Fabricación de Anisotropic antígeno Artificial polimérico que presenta las células para la activación de células T CD8 +

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la aminoingeniería. Por ejemplo, ¿cuál es el papel de las propiedades físicas de las partículas en las interacciones y activación de células inmunitarias biomateriales. La principal ventaja de esta técnica es que permite un control independiente del tamaño y la forma de las partículas biomiméticas.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer, ya que es una terapia de partículas fuera de la plataforma que puede causar respuestas inmunitarias mediadas por células in vivo. Aunque este método puede proporcionar información sobre la aminoterapia contra el cáncer, también se puede aplicar a otros sistemas. Por ejemplo, enfermedades infecciosas o diabetes tipo uno.

Para la síntesis de micropartículas, comience por pesar 100 miligramos de poli(ácido láctico-co-glicólico) o PLGA, en un vial de centelleo y disolver el PLGA en cinco mililitros de diclorometano por vórtice. Coloque un homogeneizador en un vaso de precipitados que contenga 50 mililitros de alcohol 1%polivinílico, o solución de PVA, de modo que el homogeneizador esté lo más cerca posible del fondo del vaso de precipitados sin tocarlo. Encienda el homogeneizador a la velocidad adecuada y añada la solución PLGA al vaso de precipitados durante un minuto de homogeneización.

Al final de la homogeneización, vierta la solución de micropartículas PLGA de alcohol polivinílico en un vaso de precipitados que contenga 100 mililitros de solución de 5%PVA en una placa de agitación en una campana química y revuelva la solución durante al menos cuatro horas. Cuando el disolvente se haya evaporado, vierta la solución de partículas en tubos cónicos de 50 mililitros y recoja las partículas por centrifugación. Sustituya el sobrenadante de cada tubo por 20 mililitros de agua desinocida y vuelva a suspender las partículas por vórtice.

A continuación, lleve el volumen final en cada tubo hasta 50 mililitros con agua fresca desimalitizada y lave las partículas dos veces más como se acaba de demostrar. Para la síntesis de nanopartículas, disolver 200 miligramos de PLGA en cinco mililitros de diclorometano y colocar una sonda sonicadora en un vaso de precipitados que contenga 50 mililitros de 1%PVA solución en hielo sin tocar la parte inferior del vaso de precipitados. Comience la sonicación a 12 vatios e añada inmediatamente la solución PLGA al vaso de precipitados para una sonicación de dos minutos para generar nanopartículas con un diámetro aproximado de 200 nanómetros.

Después de la sonicación, vierta la solución de nanopartículas PLGA de alcohol polivinílico 1%en un vaso de precipitados que contenga 100 mililitros de solución de 5 PVA en una placa de agitación durante cuatro horas de evaporación de disolvente en una campana de humo química. Cuando todo el disolvente se evapore, vierta la solución de partículas en tubos cónicos de 50 mililitros para centrifugación para eliminar cualquier micropartícula y eliminar los sobrenadantes. A continuación, transfiera las nanopartículas a tubos centrífugos de alta velocidad para tres lavados en agua desionizada como se ha demostrado.

Para la fabricación de partículas poliméricas, después del último lavado, vuelva a suspender las partículas en aproximadamente un mililitro de agua fresca desimalitizada y agregue la solución de fundición de película a las partículas a una concentración final de 2,5 miligramos por mililitro de partículas. Transfiera la suspensión de partículas en alícuotas de 10 mililitros en platos Petri rectangulares de 75 por 50 milímetros para un estiramiento dimensional. O en alícuotas de 15 mililitros en platos Petri de 100 por 100 milímetros cuadrados para estiramiento bidimensional.

Después de secar durante la noche en una capucha química, utilice pinzas para quitar las películas y recortar los bordes con tijeras. Para el estiramiento 1D, coloque los dos bordes cortos de una película entre dos piezas de caucho de neopreno para montarlos en los bloques de aluminio de un eje de un dispositivo automatizado de estiramiento de película delgada. A continuación, utilice una llave Allen para atornillar las empuñaduras metálicas en la parte superior de la goma para mantener la película en su lugar.

Para el estiramiento 2D, monte los cuatro bordes en cuatro bloques de aluminio para estirar la película en ambos ejes miden y registren la longitud de la película entre los bloques de aluminio en un eje para un estiramiento D o ambos ejes para el estiramiento 2D y calcule la distancia necesaria para estirar la película en una o dos direcciones en función del estiramiento de pliegue deseado. A continuación, coloque el dispositivo de estiramiento cargado de película en un horno a 90 grados centígrados junto a un vaso de precipitados más grande de una pequeña cantidad de agua para llevar la película a temperatura durante 10 minutos. Cuando el estiramiento esté completo, deje que la película se enfríe a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Para el estiramiento 1D, corte la película del dispositivo de estiramiento en los bordes. Para el estiramiento 2D, corte y guarde el cuadrado central de la película que se estira uniformemente en ambos ejes. Coloque las películas en tubos cónicos de 50 mililitros con no más de dos películas por tubo y agregue aproximadamente 25 mililitros de agua desinciso a cada tubo para el vórtice.

Cuando las películas se hayan disuelto, lave las partículas tres veces en agua des ionizada como se ha demostrado. Re-suspender las partículas en aproximadamente un mililitro de agua fresca desimalitizada por tubo después del último lavado. A continuación, congele las partículas a menos 80 grados centígrados durante una hora o liofilización durante la noche.

A la mañana siguiente, vuelva a suspender las micro o nanopartículas liofilizadas a 20 miligramos por mililitro en tampón MES recién preparado con vórtice. Añadir 100 microlitros de la solución de partículas a un tubo de micro centrífuga de polipropileno que contenga 900 microlitros de tampón MES y añadir 100 microlitros de solución EDC NHS recién preparada. Mezclar las partículas por vórtice e incubar las partículas en un inversor a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Al final de la incubación, recoger las partículas por centrifugación y volver a suspender los pellets de micropartículas en un mililitro de PBS por vórtice o volver a suspender las nanopartículas en un mililitro de PBS por cinco segundos de sonicación a dos a tres vatios. A continuación, agregue ocho microgramos de una señal adecuada una proteína y 10 microgramos de anticuerpos CD28 antiratón a las micropartículas, o 16 microgramos de la señal de una proteína y 20 microgramos de CD28 anti mouse a las nanopartículas. Lleve el volumen final en cada tubo a 1,1 mililitros con PBS e incubar las partículas durante la noche en un inversor a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, lave las partículas tres veces en agua des ionizada como se ha demostrado. Estas nanopartículas y micropartículas PLGA se sintetizaron utilizando las técnicas de emulsión única demostradas e imágenes mediante microscopía electrónica de transmisión y barrido. Después de la homogeneización, las micropartículas demostraron un diámetro medio de unos tres micrómetros.

Las micropartículas esféricas tenían una ración de aspecto de aproximadamente una, mientras que las partículas elipsoidales prolatos estiradas en 1D tenían una relación de aspecto mayor de aproximadamente tres y medio y las partículas elipsoidales oblatos estiradas en 2D tenían una relación de aspecto de aproximadamente 1,2, manteniendo aproximadamente una relación de aspecto de una. Los resultados de la eficiencia de conjugación revelan las cantidades similares de proteína en la superficie de las células de presentación de antígenos micro-artificiales esféricos y elipsoidales, o AAPC y nano-AAPC, lo que demuestra que el acoplamiento de proteínas durante la síntesis de AAPC se produce de manera dependiente de la concentración. Se encontró que el AAPC elipsoidal prolato induce mayores niveles de proliferación de células T a dosis de sub-saturación que el AAPC esférico con la mejor separación lograda a una dosis de 01 miligramos.

Después de siete días, el recuento manual de las células T reveló que el AAPC elipsoidal prolato estimula más eficazmente las células T en comparación con sus contrapartes esféricas a escala micro y nano en una manera dependiente de la dosis. Después de este procedimiento, AAPC se puede administrar in vivo para medir su eficacia terapéutica y farmacocinética. Después de su desarrollo, esta técnica ayudó a allanar el camino para que los investigadores en el campo de la inmuno-ingeniería explorar el efecto de la anisotropía en la eficacia de AAPC.