que contienen enzimas), realizando todos los pasos de purificación y caracterización manteniendo condiciones anaerobias es necesario caracterizarlas totalmente. Esto ha llevado a investigadores a desarrollar montajes de laboratorio todo dentro de los límites de cámaras anaeróbicas para estudios de expresión de la proteína a través Cristalografía5,6,7,8 .
Adjunto, Divulgamos los métodos para la depuración anaeróbica y caracterización cinética de la enzima DesB mediante un sistema de electrodo de oxígeno. DesB es una dioxigenasa galato de la bacteria de cepa de SP Sphingobium SYK-6 que está relacionado con la LigAB, un protocatecuate dioxygenase del mismo organismo. Ambas enzimas pertenecen a la superfamilia tipo II protocatechuate dioxigenasa (PCAL) que no ha sido extensamente estudiada a la fecha9, probablemente en parte debido a las enzimas de esta superfamilia es susceptible a la inactivación cuando se purificaron usando estándar aeróbico métodos de purificación de proteínas. Puesto que algunas de las enzimas de PCAL Mostrar promiscuidad de sustrato, mientras que otros son específicos del sustrato2,10, mayor caracterización de esta superfamilia es necesario identificar determinantes de especificidad. Como se ha observado en varias enzimas superfamilias11,12,13,14,15, pequeñas moléculas pueden alterar la actividad mediante inhibición competitiva directa o la Unión de moléculas a separar bolsillos alostéricos que causa un aumento o disminución de la actividad enzimática16. Mientras que la cinética solamente no puede distinguir la situación de la Unión de un modulador, determinar la magnitud de un cambio de actividad es importante para la comprensión de los efectos. Como tales, los métodos para la caracterización cinética de la actividad de DesB nativa y su actividad en presencia de 4-nitrocatechol (4NC), un compuesto utilizado para caracterizar e inhibir dioxygenase enzimas2,17, 18, se muestran.
DesB es capaz de romper galato, un aromático lignina derivado compuesto mediante una reacción de extradiol dioxigenasa (EDO) en que anillo de apertura es catalizada utilizando oxígeno como uno de los sustratos10,19. Esta reacción enzimática se produce en el contexto de la descomposición de la lignina, un CASET aromático encontrado en la pared celular de las plantas. Lignina puede ser despolimerizada, produciendo una variedad de compuestos aromáticos puede además dividirse en metabolitos central3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) cataliza un reacción de compuestos aromáticos dihydroxylated, donde se produce la hendidura adyacente a un diol coordinado de metal; la abertura del anillo en cambio, intradiol dioxygenases cleave análogos compuestos aromáticos entre los dos grupos hidroxilo (figura 1). EDOs, como muchas otras metaloenzimas, tienen un centro metálico divalente de coordinación fe (II) compuesto por una dos-histidina, uno-carboxylate tríada9,34,35. Estos metaloenzimas ser oxidados, a través de autoxidación o basadas en el mecanismo de inactivación, mientras que la enzima se hace inactivo2,36,37,38.
En los procedimientos experimentales descritos en este manuscrito, utilizamos DesB, un miembro de la superfamilia del PCAL de la bacteria Sphingobium SP., SYK-6, catalizan la adición de oxígeno a través de los bonos de C4-C5 de galato (figura 2A). La regioquímica de este escote es análogo a LigAB, que es un protocatechuate-4,5-dioxigenasa (figura 2B). Hasta el momento, las investigaciones de este dioxygenase galato incluyen ningunos informes de compuestos que inhiben la DesB10,19,39. Con el uso de métodos de depuración aerobia, DesB exhibió actividad variable, mientras que con el uso de métodos anaerobios pudimos obtener constantemente proteínas con actividad reproducible. Los estudios cinéticos descritos aquí muestran los métodos de depuración anaerobia de DesB, caracterización cinética de la reacción de DesB con saúco y la inhibición de DesB por 4-nitrocatechol (4NC).

<table><tbody><tr><td>Isopropilo &beta;-D-1-tiogalactopiranodisida</td><td>Oro Bio Technologies</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Azul Brillante R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>30% Acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>N,N'tetrametil-etilendiamina</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Resina de amilosa de alto flujo</td><td>New England Biolabs</td><td>E8022S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) células competentes de Escherichia coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>ácido gálico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>4-nitrocatecol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N15553</td><td></td></tr><tr><td>Ferroso sulfato de amonio</td><td>Mallinckrodt</td><td>5064</td><td></td></tr><tr><td>Ditionito de sodio</td><td>Alfa Aesar</td><td>33381-22</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Botellas de suero</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-406G</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Acrodisc PF Filtro de jeringa con membrana Supor</td><td>Pall Corportation</td><td>4187</td><td></td></tr><tr><td>400 mL Amicon Concentrador de células agitadas</td><td>EMD Millipore</td><td>UFSC40001</td><td></td></tr><tr><td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa corte filtro de membrana de celulosa reconstituida</td><td>EMD Millipore</td><td>PLGC07610</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 columna de gal desalinizante grueso</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0033-01</td><td></td></tr> 2 <tr><td>mL Viales con tapa engarzada Unidad de</td> control de electrodos <td>Fisher Scientific</td><td>03-391-38</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph</td> <td>PlusHansatech Instruments</td><td>OXYG1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de electrodo de oxígeno</td><td>Hansatech Instruments</td><td>DW1</td><td></td></tr><tr><td>Disco de electrodo</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0,0125 mmX25mm) Carrete de 30 m Kit</td> de limpieza de electrodos <td>Hansatech Instruments</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hansatech Instruments</td><td>S16</td><td></td></tr><tr><td>Papel espaciador</td><td>Zig Zag</td><td>disponible en cualquier gasolinera</td><td></td></tr><tr><td>Guantera Dri-Lab de la serie He</td><td>, empresa de aspiración/atmósferas</td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>HE-493 Dri-Train</td>, empresa de <td>aspiración/atmósferas</td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>espátula de acero inoxidable microcónica de doble extremo</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>DWK Ciencias de la vida Kimble Kontes Columna flexible Columna económica</td><td>Fisher Scientific</td><td>k420400-1530</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L, modelo 701 N SYR, cementado NDL 26s GA, 2 pulgadas, jeringa de punto Stlye 2</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>DWK Ciencias de la vida Kimble Kontes Flex Column Economy</td><td>Column Fisher Scientific</td><td>K420401-1505</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex-C5 homogeneizador de alta presión</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-PER Reactivo completo de extracción de proteínas bacterianas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89821</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima de clara de huevo de gallina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12650-88-3</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>ampicilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7177-48-2</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de</td> <td>sodioFisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>Maltosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>G46-500</td><td></td></tr></tbody></table>

purificación de proteínas anaerobias y análisis cinético mediante electrodo de oxígeno para el estudio de la inhibición y la actividad de desb dioxigenasa

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Proteínas sensibles al oxígeno, como las enzimas que utilizan oxígeno como sustrato, pueden han reducido la estabilidad cuando se purificaron usando métodos tradicionales de depuración aerobia. Este manuscrito muestra los detalles técnicos involucrados en el proceso de depuración anaerobio, incluyendo la preparación de buffers y reactivos, los métodos para cromatografía en columna en una caja de guante y la desalación de la proteína antes de la cinética. También se describe son los métodos para la preparación y uso de un electrodo de oxígeno para realizar la caracterización cinética de una enzima utilizando oxígeno. Estos métodos se ilustran mediante la enzima dioxigenasa DesB, una dioxigenasa galato de la bacteria de cepa de SP Sphingobium SYK-6.

Es el análisis del gel de SDS-PAGE de fracciones individuales de la purificación de la construcción de fusión DesB-maltosa vinculante proteínas (MBP) (figura 3). El gel revela que la proteína es pura (MW = 91.22 kDa), excepto por la presencia de DesB (MW = 49.22 kDa) y el dominio de la proteína MBP (42 kDa) divididos unos de otros. Fracciones E2 y E3 fueron seleccionados para la concentración (paso 4.2).
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Aquí presentamos un protocolo de purificación de proteínas anaerobias, anaerobias proteína concentración y posterior caracterización cinética mediante un sistema de electrodo de oxígeno. El método se ilustra utilizando la enzima DesB, una enzima dioxigenasa que es más estable y activo cuando purificada y almacenada en un medio ambiente anaeróbico.

Purificación de proteínas anaerobias y análisis cinético mediante electrodo de oxígeno para el estudio de la inhibición y la actividad de DesB dioxigenasa

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Este método está diseñado para responder preguntas clave en la bioquímica inorgánica de campo, sobre cómo mantener la actividad enzimática en proteínas que contienen metales sensibles al oxígeno. La principal ventaja de esta técnica es que te ayuda a visualizar formas en las que puedes mantener el metal de una proteína en su estado reducido. Generalmente, los individuos nuevos en esta técnica lucharán porque es difícil mantener materiales y reactivos para ser completamente anaeróbicos.24 horas después de inducir la expresión de proteínas, recoger las células por centrifugación, y resuspender el pellet celular bacteriano en 20 mililitros de tampón de columna de amilosa por 1,5 litros de crecimiento. Agregue un miligramo de suavezima a la suspensión celular y revuelva las células durante 20 minutos sobre hielo. Al final de la incubación, anlice la solución celular resuspendida mediante homogeneización de alta presión con tres a cinco pasadas a aproximadamente 15.000 psi, y transfiera la proteína a un tubo centrífugo de 50 mililitros.Enjuague el espacio de la cabeza con nitrógeno durante un minuto y centrifugar el izado de la célula para eliminar los escombros insolubles. Transfiera el sobrenadante a al menos un tubo de 50 mililitros, y tape el izado con un tabique de goma. Usando una aguja de calibre 20, burbujee lentamente el gas nitrógeno a través de la solución durante dos minutos para desplazar el oxígeno.Luego, envuelva el tabique con película de parafina, asegure el Parafilm con alambre de cobre y coloque el sobrenadante en la guantera con los materiales de la columna. Cuando el disolvente esté justo encima del lecho de resina, en una columna de amilosa previamente preparada, cargue 50 mililitros de sobrenadantes proteicos en la columna, recogiendo el flujo a través en fracciones de cinco mililitros bajo nitrógeno moderadamente presurizado a aproximadamente cinco mililitros por minuto. Cuando se haya eluido todo el flujo, lave la columna con otros tres volúmenes de columna de búfer de columna de amilosa.Agregue cinco CV de tampón de elución y luego recoja manualmente fracciones de tres mililitros en tubos de ensayo de vidrio bajo nitrógeno moderadamente presurizado. Pruebe las soluciones para la presencia de oxígeno con sulfato de amonio ferroso y ditiothreitol. La solución se volverá azul oscuro o negro si hay oxígeno, como el tubo de la derecha.La presencia de oxígeno dará lugar a proteína purificada con baja actividad catalítica. Las soluciones con oxígeno mínimo presente serán de color lavanda o azul claro translúcido, como el tubo de la izquierda. A continuación, utilice una línea de nitrógeno externa para presurizar la cámara celular agitada y concentre la proteína a 50 mililitros a una velocidad de agitación moderada dos veces.Luego, concentre la proteína en 10 mililitros y filtre la proteína concentrada a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros poros. Aliquot 150 microlitros de proteína en tubos individuales de reacción en cadena de 200 microlitros polimerasa. A continuación, retire las alícuotas tapadas de la guantera para la congelación inmediata del flash en nitrógeno líquido y su almacenamiento a menos 80 grados centígrados.Para desalar DesB, primero agregue tres mililitros de Gel de desalado grueso Sephadex G-25 a una columna de borosilicato de nueve mililitros, y lave la columna con dos volúmenes de columna de tampón de desalado desgastado. Cuando el DesB se haya descongelado, cargue la proteína purificada en la columna a través de un proceso controlado por gravedad y deseche el flujo antes de eluir tres gotas de proteína en cada uno de los 12 viales, con aproximadamente cinco mililitros de tampón de desalado. Para preparar el electrodo de oxígeno, utilice tijeras para cortar una aproximadamente 1,5 pulgadas cuadradas de papel espaciador, y corte pequeños triángulos en cada cara del cuadrado, con aberturas en las esquinas para ayudar en el envoltorio del electrodo.Agregue cinco gotas de una solución de cloruro de potasio al 50% en la ranura de ánodo de plata del electrodo, y conecte las gotas para que formen un anillo continuo de solución. Agregue dos gotas de la solución de cloruro de potasio a la parte superior del electrodo de platino, y coloque cuidadosamente el papel espaciador en la parte superior del electrodo de platino, suavizando el papel espaciador para que no haya burbujas de aire. Corte una pieza de aproximadamente dos pulgadas de largo de membrana de PTFE S4 de 30 m, y colóquela en la parte superior del papel espaciador, eliminando los bordes de la membrana para que estén alineados con el anillo exterior del electrodo.Usando un aplicador de junta tórica, empuje una pequeña junta tórica sobre el electrodo para fijar el papel espaciador y la membrana en el electrodo, y coloque una junta tórica más grande en la ranura circular del electrodo, teniendo cuidado de que no haya membrana debajo. Deslice la cámara superior del electrodo sobre la base y atornille las dos piezas juntas. Coloque el electrodo montado en su base y conecte el electrodo al sistema de monitoreo.Para determinar la tasa de reacción enzimática, utilice un electrodo de tipo Clark sensible al oxígeno, con integración por computadora para medir el consumo de oxígeno a través de la unidad de control de electrodos. Agregue un mililitro de tampón Tris en el volumen adecuado de sustrato a la cámara del electrodo y revuelva la solución durante 10 segundos. Después de 10 segundos, selle lentamente la cámara con el émbolo y atornille la parte superior hacia abajo.Utilice un tejido limpio para absorber el exceso de líquido que se desplaza de la cámara, y permita que el electrodo se equilibre donde puede producir una medición estable de la concentración de oxígeno en la solución durante al menos un minuto. A continuación, utilice una jeringa de 10 microlitros hermética al gas para agregar aproximadamente un microlitro de enzima a la cámara del electrodo a través del émbolo y recopile los datos de velocidad. Cuando se haya recogido toda la velocidad para una concentración de sustrato determinada, utilice un tubo de plástico conectado a un matraz de vacío de brazo lateral para vaciar la cámara del electrodo, y enjuague repetidamente la cámara durante cuatro a seis ciclos con agua.A continuación, configure la solución en el electrodo como se acaba de demostrar, utilizando una nueva concentración de sustrato. El análisis de gel SDS-PAGE de fracciones individuales de la purificación de la construcción de la fusión de proteínas de unión a DesB-maltosa revela el aislamiento de un producto proteico puro, aparte de la presencia de productos de dominio proteico de unión a DesB y maltosa que se separaron entre sí. Una vez tomadas todas las mediciones cinéticas, la actividad de DesB con gallato, por ejemplo, se puede obtener midiendo la tasa de consumo de oxígeno en diferentes concentraciones de gallato.Por el contrario, la tasa de inhibición de DesB con cuatro-nitrocatechol se puede determinar observando la reducción de la tasa de consumo de oxígeno de DesB con un galario de unlilolar en presencia de concentraciones variables de cuatro-nitrocatechol, lo que indica, por ejemplo, que el cuatro-nitrocatechol inhibe el consumo de oxígeno y, por lo tanto, la reacción DesB. Aunque este método puede proporcionar información al estudio de las enzimas dioxigenasas dependientes de ferros, se puede aplicar a otros sistemas, como otras metaloenzimas. No olvides que trabajar dentro de una guantera puede ser un reto, así que ten cuidado de no apresurarte mientras realizas esta técnica.

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