Name: Detección y aislamiento de cuerpos apoptóticos de alta pureza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Aprende a detectar y aislar cuerpos apoptóticos con alta pureza mediante citometría de flujo y centrifugación diferencial. Este protocolo permite estudiar vesículas extracelulares en biología celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de salud nacional y Consejo de investigación médica (GNT1125033 y GNT1140187) y Australian Research Council (DP170103790) a I.K.H.P.

1. inducción de la Apoptosis
<ol><li>Centrifugue la muestra celular a 300 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante para eliminar cualquier residuo de células preexistentes. Nota: Al utilizar las células adherentes, las células de la semilla de antemano y lavar con solución tampón fosfato (PBS) antes de la inducción de la apoptosis 1 x.</li>
	<li>Determinar el número de células y recoger las células. Nota: Dependiendo del aislamiento después del ensayo, se recomiendan a un número inicial de células de al menos 1 x 107 células.</li>
	<li>Resuspender en medio completo (medio respectivo que contenga 10% (vol/vol) de suero de ternera fetal, 50 IU/mL de penicilina, 50 μg/mL estreptomicina mezcla) para una concentración final de 1 x 106 células/mL.</li>
	<li>Alícuota 2 x 106 células por pocillo de una placa bien 6.</li>
	<li>Para inducir apoptosis, retire la tapa de la placa e irradiar células en 150 mJ/cm2 con un irradiador UV. Esto debe tomar aproximadamente 30-60 s. Nota: Antes de la irradiación, asegúrese que se mantienen ~0.5 x 106 celdas para el control de la célula 'no Tratado'. Nota: Apoptosis también puede ser inducida a través de otros métodos como el anti-Fas o suero hambre6.</li>
	<li>Incubar a 37° C, 5% CO2 para 2-8 horas, dependiendo de la línea celular.</li>
	<li>Usando un microscopio de luz superior del Banco, visualizar células para confirmar la presencia de morfologías apoptóticas, tales como blebbing y apoptopodia formación ApoBD formación. Nota: un aumento 40 X es suficiente</li>
	<li>Con una pipeta P1000, pipeta y recoger muestras de la apoptosis.</li>
	<li>Lavar la placa con PBS 1 x y se combinan con la muestra restante para asegurar rendimiento máximo.</li>
	<li>Recoger ~1/10th para la 'muestra de Apoptotic todo' (era) de control.</li>
	<li>Recolectar la muestra ''.</li>
	<li>Centrifugar las muestras de la era y el no tratado a 3.000 x g durante 6 minutos.</li>
	<li>Resuspender en 1 mL de PBS 1 x y dejar de lado en el hielo.</li>
	<li>Para el aislamiento de ApoBD, continuar al paso 2 o 3 con la restante muestra apoptótica.</li>
</ol>2. ApoBD aislamiento vía FACS
<ol><li>Centrifugar toda la muestra a 3.000 x g durante 6 minutos.</li>
	<li>Eliminar la mayoría del sobrenadante sin perturbar el pellet.</li>
	<li>Agite en una solución de tinción que contiene 1 mL de tampón de Unión x A5 1, 75 μl de A5-FITC y 2 μl de TO-PRO-3 1 x 107 células.</li>
	<li>Incubar la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	<li>Añadir 1-2 mL de tampón de Unión x A5 1 y centrifugar la muestra a 3.000 x g durante 6 min remover exceso mancha. Nota: Para el mezclado de la célula poblaciones o muestras de tejido, realizar un paso usando una combinación de marcadores específicos del tipo de célula en tampón de Unión x A5 1 la coloración del anticuerpo e incubar en hielo durante 20 minutos (o según protocolo del fabricante) antes de la centrifugación a 3.000 x g durante 6 min.</li>
	<li>Resuspender el pellet de la muestra en 3 mL de tampón FACS (PBS 1 x, 1 Tampón de Unión x A5, 10% FSC, 2 mM EDTA) por 1 x 107 células.</li>
	<li>Filtrar con un colador de célula 70 μm en un fondo redondo, tubo de polipropileno (citometría de flujo) y mantener las muestras en hielo y en la oscuridad.</li>
	<li>Encender la máquina FACS realizar conjunto estándar usando una boquilla de 100 μm, realizar el retardo de caída y asegurar un flujo estable.</li>
	<li>La muestra de la carga y la velocidad de a ~ 1000 eventos/s.</li>
	<li>Ajuste de FSC y SSC, APC (TO-PRO-3), voltajes FITC (A5) y eventos dentro de las parcelas del FACS para poblaciones se pueden separar claramente de la posición.</li>
	<li>Registrar eventos de 20.000.</li>
	<li>Establecer una estrategia bloquea en parte 4.</li>
	<li>En el diseño de la clase, agregue la puerta final de ApoBD como la población clasificación deseada.</li>
	<li>Comenzar la adquisición de la muestra y llevar a cabo una especie de prueba que recoge el ApoBDs de 5.000-10.000 en un nuevo tubo con 250 μl de tampón de FACS.</li>
	<li>Realizar un sistema nuevo al ras y separado de la carga ApoBDs.</li>
	<li>Adquirir y registrar a prueba-tipo ApoBDs.</li>
	<li>Verificar la pureza de ApoBD ~ 99% comparando FSC (eje y) vs A5 (eventos del eje x). Nota: A5 tinción puede reducir un poco al volver a analizar las muestras por blanqueamiento láser.</li>
	<li>Una vez lograda la pureza elevada, la muestra original de la carga y continuar clasificación hasta obtener el número deseado de ApoBDs. Nota: Si es necesario, doble clasificación puede realizarse para aislar simultáneamente ApoCells y ApoBDs. Nota: Al ordenar durante un largo período de tiempo, se recomienda incubar el tubo de la colección a 4 ° C.</li>
	<li>Clasificación es completa, recoger una pequeña porción de la clase ApoBDs, la clase ApoCells, no tratado y era apoptosis de validar y confirmar la pureza de la especie. Nota: Aunque la prueba-clase y pureza de la especie no deberán diferir significativamente, esto se basa en la configuración de flujo y estabilidad.</li>
</ol>3. ApoBD aislamiento mediante centrifugación diferencial
<ol><li>Centrifugue la muestra restante de apoptosis a 300 x g durante 10 minutos.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante, dejando ~ 500 μL para evitar perturbar el sedimento celular y agregar en un nuevo tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Eliminar los restantes 500 μl y resuspender el precipitado de células en 2 mL de PBS 1 x (esto representa la fracción de ApoCell enriquecido.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante recogido por 20 min a 3.000 g.</li>
	<li>Comprobar si una pelotilla y retire con cuidado el sobrenadante (el sobrenadante puede contener pequeñas vesículas extracelulares como microvesículas y exosomas).</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 1 mL de PBS 1 x (esto representa la fracción 'enriquecida con ApoBD')</li>
	<li>Recoger 100 μl de cada Viable, WAS, enriquecida con ApoCell y muestras enriquecidas con ApoBD en un fondo redondo nuevo, tubo de poliestireno (citometría de flujo).</li>
	<li>Añada 100 μl de colorante que contiene 2 x A5 tampón de Unión, 1: 100 A5-FITC y 1:1,000 TO-PRO-3</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 10 min en la oscuridad.</li>
	<li>Análisis de muestras por citometría de flujo, usando la estrategia bloquea como se describe arriba para validar la exitosa inducción de apoptosis y la pureza de la fracción enriquecida con ApoBD.</li>
</ol>4. flujo Cytometry Gating estrategia
<ol><li>Parcela a-PRO-3 (eje y) contra FSC (eje x) para separar células necróticas (TO-PRO-3alto) de todos los demás no permeabilized eventos (TO-PRO-3bajo/intermedio).</li>
	<li>Seleccione todos los eventos no permeabilized y parcela SSC contra A5. Puerta de dos poblaciones incluyendo la población 1 (P1), SSCintermedio/alto, A5bajo intermedio células y 2 (P2), todos los demás eventos.</li>
	<li>P2, parcela a-PRO-3 contra A5 y seleccione A5intermedio/alto eventos para excluir todos los desechos de la célula.</li>
	<li>Seleccione todos los eventos positivos de A5 y parcela FSC contra A5. Separar ApoBDs (FSCbajo) ApoCells (FSCintermedio/alto). Nota: Sincronización ApoBDs para el aislamiento de ApoBD mediante el enfoque de FACS, recomendamos un paso final seleccionando ApoBDs y comparando a PRO-3 A5 y todos los eventos. Esto asegura que la puerta de clasificación final utiliza fluorescencia en lugar de parámetros FSC/SSC.</li>
	<li>Para el análisis de células viables, seleccione P1 y realice una de dos estrategias bloquea. Para el análisis general célula viable, parcela FSC contra A5 y seleccionar todas las celdas deintermedio y alto FSC, por lo tanto eliminando restos celulares restantes. Por otra parte, para el análisis en profundidad, células viables se pueden separar de A5– ApoCells temprano trazando TO-PRO-3 contra el FSC. Seleccionar TO-PRO-3bajo, células viables deintermedio y alto FSC y TO-PRO-3intermedios, FSCintermedio/alto A5– ApoCells temprano.</li>
</ol>

<ol><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+the+Dying%3A+Mechanisms+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions.</a> Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).</li>
<li>Tixeira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+morphologic+features+and+products+of+cell+disassembly+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%3A+An+International+Journal+on+Programmed+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis.</a> Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).</li>
<li>Sebbagh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3-mediated+cleavage+of+ROCK+I+induces+MLC+phosphorylation+and+apoptotic+membrane+blebbing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing.</a> Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).</li>
<li>Coleman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+blebbing+during+apoptosis+results+from+caspase-mediated+activation+of+ROCK+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I.</a> Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+generating+extracellular+vesicles+during+apoptosis+via+a+beads-on-a-string+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure.</a> Nature Communications. 6, 7439(2015).</li>
<li>Poon, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+link+between+an+antibiotic%2C+pannexin+channels+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis.</a> Nature. 507, 329-334 (2014).</li>
<li>Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+microtubules+in+apoptotic+chromatin+dynamics+and+cellular+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation.</a> Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).</li>
<li>Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+basic+biological+phenomenon+with+wide-ranging+implications+in+tissue+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.</a> British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).</li>
<li>Witasp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+over+troubled+water%3A+milk+fat+globule+epidermal+growth+factor+8+promotes+human+monocyte-derived+macrophage+clearance+of+non-blebbing+phosphatidylserine-positive+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells.</a> Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).</li>
<li>Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinase+regulates+fragmentation+and+phagocytosis+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells.</a> Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).</li>
<li>Holmgren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+transfer+of+DNA+by+the+uptake+of+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies.</a> Blood. 93, 3956-3963 (1999).</li>
<li>Zernecke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+microRNA-126+by+apoptotic+bodies+induces+CXCL12-dependent+vascular+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection.</a> Science Signaling. 2, ra81(2009).</li>
<li>Schiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigens+are+translocated+into+small+apoptotic+bodies+during+early+stages+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis.</a> Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).</li>
<li>Elamin, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibits+the+Sonic+Hedgehog+signaling+pathway+and+triggers+apoptosis+in+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells.</a> Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).</li>
<li>Sagulenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIM2+and+NLRP3+inflammasomes+activate+both+apoptotic+and+pyroptotic+death+pathways+via+ASC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles%3A+apoptotic+bodies%2C+microvesicles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Turiak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+thymocyte-derived+microvesicles+and+apoptotic+bodies+in+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice.</a> Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+progression+of+cell+death+and+the+disassembly+of+dying+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry.</a> Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).</li>
<li>Berda-Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation+of+endothelial+cell-derived+apoptotic+bodies+is+mediated+by+interleukin-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).</li>
<li>Lleo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomics%3A+identification+of+unique+protein+profiles+of+apoptotic+bodies+from+biliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells.</a> Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cell+type-specific+apoptotic+bodies+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting.</a> Scientific Reports. 7, 39846(2017).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+contents+and+cell+origins+of+apoptotic+bodies+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7, 14444(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desde su primera descripción en la década de 1950, el campo de la apoptosis ha avanzado notablemente, convirtiéndose en un área de investigación prominentes. A pesar del interés general y grandes esfuerzos, ciertos aspectos de la apoptosis, en particular la formación de ApoBDs, no han sido bien estudiados debido a la falta de metodologías apropiadas. Estos incluyen en particular la limitación en el seguimiento de la progresión de la apoptosis y la formación de ApoBD simultáneamente utilizando la citometría de flujo tradi...

Apoptosis, una forma bien estudiada de muerte celular programada, es necesaria para mantener la homeostasis fisiológica y eliminar células potencialmente dañinas en el cuerpo humano1. Después de la inducción de la apoptosis, las células apoptotic (ApoCells) pueden someterse a una serie de cambios morfológicos y desmontar en pequeñas vesículas de membrana denominadas ApoBDs. En general, este proceso se conoce como desmontaje de la célula apoptótica y puede dividirse en 3 pasos distintos basados en morfología2,3. Paso 1 (membrana del plasma blebbing) se caracteriza por la formación de globo-como las estructuras en la superficie de la célula conocido como ampollas4,5. Paso 2 (formación de protusión apoptóticos) incluye la formación de protrusiones de membrana larga como apoptopodia, apoptopodia de cuentas y microtúbulos picos6,7,8. Por último, el paso 3 (formación ApoBD) incluye la fragmentación de la apoptosis protuberancias o ApoCells para generar ApoBDs6,9. Los resultados anteriores han sugerido un papel de ApoBDs en ayudar a la separación de células apoptotic y mediar la comunicación intercelular. Por ejemplo, se propone que la fragmentación de un ApoCell en ApoBDs puede generar pequeñas cantidades de 'pequeñas' que podrían eliminarse fácilmente rodeando los fagocitos2,10,11. Además, ApoBDs puede albergar una serie de biomoléculas como el DNA, RNA y proteínas, que pueden ser víctimas de la trata a las células circundantes para facilitar la comunicación de célula12,13,14. Para funcionalmente investigar estos procesos, es vital para confirmar tres parámetros fundamentales, incluyendo (i) validación de inducción de apoptosis y la formación de ApoBD, (ii) aislamiento de ApoBDs y (iii) confirmación de pureza ApoBD.
Previamente, una serie de métodos como citometría de flujo y microscopia electrónica se ha utilizado para estudiar la apoptosis y ApoBDs15,16,17,18. Sin embargo, cuantificación y detección de ApoBD son a menudo difíciles o se pasa por alto. Por ejemplo, la apoptosis basados en citometría de flujo del utilizan más habitualmente análisis emplea anexina V (A5, una proteína que se une el externalizados ' comer-me' señal fosfatidilserina (PtdSer)) y ácidos nucleicos de la mancha (PI) el yoduro de propidio19. Sin embargo, mediante el uso de esta combinación de tinte universal, análisis asume que hay solamente tres tipos de subconjuntos de la célula (células viables, ApoCells y células necróticas) en la muestra. Además, aunque se considera como "estándar de oro" por muchos investigadores para apoptosis, ensayos de citometría de flujo y análisis de datos posteriores a menudo excluyen ApoBDs a través de un primer paso bloquea seleccionar eventos deintermedio-alto FSC/SSC. Por ello, recientemente hemos desarrollado un análisis de citometría de flujo novela con A5 y PRO-TO-3, otra mancha nucleico que puede ser selectivamente tomada por caspasas 3/7-activa pannexin 1 (PANX1) canales7,20. Como la activación de caspasas inducida por 3 PANX1 precede PtdSer exposición en la etapa temprana de la apoptosis, TO-PRO-3 manchas diferencialmente apoptotic y células necróticas. Además, este acercamiento combinado con nuestra novela gating estrategia incluye eventos todos adquiridos durante el análisis de datos y como resultado, se identifican seis subconjuntos de la célula/de la partícula, incluyendo: (i) las células viables (FSC/SSCintermedio/alto, A5bajo , TO-PRO-3bajo), (ii) A5– ApoCells temprano (FSC/SSCintermedio/alto, A5bajo,intermedioPRO-TO-3), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermedio/alto, A5alta , TO-PRO-3intermedia), células necróticas (iv) o ApoCells finales (FSC/SSCintermedio/alto, A5alta,altaTO-PRO-3), (v) ApoBDs (FSC/SSCbaja, A5intermedio, TO-PRO-3bajo / intermedio) y (vi) escombros (FSC/SSCbajo, A5bajo,bajaPRO-TO-3)20. Nuestro enfoque destaca la importancia de analizar todos los subconjuntos de células/partícula y, más importante aún, la separación de ApoBDs de las células y desechos20. Por lo tanto, este enfoque demuestra una técnica eficiente para validar la inducción de la apoptosis y ApoBD formación simultáneamente.
Tradicionalmente, ApoBDs han sido aislados a través de una variedad de métodos de centrifugación diferencial por el que ApoBDs se puede separar de las células u otras vesículas extracelulares basadas en densidad. Sin embargo, tales métodos de centrifugación a menudo están limitadas por la baja ApoBD pureza, falta de un paso de cuantificación para confirmar la pureza de la muestra, o incapacidad para separar células específicas del tipo ApoBDs17,21,22. Por lo tanto, hemos desarrollado recientemente dos enfoques, basados en un FACS y un nuevo enfoque basado en la centrifugación diferencial que puede ser juntado con nuestro método de citometría de flujo previamente establecido para validar la inducción de apoptosis y muestra pureza23. Aislamiento de ApoBD a través de nuestro enfoque basado en el FACS puede enriquecer ApoBDs hasta 99% de pureza y puede acoplarse con una variedad de anticuerpos de tipo específico para aislar ApoBDs de poblaciones de células mixtas, muestras de tejidos y fluidos corporales23. Además, nuestro enfoque de centrifugación diferencial revisado demuestra un método eficiente para aislar ApoBDs al > 90% pureza23.
En este papel, describimos en detalle nuestro procedimiento experimental para validar la inducción de apoptosis y para detectar y cuantificar la formación de ApoBD. Los flujos de trabajo de aislamiento de ApoBD métodos basados en FACS y diferencial basado en la centrifugación también son elaborados y comparados. Los datos representativos demuestran que la metodología descrita proporciona una eficaz herramienta de vanguardia para estudios futuros de ApoBD.

<table><tbody><tr><td>Células, por ejemplo, monocitos THP-1 humanos cultivados (número de clon: TIB-202)</td><td>Medio ATCC-RPMI</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1640</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de penicilina y estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>FSC</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS-</td><td></td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V FITC</td><td>BD El</td> yoduro <td>de</td> Bioscience-TO-PRO-3 <td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>T3605</td><td>TO-PRO-3 puede causar irritación de la piel, los ojos y las vías respiratorias. Evite el contacto directo.</td></tr><tr><td>10x Tampón de unión de anexina V</td><td>BD Bioscience</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001710526</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga (15 mL)</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga (1,5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo de tejidos (37 &deg; C, 5% CO2)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo FACS ARIA III, configurado con dos láseres para la detección FITC y APC</td><td>BD Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Canto II Citómetro de flujo, configurado con dos láseres para la detección FITC y APC</td> BD <td>Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Diva 6.1.1 software</td><td>BD Bioscience</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Software FlowJo 8.8.6</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

detección y aislamiento de cuerpos apoptóticos de alta pureza

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Cuerpos apoptóticos (ApoBDs), microvesículas y exosomas son los miembros clave de la familia de vesículas extracelulares, con ApoBDs siendo uno del tipo más grande. Se ha propuesto que puede ayudar a ApoBDs celular separación así como la comunicación intercelular a través de biomoléculas de la trata de personas. Enfoques convencionales para la identificación y aislamiento de ApoBDs a menudo están limitados por la falta de cuantificación precisa y muestra baja pureza. Aquí, describimos un flujo de trabajo para confirmar la inducción de apoptosis, validar la formación ApoBD y aislar ApoBDs de alta pureza. También esbozar y comparar celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación y centrifugación diferencial basado en enfoques para aislar ApoBDs. Además, la pureza de ApoBDs aislados se confirmará mediante una previamente establecer flujo cytometry basado en coloración y método analítico. Tomados en conjunto, utilizando el enfoque descrito, THP-1 Desmontaje de monocitos apoptotic y la apoptosis celular fue inducida y validado, y ApoBD generado a partir de monocitos THP-1 fueron aisladas a una pureza de 97-99%.

Utilizando el procedimiento descrito aquí, se indujo la apoptosis de monocitos THP-1 y ApoBDs fueron detectados y aislados mediante FACS-basado o un método de centrifugación diferencial (figura 1). En primer lugar, apoptosis fue inducida por la irradiación UV y se tomaron muestras después de 2-3 h de incubación, cuando las células exhiben morfologías apoptóticas, incluyendo blebbing, apoptosis formación de protusión de la membrana y la generación de ApoBDs<su...

Un flujo de trabajo mediante centrifugación de flujo cytometry o diferencial se desarrolla para detectar, cuantificar y aislar cuerpos apoptóticos de una muestra de apoptotic de alta pureza.

Detección y aislamiento de cuerpos apoptóticos de alta pureza

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

El objetivo general de este protocolo es detectar y aislar cuerpos apoptóticos con una alta pureza. Los cuerpos apoptóticos son un tipo de vesículas extracelulares generadas para ayudar a la inducción de la hematosis. Son el tipo más grande de familia física extracelular, que generalmente varía de uno a cinco micrómetros de diámetro.Ahora se está haciendo evidente que los cuerpos apoptóticos pueden ayudar a los procesos celulares, como la eliminación de células apoptóticas y la comunicación intracelular. Por lo tanto, el desarrollo de una metodología precisa para detectar, cuantificar y aislar cuerpos apoptóticos es fundamental para la personalización de sus funciones y mecanismos. En esta serie de presentaciones vamos a mostrarte cómo detectar, cuantificar y aislar cuerpos apoptóticos de muestras apoptóticas.Parte A, la inducción de la apoptosis. Para inducir la apoptosis en líneas celulares, como los monocitos THB1, primero hay que empezar por recolectar las células. Cuente las células y recoja aproximadamente 10 millones de células o según sea necesario.Recomendamos 10 millones para el análisis de los cuerpos apoptóticos. Alocuente dos millones de células por pocillo de una plac

detection-and-isolation-of-apoptotic-bodies-to-high-purity

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Un método preciso para la evaluación de la muerte celular se describe. El protocolo de mejora sobre convencional anexina V / yoduro de propidio (PI) protocolos, que muestran hasta falsos positivos del 40% los eventos en las líneas celulares y células primarias de una amplia gama de modelos animales.

Modificado anexina V / yoduro de propidio ensayo Apoptosis una evaluación precisa de la muerte celular

Células vivas imágenes de la apoptosis mediada por la caspasa-3 en cultivos de células inmortalizadas N19-oligodendrocitos con...

Monitoreo escinde actividad caspasa-3 y la apoptosis de las células inmortalizadas oligodendrogliales utilizando células vivas, imágenes y Cleaveable Sustratos Fluorogenic-dye Después de despolarización de la membrana de potasio inducida por

En este vídeo, se realiza el ensayo TUNEL para detectar la presencia de células apoptóticas en una muestra. El estudio consiste en el uso de una ADN polimerasa especial, la desoxinucleotidil transferasa terminal, que cataliza la adición de dUTP marcadas al extremo 3' del ADN fragmentado, que puede observarse e identificarse bajo un microscopio de fluorescencia.

Marcaje final de dUTP nick mediado por transferasa terminal: ensayo TUNEL: un método in situ para detectar la fragmentación del ADN en células apoptóticas

En este video, demostramos el ensayo de eferocitosis para estudiar el aclaramiento de células apoptóticas utilizando microscopía confocal. La eferocitosis es un proceso de varios pasos en el que las células apoptóticas son engullidas por fagocitos y degradadas dentro de vesículas llamadas eferosomas. Este protocolo proporciona un método para visualizar porciones internalizadas y no internalizadas de células apoptóticas individuales y cuantificar la eferocitosis.

Ensayo de eferocitosis de células fijas: un método para estudiar la absorción eferocítica de células apoptóticas por macrófagos mediante microscopía de fluorescencia

Ensayos multiplex pueden proporcionar información útil para los mecanismos celulares básicos y eliminar los residuos de los reactivos y experimentos repetitivos innecesarios. Se describe aquí un múltiplex de la caspasa-3/7 ensayo de actividad, utilizando métodos fluorescentes y luminiscentes basados ​​en, para determinar la viabilidad celular en un modelo hipotalámico in vitro después de desafío oxidativo con ácido palmítico.

El uso de una Multiplexación Ensayo de la caspasa para determinar la apoptosis en un modelo de célula hipotalámica

El término anástasis se refiere al fenómeno en el que las células moribundas revierten un proceso de suicidio celular en una etapa tardía, se reparan a sí mismas y, finalmente, sobreviven. Aquí demostramos protocolos para detectar y rastrear células que se someten a anastasis.

Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de eventos de señalización intracelular inducidos en células viables por interacción física con células muertas o moribundas adyacentes. El protocolo se centra en los eventos de señalización inducidos por el reconocimiento de las células muertas mediado por receptores, en contraposición a su captación fagocítica o liberación de mediadores solubles.

Identificación de eventos de señalización intracelular inducida en células viables por la interacción con las células vecinas sometidos a la célula apoptótica de la muerte

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Aquí, presentamos un protocolo para aislar células de cáncer de mama apoptóticas clasificación celular activado por fluorescencia y más detectar la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama cáncer células madre células después de la revocación de la apoptosis por citometría de flujo.

Detección del flujo Cytometric recién formado cáncer similares a células madre de células de mama después de la revocación de la Apoptosis

Aquí presentamos un protocolo para preparar los timocitos apopónticos y los macrófagos peritoneal y analizar la eficiencia de la efervocitosis y el bloqueo específico por inhibidores de los timocitos apopónticos. Este protocolo tiene una amplia aplicación en el aclaramiento mediado por células de otras partículas, incluyendo granos artificiales y bacterias.

Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos

La apoptosis se puede caracterizar mediante el análisis citométrico de flujo de biomarcadores apoptóticos tempranos y tardíos. La línea celular de cáncer cervical, SiHa, se analizó en busca de biomarcadores de apoptosis después del tratamiento con actinomicina D utilizando un citómetro de flujo de sobremesa.

Análisis citométrico de flujo de biomarcadores apoptóticos en células de cáncer de cuello uterino SiHa tratadas con actinomicina D

Aprende a detectar y aislar cuerpos apoptóticos con alta pureza mediante citometría de flujo y centrifugación diferencial. Este protocolo permite estudiar vesículas extracelulares en biología celular.

Detección y aislamiento de cuerpos apoptóticos de alta pureza

Explorar más videos