Name: Análisis de la secreción y síntesis de la proteína Epididimal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprende a localizar dinamina mediante inmunofluorescencia en secciones de epidídimo de ratón y la línea celular mECap18. Este protocolo permite aislar proteínas secretadas del fluido epididimario y el medio condicionado para estudiar la maduración espermática.

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Los autores desean reconocer la National Health and Medical Research Consejo de Australia proyecto Grant APP1103176 de apoyo a este trabajo.

Todos los procedimientos experimentales que implican recogida de tejido animal fueron aprobados por el cuidado Animal y Comité de ética de la Universidad de Newcastle.
1. inmunofluorescencia, tinción de las secciones parafina-encajadas Epididymal (figuras 1 y 2)
<ol><li>Inmediatamente después de la eutanasia de ratones adultos por inhalación de CO2 (ratones suizos, más de 8 semanas de edad), diseccionar cuidadosamente el epidídimo (usando tijeras quirúrgicas y pinzas) gratuita que cubre el tejido conectivo y grasa y sumergir en fijador de Bouin solución (> peso de volumen tisular diez veces) para la fijación durante la noche.</li>
	<li>Lavar el tejido con etanol al 70% con 2 × cambios diariamente durante 2 días y luego deshidratar a través gradual etanol (70%, 95% y 100%) en preparación para la infiltración y embebido en un bloque de parafina.</li>
	<li>Sección de los bloques de parafina en un espesor de 4 a 6 μm y montaje de las diapositivas en preparación para la tinción de inmunofluorescencia.</li>
	<li>En una campana de humos, dewax las secciones de parafina epidídimo mediante la adición de una cantidad suficiente de xileno a la jarra de la diapositiva para sumergir completamente la sección del tejido (3 × 5 min cada vez).</li>
	<li>Rehidratar las secciones de tejido por inmersión en soluciones de etanol graduado diluido en purificado de H2O (100% etanol 5 min, etanol al 100% 5 min, etanol al 90% 1 min, etanol al 80% 1 min, etanol al 70% 1 min y etanol al 50% 1 min).</li>
	<li>Lávese las secciones en un tarro de diapositivas una vez durante 5 minutos con suficiente solución salina amortiguada de fosfatos (PBS) para sumergir completamente la sección del tejido entero (siga estas instrucciones para los lavados posteriores).</li>
	<li>Decantar la solución de recuperación del antígeno correspondiente (es decir., 10 mmol/L citrato de sodio, 50 mmol/L Tris pH 10.5 o soluciones de recuperación de antígeno alternativos, dependiendo del antígeno a detectar) en una parrilla y un microondas hasta que hierva. Sumerja los portaobjetos en esta solución y someter a las secciones de tejido a las condiciones de recuperación de antígeno provocado por el calor optimizadas para anticuerpos individuales (ver tabla 1). PRECAUCIÓN: Asegúrese de que las diapositivas se sumergen totalmente en la solución de recuperación de antígeno durante el proceso de recuperación de antígeno.</li>
	<li>Retire el contenedor de la diapositiva de la microondas y fresco a temperatura ambiente.</li>
	<li>Enjuague los portaobjetos con PBS y utilice un rotulador impermeable deslizante para trazar alrededor de la sección de tejido.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en un recipiente humedecido (creado por un pañuelo de papel humedecido en la base del recipiente) y aplicar solución de bloqueo (3% BSA/PBS, filtrada previamente a través de un filtro de 0.45 μm) por 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Enjuague los portaobjetos una vez con PBS.</li>
	<li>Incubar las secciones con anticuerpo primario apropiado diluido a una concentración optimizada experimentalmente en el filtrado 1% BSA/PBS a 4 ° C durante la noche (1: 60 para anti-DNM1, DNM2 y DNM3 anticuerpos; 1: 100 para el anticuerpo anti-ATP6V1B1, ver tabla de materiales para detalles de anticuerpos). Nota: Para distinguir específicos de unión de anticuerpos no específicos, es necesario incluir estricta negativo (es decir., anticuerpo secundario único, primario anticuerpos preabsorbed contra inmunización péptido) y controles positivos24.</li>
	<li>Recalentar las diapositivas colocando a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
	<li>Lave el portaobjetos 3 × con PBS en una plataforma de agitación (60 rpm) durante 10 minutos.</li>
	<li>Incubar las secciones con anticuerpo secundario apropiado diluido con 1% BSA/PBS (filtrado a través de un filtro de 0.45 μm) a 37 ° C durante 1 hora (dilución 1: 400 para todos los anticuerpos secundarios, véase Tabla de materiales para detalles de anticuerpos). PRECAUCIÓN: Mantenga el envase de la diapositiva en la oscuridad de este paso adelante. Para el doble etiquetado, elegir una combinación compatible de anticuerpos secundarios (ej., anticuerpos secundarios deben se han planteado en diferentes especies).</li>
	<li>Lave el portaobjetos 3 × con PBS en una plataforma de agitación (60 rpm) durante 10 minutos.</li>
	<li>Contratinción las secciones con yoduro de propidio (PI, 7,48 μmol/L) o 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) por 2 min a temperatura ambiente para el núcleo de la etiqueta.</li>
	<li>Lave los portaobjetos dos veces con PBS en una plataforma de agitación (60 rpm) durante 5 minutos.</li>
	<li>Monte las secciones con 10% Mowiol 4-88 preparada en una solución de glicerol al 30% en 0,2 mol/L Tris (pH 8,5) y 2.5% 1, 4 - Diazabiciclo-(2.2.2)-octano.</li>
	<li>Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y guardar las diapositivas a 4 ° C para la observación futuro. PRECAUCIÓN: Se recomienda realizar la proyección de imagen de las diapositivas tan pronto como sea posible después de la preparación para evitar la pérdida excesiva de fluorescencia.</li>
</ol>2 aislamiento de Epididymosomes de la cabeza del ratón del epidídimo (Figura 3)
<ol><li>Inmediatamente después de la eutanasia de ratones adultos por inhalación de CO2 (ratones suizos durante 8 semanas de edad), inundar su vasculatura con PBS (previamente calentado a 37 ° C) para reducir al mínimo la contaminación de la sangre del tejido Epididimal. PRECAUCIÓN: el plasma sanguíneo contiene diversas poblaciones de exosomas, que son de tamaño similar al de epididymosomes25. La eficacia de la separación de la sangre del tejido del epidídimo puede accederse a través de la inspección del segmento inicial, un segmento epididymal altamente vascularizado localizado proximal al segmento de caput (es decir., zona 1 en la figura 1A)</li>
	<li>Disecar cuidadosamente el epidídimo libre de grasa que lo recubre y tejido conectivo y enjuague con medio modificado de Biggers, Whitten y Whittingham (BWW; pH 7,4, osmolalidad de 300 mmol/kg agua26,27) para reducir cualquier posibilidad de superficie contaminación de la sangre.</li>
	<li>Secar el tejido Epididimal para eliminar exceso de medios, diseccionar el epidídimo de la cabeza (es decir., zonas 2-5 en figura 1A) y la transferencia a un fresco plato de Petri (35 × 10 mm) que contiene medio de BWW. Asegúrese de que la cantidad de medio es suficiente para la recuperación final. Nota: Para 6 caput epidídimos, es aconsejable utilizar 1,1 mL de medio para permitir una recuperación de ~ 900 μl, que es uniformemente dividida y aplicado en la cima de 2 gradientes preparados (ver paso 2.9).</li>
	<li>Hacer una serie de pequeñas incisiones en el tejido de la cabeza con una cuchilla de afeitar. No tienes pelos en el tejido y así evitar contaminar la muestra con excesivo contenido citosólico. Incube la placa que contiene el tejido con suave agitación a 37 ° C por 30 min liberar el contenido luminal.</li>
	<li>Filtrar la suspensión resultante a través de 70 μm membranas para eliminar los desechos celulares.</li>
	<li>Recoger el filtrado y esta sujeto a pasos sucesivos centrifugación a 4 ° C con el aumento de velocidad para eliminar los detritos celulares (es decir., × 500 g× 2.000 g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min cada uno; 17.000 × g por 20 min y finalmente 17.000 x g para un 10 minutos adicionales o hasta que no pellet está formado después de la centrifugación). PRECAUCIÓN: Es importante evaluar el color de la pelotilla después del inicial 500 × g paso de centrifugación para contaminación de sangre mínimo está presente. Deseche todas las muestras donde esta pelotilla muestra coloración rosa.</li>
	<li>Preparación de gradientes discontinuos iodixanol (compuesto de 40%, 20%, 10%, 5% capas) diluyendo un medio de gradiente de densidad (compuesto de 60% (w/v) acuosa iodixanol) con una solución de 0.25 de mol/L sacarosa y 10 mmol/L Tris (pH 7.5).</li>
	<li>Preparar el gradiente en un tubo de ultracentrífuga (11 × 35 mm), con cada fracción de 450 μl (figura 3). Inspeccione visualmente el degradado después de la aplicación de cada fracción para asegurar que las interfaces están formadas con éxito entre cada capa antes de cargar la muestra de fluido Epididimal. Preparar cada gradiente fresco en el día de uso, sin embargo, la muestra de líquido luminal epidídimo puede ser conservada a 4 ° C por hasta 2 h antes de la carga.</li>
	<li>Cuidadosamente añadir 450 μl de epididymal luminal líquido suspensión (correspondiente al material recogido de la cabeza de 3 epidídimos) encima de una sola pendiente.</li>
	<li>Ultracentrífuga los gradientes a 160.000 × g a 4 ° C por 18 h. PRECAUCIÓN: Puesto que esta centrifugación se realiza a muy alta velocidad, todos los tubos de ultracentrífuga deberán asociarlo y equilibrados precisamente. Compruebe los tubos para asegurar que estén libres de daños visibles que pudieran comprometer su integridad.</li>
	<li>Suavemente Retire 12 fracciones iguales (cada uno compuesto por 185 μL) a partir de la capa superior y progresando hacia la parte inferior de la gradiente. Las fracciones equivalentes recuperadas de cada gradiente si corresponde (hasta dos gradientes) de la piscina. Nota: El ratón epididymosomes están más altamente enriquecidos en fracciones 9 1122, ver figura 4 y discusión.</li>
	<li>Después de la recuperación y puesta en común de fracciones 9 – 11, diluir en 2 mL de PBS y ultracentrífuga las muestras a 100.000 × g a 4 ° C para 3 h (13 × 56 mm tubo) para el epididymosomes de la pelotilla. PRECAUCIÓN: Puesto que el pellet de epididymosome puede ser difícil de ver, asegúrese de que la orientación de los tubos se observa como se colocan en el rotor y marque el tubo para indicar la posición expectante de la pelotilla epididymosome. Asegúrese de que cada tubo contiene un volumen suficiente (es decir., superior al 50% de su capacidad total) para prevenir el riesgo de colapso del tubo.</li>
	<li>Aspirar y descartar el sobrenadante sin perturbar el pellet de epididymosome.</li>
	<li>Evaluar la pureza de epididymosome (figura 4).</li>
	<li>Resuspender el precipitado de epididymosome en el medio deseado según las aplicaciones posteriores. Por ejemplo, medio BWW se utiliza generalmente para los experimentos de incubación conjunta con espermatozoides o, alternativamente, un tampón de lisis apropiado en la preparación para la resolución del proteoma epidídimo mediante SDS-PAGE.</li>
</ol>3. inmunofluorescencia tinción de las células mECap18
<ol><li>Preparación de cubreobjetos estériles (para llevarse a cabo en una campana de cultivo celular)<ol>
<li>Remoje el cubreobjetos (12 × 12 mm) en etanol al 70% durante 10 min y desinfectar secando bajo temperatura alta por encima de una lámpara de etanol.</li>
		<li>Enfriar el cubreobjetos por 10 s antes de transferirlas a una placa bien 12.</li>
		<li>Aplicar solución de poli-l-lisina estéril para cubrir el cubreobjetos y colocar por 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Deseche la solución de poli-l-lisina y enjuague el cubreobjetos con estéril de H2O o caso medio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Células de mECap18 de preparación<ol>
<li>Paso las alícuotas de 2 × 105 células de mECap18 en cada pocillo de la placa bien 12 con el cubreobjetos.</li>
		<li>Las células con mECap18 celular medio (DMEM suplementado con 1% L-glutamina, 1% piruvato de sodio, 1% de penicilina/estreptomicina y 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 μmol/L) que contiene 10% fetal suero de ternera (FBS) en una incubadora de 37 ° C bajo una atmósfera de 5% de la cultura CO2 durante la noche.</li>
		<li>Una vez que las células se adhieren al cubreobjetos, deseche el medio y enjuague las células dos veces con PBS.</li>
		<li>Añadir una cantidad suficiente de paraformaldehído al 4% (PFA) diluida en PBS a sumergir el cubreobjetos todo y fijar las células a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
		<li>Deseche la solución de la PFA y enjuague el cubreobjetos dos veces en PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tinción de inmunofluorescencia<ol>
<li>Permeabilizar las células mECap18 por inmersión en 0,1% Tritón X-100 en PBS durante 10 minutos.</li>
		<li>Enjuague el cubreobjetos con PBS.</li>
		<li>Bloque de células mECap18 con 3% de BSA y proceder con inmunomarcación de las células utilizando protocolos equivalentes a los descritos para las secciones de tejido Epididimal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. aislamiento de proteínas del medio de cultivo celular condicionada
<ol><li>Colección del medio de cultivo celular condicionada<ol>
<li>Alícuotas de paso de 4 × 105 mECap18 células en cada pozo de 6 bien la placa con mECap18 celular suplementado con 10% FBS para 24 h.</li>
		<li>Lavar las células mECap18 tres veces con medio de mECap18 celular (preparado sin SFB) para quitar FBS residual y cualquier asociado contaminantes de la proteína.</li>
		<li>Añadir 1,5 mL de medio de mECap18 celular (preparado sin SFB) a cada pozo e incubar con las células mECap18 por 12 h en una incubadora de 37° C debajo del 5% CO2. Nota: las células de mECap18 en este paso pueden ser evaluadas para antígenos diferentes según el diseño experimental.</li>
		<li>Después de 12 h de incubación, recoge el medio celular y centrifugar a 2.000 × g por 10 min eliminar todos los desechos celulares. Nota: La duración de la incubación es capaz de modificarse según evaluación diseño experimental/extremo y teniendo en cuenta la tolerancia de la célula al tratamiento aplicado. Se recomienda adaptar el tiempo de incubación basado en regímenes experimentales específicos para lograr resultados óptimos.</li>
		<li>Evaluar la viabilidad de las células mECap18 través de la aplicación de un estándar trypan azul exclusión ensayo28. Deseche todo el material en que la viabilidad celular ha disminuido por debajo del 90% para eliminar el sesgo introducido por las proteínas de las células muertas o moribundas.</li>
		<li>Aislar proteínas del medio celular como sigue o preservar el medio a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislamiento de la proteína (a llevarse a cabo en una campana de humos)<ol>
<li>Añadir 20% volumen de frío 100% el ácido tricloroacético al 80% del volumen de medio condicionado de la célula para precipitar las proteínas de las células mECap18 cultivadas. Incubar a 4 ° C durante la noche con la mezcla constante.</li>
		<li>Después de la incubación, de la pelotilla de proteína precipitada por centrifugación (17, 000 × g, 4 ° C por 10 min). Nota: Debido a la limitada cantidad de proteínas que se secretan en el medio, es posible que la pastilla no se ser visualizada fácilmente después de la centrifugación. Por lo tanto, es imperativo orientar el tubo antes de la centrifugación y tenga cuidado de no para perturbar la ubicación de pellets expectante durante la extracción del sobrenadante correctamente.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y lavar el pellet dos veces con acetona enfriada antes del volver a centrifugar (17, 000 × g, 4 ° C por 10 min).</li>
		<li>Cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante antes de secado al aire cualquier acetona residual dentro de una campana de humos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de proteína en un tampón de extracción adecuada en preparación para el análisis de punto final detectar perfiles de proteína secretora completa o proteínas objetivo individual (por ej., SDS-PAGE, immunoblotting).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Estos estudios incorporan el uso de tejido de epidídimo fijo de Bouin que había sido objeto de inclusión en parafina y protocolos de seccionamiento. Solución fijador de Bouin compone de una mezcla de formaldehído, el ácido pícrico y el ácido acético, con cada componente tiene una función específica y complementaria. Por lo tanto, formaldehído reacciona con aminas primarias para formar enlaces cruzados proteína, ácido pícrico penetra lentamente el tejido formando sales y por lo tanto, la coagulación de proteínas básicas y...

Los espermatozoides de todas las especies mamíferas adquieran el potencial para mostrar motilidad progresiva hacia adelante y fertilizar un óvulo durante su descenso prolongado por el epidídimo, una región altamente especializado del sistema masculino conducto extra testiculares, que pueden 7-14 días para navegar (dependiendo de la especie)1. Debido a la extrema condensación de la cromatina paterna y el derramamiento de la mayoría del citoplasma que acompaña el cytodifferentiation de espermatozoides en los testículos, su posterior maduración funcional está impulsado exclusivamente por su interacción con el microambiente epidídimo. Este medio es, a su vez, creado por la actividad secretora y absortiva del soma epididymal de guarnición y muestra un nivel excepcional de segmento variación1. Así, los segmentos más activos en cuanto a la síntesis de proteínas y la secreción son los situados en la porción proximal del epidídimo (es decir, la cabeza y corpus)2. Esta actividad refleja el perfil funcional de los espermatozoides, con el primer principio de las células para mostrar características distintivas de la competencia funcional (es decir., motilidad progresiva y la capacidad de enlazar a glicoproteínas de la zona ácido solubilizado) siguientes sus paso por el epidídimo cápita del3. Estos atributos funcionales continúan desarrollándose antes de llegar a niveles óptimos mientras los espermatozoides alcanzan el segmento distal del epidídimo (cauda), en donde se almacenan en un estado quiescente en la preparación para la eyaculación. La formación y el mantenimiento de este depósito del almacenaje de la esperma está también íntimamente ligada al epitelio de revestimiento, que en la cauda está dominado por la fuerte actividad de absorción4,5. Aunque las diferencias anatómicas se han reportado6,7,8, tal división regionalizada del trabajo parece ser una característica de epidídimo que es compartido entre la mayoría de las especies de mamíferos estudiados hasta la fecha, incluyendo nuestra propia de9,10. De hecho, desde una perspectiva clínica, se conoce que la disfunción epidídimo hace una importante contribución a la etiología del factor masculino infertilidad11, subrayando así la importancia de comprender la regulación de este tejido especializado.
Por lo tanto, es lamentable que nuestra comprensión de la fisiología del epidídimo y los mecanismos que regulan las fases secuenciales de la maduración de espermatozoides y almacenamiento dentro de este tejido, quedan por resolverse completamente. Entre los factores que contribuyen, limitando los avances en investigación epidídimo son la complejidad total de este tejido y conocimiento de los mecanismos que ejercen control regulador sobre su microambiente luminal. Anatómicamente, sabemos que más allá de la distinción de segmentos corpus, caput y cauda, el epidídimo se puede subdividir en varias zonas (figura 1A), cada uno separados por septos12 y caracterizado por perfiles discretos de gene/proteína 14,13,15,16,de expresión de17,18. De hecho, sobre la base de detallados transcripcional de perfiles de expresión génica segmentaria en el epidídimo, como 6 y 9 zonas epidídimo se han divulgado en los modelos de ratón y rata, respectivamente19,20. Tal complejidad probablemente refleja la composición del epidídimo soma, un epitelio seudoestratificado compuesto por numerosos tipos celulares diferentes; cada diferente con respecto a sus abundancia, distribución y secreción/absorción actividades a lo largo de la longitud de la zona. Así, las células principales son por mucho los más abundantes células epidídimo tipo constituyendo más del 80% de todas las células epiteliales. En consecuencia, las células principales son responsables de la mayor parte de la biosíntesis y la secreción de proteína Epididimal5. En contraste, la población de células claras, que alinea como el segundo más abundante tipo de célula en el epidídimo soma, principalmente participan en la absorción selectiva de componentes luminales y la acidificación de este microambiente5. Añadiendo otro nivel de complejidad, los andrógenos y otros factores de lumicrine de origen testicular ejercen control diferencial sobre cada uno de estos tipos de células epidídimo dependiendo de su posición a lo largo de la zona.
A pesar de las limitaciones impuestas por tal complejidad, incursiones significativas se siguen haciendo en resolver la base mecanicista de la función del epidídimo. Una clave a estos estudios ha sido la aplicación de estrategias avanzadas de espectrometría de masas para establecer inventarios de amplia escala del proteoma epididymal, junto con análisis detallados de proteínas individuales seleccionados entre estos estudios iniciales. Una ilustración de ello es la reciente caracterización de la familia de la DNM de mechanoenzymes en el ratón modelo21. Nuestro interés inicial en la DNM fue alimentado por su doble acción en el acoplamiento de procesos endocytotic y exo. Basándose en estas observaciones, hemos sido capaces de demostrar que las tres isoformas canónicas de la DNM (DNM1 - DNM3) son altamente expresadas en el epidídimo de ratón y colocadas de forma apropiada para cumplir con funciones reguladoras en la secreción de la proteína y absorción de21 . Por otra parte, hemos sido capaces de diferenciar claramente cada isoforma de la DNM en base a su localización celular y subcelular, así sugiriendo que poseen complementarias frente a actividad redundante, en el epitelio Epididimal21.
Aquí, describimos la metodología experimental empleada para el estudio de la expresión de la DNM en el epidídimo de ratón con la esperanza de que esta información se encuentra aplicación en la caracterización de proteínas epididimales alternativas y así contribuir a nuestra comprensión de la función de este importante elemento del tracto reproductivo masculino. Específicamente, se describe el desarrollo de una metodología robusta para inmunofluorescencia etiquetado de proteínas blanco en secciones parafina-encajadas de epidídimo y la posterior detección de la distribución espacial de estas proteínas por inmunofluorescencia microscopia. Documentamos más nuestros protocolos recientemente optimizado22 para el aislamiento y caracterización de epididymosomes; exosomas como pequeñas vesículas que constituyen elementos clave del perfil secretor epididymal y parecen sostener un papel destacado en la promoción de la maduración de espermatozoides23. Como un enfoque complementario, también Describimos la detección de inmunofluorescencia de las proteínas de la blanco en una línea de células inmortalizadas ratón caput epitelio Epididimal (mECap18) y el uso de este recurso como un modelo con el cual explorar la regulación de epidídimo in vitrode la actividad secretora.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo Dynamin 1</td><td>Abcam</td><td>ab108458</td><td>Especie huésped: Conejo, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anticuerpo Dynamin 2</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6400</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Cabra, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: anticuerpo policlonal</td></tr><tr><td>Dynamin 3</td><td>Proteintech</td><td>14737-1-AP</td><<td>fuerte>Especie huésped</fuerte>: Conejo, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: anticuerpo policlonal</td></tr><tr><td>ATP6V1B1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21206</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Cabra, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: anticuerpo policlonal</td></tr><tr><td>CD9</td><td>BD Pharmingen</td><td>553758</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Rata, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: monoclonal</td></tr><tr><td>Anticuerpo Flotillin-1</td><td>Sigma</td><td>F1180</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Conejo, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: anticuerpo policlonal</td></tr><tr><td>ALOX15</td><td>Abcam</td><td>ab80221</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Conejo, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>:</td></tr><tr><td>anticuerpo policlonal TUBB</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5274</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Ratón, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: </td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal PSMD7</td><td>Abcam</td><td>ab11436</td><td>Especie huésped: Conejo, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Conejo Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11008</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Cabra, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Cabra Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11055</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Burro, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Cabra Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11058</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Burro, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Rata Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11007</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Cabra, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Conejo HRP</td><td>Millipore</td><td>DC03L</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Cabra, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Rata HRP</td><td>Millipore</td><td>DC01L</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Cabra, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Ratón HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td><fuerte>Especie huésped</fuerte>: Cabra, <fuerte>Isotipo</fuerte>: IgG, <fuerte>Clase</fuerte>: policlonal</td></tr><tr><td>4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>yoduro de propidio (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Thermo</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>5&alpha;-androstan-17&beta;-ol-3-oneC-IIIN</td><td>Sigma</td><td>A8380</td><td></td></tr><tr><td>piruvato de sodio</td><td>Thermo</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-etilendiaminatetraacético ácido (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Astral</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>1, 4-diazabiciclo-(2.2.2)-octano</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-gysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>78787</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético</td><td>Sigma</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Ajax Finechem</td><td>A6-2.5 L</td><td></td></tr><tr><td>GL Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poly (alcohol vinílico)</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Ajax Finechem</td><td>783-500G</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Medio de gradiente de densidad</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía de fluorescencia</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axio Imager A1</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Optima Max-XP</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífugas</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Heracell</td><td>150</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital grande</td><td>Ratek</td><td>OM7</td><td></td></tr><tr><td>Microondas</td><td>LG</td><td>MS3840SR /00</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH de laboratorio</td><td>MeterLab</td><td>PHM220</td><td></td></tr><tr><td>Rotulador de portaobjetos repelente a líquidos</td><td>Daido Sangyo</td><td>Mini</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo</td><td>586</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>CELLSTAR</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Corredera</td><td>Mikro-Glass</td><td>SF41296PLMK</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro; m filtro</td><td>Millox-HV</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Papel sin polvo</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga (2,2 ml, 11 veces; 35 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>347356</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga (3,2 ml, 13 veces; 56 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>Colador de células 70 &micro; m Nylon</td><td>FALCON</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 35 &times; 10 mm con levas</td><td>SARSTED</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Tarro deslizante</td><td>TRAJAN</td><td>#23 319 00</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de la secreción y síntesis de la proteína epididimal

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

El epidídimo mamífero genera uno de los más complejos líquidos intramural de cualquier glándula endocrina para apoyar la maduración post-testicular y el almacenamiento de espermatozoides. Tal complejidad se presenta debido a la actividad secretora y absortiva combinada de las células epiteliales de revestimiento. Aquí, describimos las técnicas para el análisis de la secreción y síntesis de la proteína Epididimal centrándose en la familia de proteínas modelo de Dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPasas grandes que tienen el potencial para regular eventos tráfico bidireccional de membrana. Para el estudio de expresión de la proteína en tejido Epididimal, describimos la metodología robusta para inmunofluorescencia etiquetado de proteínas blanco en secciones parafina-encajadas y la posterior detección de la distribución espacial de estas proteínas a través de microscopia de la inmunofluorescencia. También describimos la metodología optimizada para el aislamiento y la caracterización de los exosomas como vesículas, conocido como epididymosomes, que son secretadas en el lumen del epidídimo para participar en la comunicación intercelular con maduración células de la esperma. Como un enfoque complementario, también Describimos la detección de inmunofluorescencia de las proteínas de la blanco en una línea de células de ratón inmortalizó SV40 caput epitelio Epididimal (mECap18). Además, discutimos la utilidad de la línea celular de mECap18 como un modelo adecuado en vitro con el cual explorar la regulación de la actividad secretora de epidídimo. Para ello, se describen los requerimientos de cultivo para el mantenimiento de la línea de celular mECap18 y el uso de regímenes de inhibición farmacológica selectiva que son capaces de influir en su perfil de la proteína secretora. Los últimos son fácilmente evaluaron por cosecha del medio de cultivo condicionado, concentración de proteínas secretadas mediante precipitación de ácido tricloroacético/acetona y su posterior análisis mediante SDS-PAGE e immunoblotting. Sostenemos que estos métodos combinados son adecuados para el análisis de objetivos alternativos proteína Epididimal como preludio para determinar su papel funcional en la maduración del esperma o almacenamiento.

Figura 1 y Figura 2 muestran resultados representativos de la localización de la inmunofluorescencia de la DNM en el epidídimo de la cabeza de ratón. Cada una de las tres isoformas de la DNM había investigado pantalla localización distintos perfiles. Así, DNM1 se caracteriza por la relativamente modesta etiqueta difusa de las células del epidídimo a través del epidídimo de segmento y caput inicial (<strong class=...

Aquí, divulgamos la localización de la inmunofluorescencia de Dynamín para ilustrar los protocolos para la detección de proteínas en secciones de epidídimo de ratón embebido en parafina y las de una línea de células epidídimo inmortalizadas (mECap18). También se describen los protocolos para el aislamiento de proteínas secretoras de fluido Epididimal y medios condicionados de la célula.

Análisis de la secreción y síntesis de la proteína Epididimal

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Este máster combinado puede responder a preguntas clave en el campo de la investigación del epidídimo, como qué proteínas diana están implicadas en la regulación de la maduración y el almacenamiento de los espermatozoides. La principal ventaja de la técnica de aislamiento del epidídimo es que también es aplicable para aislar una población similar de otras regiones de la epidermis entre diferentes especies. Para comenzar este procedimiento, transfiera las secciones de parafina del epidídimo a una campana extractora.Agregue suficiente xileno al frasco de portaobjetos para sumergir completamente la sección de tejido. Rehidrate las secciones de tejido sumergiéndolas en soluciones de etinol graduadas diluidas en agua purificada como se describe en el protocolo de texto. Lave las secciones en un frasco de portaobjetos durante cinco minutos con suficiente PBS para sumergir completamente toda la sección de tejido.A continuación, decantar la solución de recuperación de antígeno adecuada en una gradilla de portaobjetos. Calienta la solución en el microondas hasta que esté hirviendo. Sumerja completamente los portaobjetos en la solución, sometiendo las secciones de tejido a soluciones de recu

analysis-of-epididymal-protein-synthesis-and-secretion

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

El método STA-PUT permite la separación de las diferentes poblaciones de células espermatogénica basado en el tamaño y la densidad.

La separación de los tipos de células de espermatogénesis Usando STA-PUT Sedimentación Velocity

Aquí, se describe un método para analizar los cambios en la iniciación de la traducción de ARNm de células eucariotas en respuesta a condiciones de estrés. Este método se basa en la separación de velocidad en gradientes de sacarosa de la traducción de los ribosomas de los ribosomas no traducir.

Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

El análisis proteómico de cualquier tipo de célula depende en gran medida tanto de la pureza como del prefraccionamiento del material de partida para descomplejizar la muestra antes de la cromatografía líquida, espectrometría de masas (MS). Mediante el uso de técnicas de retrolavado, se pueden obtener espermatozoides puros de roedores. Después de la digestión, los fosfopéptidos se pueden enriquecer con TiO2.

Análisis Phosphopeptide de roedores epidídimo Espermatozoides

Este protocolo de video demuestra un método para estudiar los efectos del líquido seminal en gasterópodos, utilizando el caracol hermafrodita de agua dulce Lymnaea stagnalis.

Efecto de la Mujer Accesorios Glándula productos en la puesta de huevos en gasterópodos

El control de la síntesis de proteínas ocurre principalmente en la etapa de iniciación de la traducción, cuyas deficiencias están relacionadas con diversos trastornos. Para comprender mejor su etiología, describimos aquí un protocolo utilizando ovocitos de Xenopus laevis que evalúa la traducción de la transcripción mos en presencia de un mutante del factor de iniciación de la traducción eIF4G1.

Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro

Este protocolo describe un método fácil para extraer y fraccionar transcripciones de tejidos vegetales sobre la base del número de ribosomas unidos. Permite una estimación global de la actividad de traducción y la determinación del estado de traducción de ARNm específicos.

Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

Los niveles elevados de proteína de líquido cefalorraquídeo pueden ser el resultado de la difusión de proteína plasmática a través de una barrera hematoencefálica alterada o de la síntesis intratecal. En este artículo se presenta un protocolo de prueba optimizado que ayuda a discriminar ambos casos y proporciona mediciones cuantitativas de proteínas sintetizadas intratecalmente.

Medición cuantitativa de proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones

Aquí, describimos la inmunoprecipitación de ribosomas y el ARN asociado de poblaciones selectas de células germinales macho adultas utilizando el sistema RiboTag. La cría estratégica y la cuidadosa inmunoprecipitación dan como resultado resultados limpios y reproducibles que informan sobre el traducto de células germinales y proporcionan información sobre los mecanismos de los fenotipos mutantes.

RiboTag Inmunoprecipitación en las células germinales del ratón macho

Aquí se describen dos modelos distintos de inyección quirúrgica para inducir estímulos inflamatorios en el segmento inicial (inyección intersticial) y la epididimidis cauda (inyección intravasal) en ratones. Estos métodos permiten estudiar las respuestas específicas de región en las diferentes regiones del epidídimo.

Modelos murinos de epididimitis inducidos por patrones moleculares asociados a patógenos

Aprende a localizar dinamina mediante inmunofluorescencia en secciones de epidídimo de ratón y la línea celular mECap18. Este protocolo permite aislar proteínas secretadas del fluido epididimario y el medio condicionado para estudiar la maduración espermática.

Análisis de la secreción y síntesis de la proteína Epididimal

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