Name: Hígado-en-un-Chip cultivos de hepatocitos primarios y células de Kupffer para infección del Virus de la Hepatitis B (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a cultivar hepatocitos primarios y células de Kupffer en un sistema "hígado-en-un-chip" para estudiar la infección por el Virus de la Hepatitis B. Este modelo 3D permite mantener el tejido hepático por períodos prolongados y evaluar estrategias terapéuticas.

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Este trabajo fue financiado por una subvención de arranque del Consejo Europeo de investigación (637304), un premio de investigador confianza de Wellcome (104771/Z/14/Z) y CN Bio Innovations.

<ol><li>Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture+Models+for+the+Investigation+of+Hepatitis+B+and+D+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li>
<li>Elaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+the+dedifferentiation+process+of+isolated+hepatocytes+and+their+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures.</a> Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).</li>
<li>Konig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+bile+acid+transporter+and+hepatitis+B+virus+receptor+Na%2B%2Ftaurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes.</a> Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).</li>
<li>Ortega-Prieto, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+microfluidic+liver+cultures+as+a+physiological+preclinical+tool+for+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection.</a> Nature Communications. 9 (1), 682(2018).</li>
<li>Allweiss, L., Dandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+cccDNA+in+HBV+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Role of cccDNA in HBV Maintenance.</a> Viruses. 9 (6), (2017).</li>
<li>Guo, J. T., Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+function+of+hepatitis+B+virus+cccDNA%3A+Implications+for+the+development+of+cccDNA-targeting+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics.</a> Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).</li>
<li>Lucifora, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+antiviral+properties+of+TLR+ligands+against+HBV+replication+in+immune-competent+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5390(2018).</li>
<li>Hosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+Virus+Activates+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription+3+Supporting+Hepatocyte+Survival+and+Virus+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+production+of+human+liver+scaffolds+for+functional+tissue+engineering+by+high+shear+stress+oscillation-decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5534(2017).</li>
<li>Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+promote+survival%2C+proliferation%2C+and+maintenance+of+differentiation+of+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).</li>
<li>Hwa, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+survive+without+exogenous+VEGF+in+3D+perfused+co-cultures+with+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes.</a> The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).</li>
<li>Khetani, S. R., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+culture+of+human+liver+cells+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microscale culture of human liver cells for drug development.</a> Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).</li>
<li>March, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+coculture+of+primary+human+hepatocytes+and+supportive+cells+for+the+study+of+hepatotropic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li>
<li>Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176555/">Engineering liver.</a> Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).</li>
<li>Domansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfused+multiwell+plate+for+3D+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering.</a> Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los desafíos en el mantenimiento de cultivos a largo plazo de PHH han impulsado el desarrollo de varios modelos de la cultura con mayor funcionalidad y longevidad, cada uno exhibiendo desventajas y ventajas diferenciales. Ahora es ampliamente reconocido que culturas estáticas 2D de HPH están imitando ciertos aspectos de la biología del hepatocito para una cantidad muy limitada de tiempo. Así, micropatterned cocultures12,13, esferoide culturas14,15, y16,de culturas de hígado-en-un-chip 3D17 rápidamente están reemplazando a estos sistemas más básicos. Especialmente al estudiar las enfermedades infecciosas, que han coevolucionado con su host utilizar microambientes específicos, el requisito de proporcionar ambientes fisiológicos se basa en la naturaleza a menudo difícil de cultivo de humanos-trópico enfermedades infecciosas, incluyendo el virus de la hepatitis C, el VHB y la malaria.
El paso más crítico en la realización de cultivos de hígado en un chip 3D es la calidad de los tipos de célula primaria inicialmente origen. Estas células deben ser probadas para su capacidad de adherencia y sólo lotes PHH plateable deben utilizarse para garantizar la formación de tejido de éxito y generación de cultura. Aunque PHH recién aislado se puede utilizar, su criopreservación es generalmente complicada y requiere congeladores controlados por tasa especiales.
En contraste con las culturas 2D estáticas convencionales, el fondo genético de host es despreciable con respecto a la susceptibilidad a la infección de HBV, y todos los donantes de hepatocitos probado así lejos son capaces de establecer HBV infección4.
Aunque HBV derivados del paciente establece infecciones de culturas 3D, es imperativo utilizar PEG-precipitado y sacarosa amortiguador purificado VHB cuando utilizando inducible HBV productor célula líneas para la generación de inóculo viral. Sobrenadantes de cultivo celular directamente aplicados a cultivos de hígado-en-un-chip 3D, ya sea a través de la presencia de factores inhibitorios o debido a una incompatibilidad de factores de crecimiento presentes con hepatocitos, no fácilmente causar infecciones. Además, al seleccionar el inóculo viral derivados del paciente, sólo suero debe usarse, ya que plasma inevitablemente se coagula y obstruye la circulación de microfluídica de la plataforma de cultura.
Independientemente del inóculo viral usado, asegurando la viabilidad celular y la diferenciación, así como garantizar la completa eliminación del inóculo inicial de HBV, es clave para el éxito a largo plazo estudios de infección. La manera más conveniente de hacer esto es muestreo de culturas tras la eliminación del inóculo viral, así como la medición de los niveles de albúmina sérica humana durante todo el período de la cultura. De la nota, del mismo modo a todas las demás plataformas descritas, la infección de HBV, una vez establecida, no fácilmente se extiende a las células no infectadas. El mecanismo subyacente para esto sigue siendo evasivo ya que vivo en la infección de HBV infecta fácilmente a la mayoría de los hepatocitos en el hígado.
Con respecto a cocultures de HPH con células de Kupffer, es recomendable realizar pruebas de muchas de las células de Kupffer para evaluar la secreción de IL6 y TNFα en respuesta al estímulo de los LPS, ya que no todos donantes de células de Kupffer comercialmente disponibles tienen una sensibilidad igual.
Lo importante, para todos los tratamientos con fármacos o infección inicial de las culturas con el VHB, el volumen total del pozo (1,4 mL), así como el canal de microfluidos (0,2 mL), debe tenerse en cuenta para el cálculo de las concentraciones de droga o inóculo. Para asegurar una dosificación exacta, se realiza un paso de lavado con medio que contiene VHB o drogas para cebar el canal microfluídico.
La plataforma utilizada utiliza PHH 600.000 por bien, que asegura hepatocitos varias capas dentro de los andamios. Aunque se puede variar el número de células, la concentración celular elegido garantiza resultados óptimos. El formato de la placa tiene un total de 12 andamios, que puede actualizarse a 36 andamios. Sin embargo, debido a requisitos de microfluidos, escalado a números más altos bien no es posible hasta la fecha.
Con estos enfoques, culturas pueden ser mantenidas con un rendimiento óptimo de la célula durante al menos 40 días, que, hasta el momento, ofrece oportunidades sin precedentes para evaluar a nuevos fármacos candidatos, así como estudiar la compleja interacción entre diferentes células hepáticas poblaciones durante la infección de HBV.

El estudio de HBV ha sido complicado por la pobre sensibilidad de los sistemas de cultivo, que requiere varios cientos o miles de copias de genoma HBV por la célula para iniciar la infección1. Además, hepatocitos humanos primarios generalmente son extraordinariamente frágiles y rápidamente dedifferentiate en cultivos convencionales2. Esto es debido principalmente al hecho de que las superficies de plástico planas y duras no mímico natural ambiente extracelular en el hígado y la falta de oxigenación de los cultivos en la ausencia de circulación de microfluidos. Cultivos de hepatocitos estático convencional en las placas revestidas de colágeno rápidamente dedifferentiate y perder su susceptibilidad a la infección de VHB3. Aquí, describimos la configuración y la infección de HPH en 3D culturas del hígado-en-un-chip, que son enormemente ventajosas sobre culturas PHH estáticas 2D convencionales en placas recubiertas de colágeno debido a su prolongada competencia metabólica y funcional, facilitando cultivos a largo plazo de al menos 40 días4. En este sistema, HPH se siembran sobre andamios recubiertos de colágeno, que continuamente son perfundidos con medio de cultivo para suministrar oxígeno y nutrientes a las células. A pesar de que los sistemas de cultivo alternativos para PHH basan en complejo cocultures de crecimiento 3D en esferoides o fibroblastos murinos han sido validados y son susceptibles a la infección de HBV con multiplicidades de infección de los equivalentes de genoma 500 (GE) de HBV por célula, 3D hígado-en-un-chip culturas siguen siendo el sistema de único modelo in vitro susceptible a 0.05 GE de HBV por celular4. Esto está además avalado por la necesidad de utilizar altas concentraciones de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y polietilenglicol (PEG) para establecer la infección de HBV en estas culturas, que es prescindible para la infección de los sistemas de cultivo de hígado-en-un-chip 3D 4. entre las principales características distintivas del HBV infección es la piscina de cccDNA, que actúa como plantilla transcripcional para todos de novo–producen viriones5,6. A pesar de cccDNA puede ser detectada en cultivos de hepatocitos convencional7,8, sigue siendo confuso en cuanto a si la regulación de cccDNA y los enfoques terapéuticos destinados a su eliminación son recapitulados en parcialmente o hepatocitos completamente dedifferentiated. Hemos demostrado que cccDNA funcionalmente se forma en las culturas de hígado-en-un-chip 3D, responde a los estímulos fisiológicos y puede orientarse al interferir con la accesibilidad de la maquinaria transcripcional del genoma cccDNA del4.
Respuestas de anfitrión a la infección por HBV en 3D imitador de hígado-en-un-chip aquellos observados en pacientes infectados por el VHB, lo que permite la identificación de biomarcadores de la infección, así como éxito terapéutico. Entre las características únicas de las culturas del hígado-en-un-chip es la capacidad de evaluar las respuestas a largo plazo de host entre PHH y otras nonparenchymal las células dentro del hígado, incluyendo Kupffer células4células radiadas9y sinusoidal del hígado las células endoteliales10,11. Esto ofrece una oportunidad única para evaluar las interacciones célula/en un microambiente 3D complejo.
Además, el período extendido de la cultura de esta plataforma facilita la evaluación de los tratamientos farmacológicos secuencial y su impacto en la persistencia del VHB, que no son posibles con los sistemas de cultivo convencionales del hepatocito.
Este protocolo describe cómo 3D hígado-en-un-chip se generan culturas, monocultivos de HPH o cocultures de HPH con células de Kupffer. Además, se describe la producción de HBV purificada para los estudios de los baja multiplicidad de infección, así como el posterior análisis de host y respuestas virales.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes></E fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>William's Medium, sin rojo fenol</td><td>GIBCO</td><td>A12176-01</td><td></td></tr><tr><td>Medio de descongelación de hepatocitos</td><td>GIBCO</td><td>CM7500</td><td></td></tr> Suplementos primarios <tr><td>de descongelación y siembra de hepatocitos GIBCO</td><td></td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Suplementos de mantenimiento de hepatocitos primarios</td><td>GIBCO</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMEM avanzado</td><td>GIBCO</td><td>12491023</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos no esenciales (NEAA) 100x</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, origen EE. UU., Inactivado por calor, filtrado estéril, apto para cultivo celular</td><td>SIGMA</td><td>12106C</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>SIGMA</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de piel de becerro</td><td>Merck</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>SIGMA</td><td>G418-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>SIGMA</td><td>T3258</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol 8000</td><td>SIGMA</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>SIGMA</td><td>SO389</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sodio anhidro</td><td>SIGMA</td><td>451614-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>SIGMA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>SIGMA</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico, 99.999%</td><td>SIGMA</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehído</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina (humana)</td><td>SIGMA</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagent&nbsp; Albúmina sérica bovina, fracción V, tratada con choque térmico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9701-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, sin UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>Applied Biosystems 4472903</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacárido de Escherichia coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kits/Consumibles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana estéril</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip placa de cultivo celular de perfusión</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC12</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip tapa de la placa de cultivo</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro redondo estéril</td><td>CN Bio innovations LC-SC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andamio de fijación</td> celular <td>CN Bio innovations LC-SC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anillo de retención</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Émbolo estéril</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-ST</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy kit de sangre y tejidos</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo Luminex magnético humano</td><td>R& Solución</td> de sustrato Ultra TMB-ELISA de 1 paso de D Systems <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Mini juego de accesorios de ARN viral Qiagen</td><td>1048147</td><td>que contiene un transportador de ARN</td><td>Millicell</td></tr><tr><td>HY Matraz de cultivo celular de 5 capas, T-1000, estéril</td><td>Millipore (Merck)</td><td></td><td></td>PFHYS1008</tr><tr><td>Placa de reacción óptica MicroAmp de 384 pocillos con tecnologías de vida útil de código de barras</td><td></td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías de vida</td> de<td>película adhesiva óptica MicroAmp</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Placas inmuno no estériles de 96 pocillos transparentes de fondo plano</td><td></td> Cinta de sellado <td>ThermoFisher Scientific</td> 442404 <td></td></tr><tr><td>para placas de 96 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de tapa de botella desechables estériles de flujo rápido de Nalgene con membrana PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>295-3345</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Portaobjetos Microscópicos con Bordes Rectificados, Twin Frost</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB58628</td><td></td></tr><tr><td>Tubo, Pared Delgada, Ultra-Transparente, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Células primarias / Líneas celulares</ </td> Hepatocitos Placables Humanos Strong>Humano, Transportador Calificado Thermo Fisher Scientific HMCPTS Células de Kupffer Humanas Thermo Fisher Scientific HUKCCS Línea celular HepDE19 Haitao Guo (Universidad de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Indiana, IN, EE. UU.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> NameCompany<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> </td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Primers/Sondas/Estándares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBV DNA forward primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA probe</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA</td></tr><tr><td>pgRNA cebador reverso</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'pgRNA</td></tr> <tr><td>cebador inverso</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'RPS11</td></tr> <tr><td>imprimación directa</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'RPS11</td></tr> <tr><td>cebador inverso</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-ATGTCCAGCCCCTCAGAACTTC-3'pCMV-HBV</td></tr> <tr><td></td><td>Profesor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, EE. UU.)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nombre</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fracción IgG del antígeno central del virus de la hepatitis B (policlonal)</td><td>DAKO</td><td>descontinuado</td><td>Lote 10102505</td></tr><tr><td>Anticuerpo de albúmina humana, A80-129A</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-129A</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de adsorción cruzada de albúmina humana, A80-229P</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-229P</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#&nbsp; A-11072</td><td>Lote 1431810</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte><</td><td>fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte>Bomba de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>vacío LiverChip</td><td>CN Bio innovaciones</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>Conexión neumática LiverChip</td><td>CN Bio innovaciones</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma LiverChip</td><td>CN Bio innovaciones</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip muelle de lavado de placas</td><td>CN Bio innovaciones Pinza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metálica esterilizable en autoclave</td><td>VWR</td><td>232-0106</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Industrias científicas</td><td>SKU: SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima XPN-80 Beckman</td><td>Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004500</td><td></td></tr><tr><td>SAM-12 Succión médica de alto vacío y alto flujo</td><td>MGE en todo el mundo</td><td>&nbsp; SAM12/01010101</td><td></td></tr><tr><td>SERIE NUAIRE 5800 incubadora</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5841</td><td></td></tr><tr><td>Torgue de precisión automatizado</td><td>Innovaciones CN Bio Par</td><td></td><td></td></tr><tr><td>manual</td><td>Innovaciones</td><td></td><td></td>CN Bio</tr><tr><td>Compresor LiverChip</td><td>Innovaciones CN Bio Luminex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LX-200 Instrumento con xPONENT 3.1</td><td>Luminex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millipore Bloque Separador Magnético de Mano</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Millipore&trade; 40-285</td><td></td></tr><tr><td>FluoStar Optima Lector de Placas</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLVER Destornilladores eléctricos de precisión</td><td>VTECH ltd</td><td>FAB10RE/FR</td><td></td></tr><tr><td>KOLVER Fuente de alimentación</td><td>VTECH ltd</td><td>EDU1FR</td><td></td></tr><tr><td>BAMBI VTS75D</td><td>Equipo de aire</td><td>Descatalogado</td><td></td></tr> Sistema de <tr>PCR en tiempo real <td></td> Integra<td>Vacuboy</td><td></td> INTEGRA ViiA 7 con bloque de 384 pocillos ThermoFisher Scientific 4453536 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

"hígado-en-un-chip" cultivos de hepatocitos primarios y células de kupffer para infección del virus de la hepatitis b

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

A pesar de la excepcional infectividad de lo virus de la hepatitis B (VHB) en vivo, donde sólo tres genomas virales pueden resultar en una cronicidad de chimpancés infectados experimentalmente, más modelos in vitro requieren varios cientos de miles de genomas virales por la célula en orden para iniciar una infección transitoria. Además, culturas estáticas 2D de hepatocitos humanos primarios (PHH) permitan solamente a corto plazo estudios debido a su rápida diferenciación. Aquí, describimos a culturas de hígado-en-un-chip 3D de HPH, en monocultivos o en cocultures con otras células de hígado-residente de nonparenchymal. Estos ofrecen una mejora significativa al estudio de la infección por el VHB a largo plazo con respuestas de host fisiológica celular. Además de facilitar los estudios de eficacia de medicamentos, análisis toxicológico e investigaciones en patogenesia, estos sistemas de microfluidos cultura permiten la evaluación de terapias curativas para la infección de HBV, destinados a eliminar covalentemente cerrado, circular (ccc) ADN. Presenta método describe la instalación de monocultivos PHH y co-cultivos de células de Kupffer/PHH, la infección con el VHB purificado y el análisis de las respuestas del host. Este método es especialmente aplicable a la evaluación de los efectos a largo plazo de infección de HBV, combinaciones de tratamiento y patogénesis.

Describimos una plataforma simple y versátil para la cultura a largo plazo de las células de Kupffer humanas primarias o hepatocitos y su infección con el VHB. Las células humanas primarias se siembran sobre andamios de poliestireno recubiertas de colágeno dentro de un conjunto de placa microfluídica, que perfuses continuamente las células con medio de cultivo (Figura 1a).
HPH, que generalmente sólo son estables para una cantidad limitada de tiempo en sistemas de cultivo convencionales, funcionalmente se puede mantener durante largos períodos de tiempo. Albúmina humana, que es secretada por los hepatocitos funcionales y es considerada el mejor marcador para la evaluación del metabolismo hepático, es estable y altamente expresada por culturas 3D hasta el día 40 posterior siembra (figura 2). Para cocultures, viabilidad y funcionalidad de células de Kupffer pueden evaluarse por la secreción de citocinas específicas (por ejemplo, IL6 y TNFα). Para medir la producción de citoquinas, se recomienda el uso de medios de detección captura sobre el estímulo de LPS de cocultures (figura 3).
Las células forman microtissues hepática, generalmente dentro de 3 días de la siembra de HPH, demostración de canalículos biliares funcionales y polarización celular completa (figura 2). Además de mantener su metabolismo celular fisiológico, estas culturas se convierten en extraordinariamente susceptibles a la infección de HBV. ADN de VHB y otros marcadores virales, en contraste con otros sistemas de cultivo, se convierten en fácilmente detectables de post-infección día 2 (figura 4). Además secretados marcadores de infección viral, que contiene hepatocitos andamios pueden ser obtenidos de las culturas y utilizados para la detección de inmunofluorescencia de antígenos virales (p. ej., HBsAg, nucleocápsida) (figura 4). En cultivos de hepatocitos convencionales requieren inoculación con al menos 500 GE de HBV por celular y la adición de DMSO 2% y 4% PEG, tan sólo 0,05 HBV GE son capaces de iniciar la infección en 3-d culturas sin el requisito de DMSO o PEG (figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg"> Figura 1: configuración de las culturas de hígado-en-un-chip 3D. (a) se trata de un diseño esquemático para el montaje de la placa de cultivo con el fin de asegurar el establecimiento de la circulación de microfluidos. (b) este panel muestra una vista cercana de los pozos de la cultura, incluyendo el papel de filtro, el andamio y el anillo de retención. (c) este panel muestra el proceso de equilibrio de la placa antes de la siembra de los cultivos. Los siguientes dos paneles muestran el proceso de la siembra de monocultivos de hepatocitos (d) y (e) hepatocito/Kupffer célula cocultures. (f) este panel muestra los pasos de lavado en medio cambios. (g) este panel muestra la configuración de la infección de HBV, incluida la eliminación de inóculo. S.M. = medio de siembra, M.M. = medio de mantenimiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg"> Figura 2: viabilidad formación y hepatocito hepática microtissue. (a) este panel muestra imágenes de brightfield longitudinal del monocultivo del hepatocito 3D demostrando la formación de microtissue después de siembra. (b) este panel muestra imágenes de inmunofluorescencia de las culturas de los núcleos (azul) y albúmina humana (verde). (c) este panel muestra albúmina total longitudinal, así como por la célula ajusta producción de albúmina, durante 40 días de los monocultivos de hepatocitos, determinados por ELISA. Los datos son medias ± SD Esta figura se ha adaptado de Ortega Prieto et al4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg"> Figura 3: funcionalidad de células de Kupffer en 3-d cocultures. Estos paneles muestran la secreción de (un) IL6 y (b) TNFα en monocultivos de hepatocitos y células de Kupffer/hepatocitos cocultures 11 días post siembra en respuesta a LPS exógeno agregados en día 9 post siembra, como determinó humano magnético Ensayo de Luminex. Esta figura se ha adaptado de Ortega Prieto et al4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg"> Figura 4: la infección por VHB en las culturas del hígado-en-un-chip. (a) este panel muestra la detección de la microscopia de inmunofluorescencia de la nucleocápsida (rojo), HBsAg (verde) y los núcleos (azul) 10 días después de la infección de las culturas con el VHB. (b) este panel muestra la susceptibilidad de los cultivos a la infección de HBV utilizando diferentes multiplicidades de infección, según lo determinado por una cuantificación de la DNA de HBV en los sobrenadantes de cultivo. (c) este panel muestra la cuantificación de la acumulación longitudinal de VHB pgRNA en relación con el gen housekeeping RPS11. Los datos son medias ± SD Esta figura se ha adaptado de Ortega Prieto et al4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía paso a paso para realizar experimentos 3D "hígado-en-un-chip" infección con el virus de la hepatitis B.

"Hígado-en-un-Chip" cultivos de hepatocitos primarios y células de Kupffer para infección del Virus de la Hepatitis B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en infecciones hepatotrópicas y campos de enfermedad hepática. Como la contribución de las poblaciones de células residentes en el hígado, a la patogénesis viral, la cinética de infecciones longitudinales, los mecanismos de replicación viral, la invasión inmune, en un sistema de modelos fisiológicos y estudios de pruebas de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de recapitular un microambiente hepático.Que se puede mantener durante largos períodos de tiempo y es naturalmente susceptible a la infección por hepatitis B a niveles fisiológicos relevantes. Esto ha sido anteriormente una restricción fundamental en el campo de la hepatitis B. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de la infección por VHB porque los estudios de pruebas de drogas se pueden realizar en una plataforma fisiológica para largas duraciones.Esto permite la evaluación de tratamientos farmacológicos secuenciales junto con el análisis de la eficacia de las estrategias de tratamiento existentes y novedosas. Este método puede proporcionar comprensión en la hepatitis B, y también se puede aplicar a otros estudios de la enfermedad, incluyendo otras infecciones hepatotrópicas, enfermedades hepáticas, o estudios de metabolismo de drogas. Generalmente, individuos nuevos en este método lucharán, porque requiere atención a detalles particulares para permitir el mantenimiento exitoso del tejido hepático durante largos períodos de tiempo.Y también la familiarización con las herramientas y equipos especializados. La demostración visual de este método es fundamental. Incluyendo el montaje de las placas, así como la descongelación y la siembra de las células.Dado que los pasos involucrados en el cultivo a largo plazo de las células derivadas del hígado son difíciles cuando se utiliza un nuevo sistema de cultivo. En primer lugar, encienda el compresor y la bomba de vacío asociada con la plataforma de chip hepático. Proceda a un gabinete de tubo de vidrio para ensamblar y equilibrar las placas.Coloque una membrana estéril en la base de la placa para comenzar a ensamblar asépticamente las placas microfluídicas. Asegurarse de que la membrana estéril descansa suavemente sobre los dos pines de la placa base. A continuación, agregue la placa superior que contiene bien.Agregue una tapa de placa estéril. Y utilice un par de precisión automatizado, establecido en 33 libras. Usando una secuencia de apriete en espiral para apretar los tornillos en la base de la placa.Usando un par manual, asegúrese de que todos los tornillos estén apretados a 35 libras. A continuación, precalentar la siembra de hepatocitos de media a 37 grados celsius antes del cebado. Coloque la placa completamente montada en el muelle de lavado.Y asegúrese de que la placa encaje completamente. Añadir 400 microlitros de medio de siembra de hepatocitos al lado del depósito de cada pozo para preparar la placa. Después de esto, inicie el flujo en la dirección ascendente durante 3,5 minutos a un microlitro por segundo.Los indicadores rojos en el lado de la placa indicarán si la circulación microfluídica funciona correctamente. Una vez que el medio se bombea al lado de crecimiento celular de la placa, añadir 1,2 mililitros adicionales de medio de siembra de hepatocitos. Transfiera cuidadosamente la placa a la estación de acoplamiento dentro de una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% co2.Inicie el flujo en la dirección ascendente a un caudal de un microlitro por segundo durante 16 horas. Después de esto, transfiera el plato a un muelle de lavado. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para eliminar cualquier burbuja.Usando un fórceps estéril, agregue un papel de filtro redondo estéril a cada podé. A continuación, agregue un andamio de unión a la celda y un anillo de retención a cada pozo. Utilice un émbolo estéril para empujar hacia abajo cada pozo y bloquear los anillos de retención y andamios en su lugar.A continuación, aspirar todo el medio. Y agregue suavemente 400 microlitros de medios de siembra de hepatocitos precalentados sobre el andamio. Inicie el flujo en una dirección descendente a un microlitro por segundo durante 3 minutos y medio.Aspirar todo el medio bombeado fuera del lado del depósito de la placa. Añadir 1,4 mililitros de medio de siembra de hepatocitos a cada pozo. A continuación, vuelva a colocar la placa en el muelle para llevar el volumen total por pozo hasta 1,6 mililitros.En primer lugar, precalentar el medio de descongelación de hepatocitos y la siembra de hepatocitos de media a 37 grados centígrados. A continuación, descongelar un vial de hepatocitos humanos primarios de acuerdo con las instrucciones del proveedor. En un armario de tubo de vidrio, resuspender las células en un mililitro de medio de siembra de hepatocitos.A continuación, coloque las células resuspendidas sobre hielo. Usando el azul de tripano, cuente las células para asegurarse de que la viabilidad de las células está por encima del 90% Transfiera la placa completamente montada al muelle de lavado. Y aspirar todo el medio de los pozos.Recupera las células del hielo y añade 600.000 hepatocitos a cada pozo en un volumen de 500 microlitros de medio de siembra de hepatocitos. Inicie el flujo en la dirección descendente a un caudal de un microlitro por segundo. Añadir 900 microlitros de medio de siembra de hepatocitos a cada pozo para llevar el volumen total en cada uno a 1,6 mililitros.Transfiera la placa a la estación de acoplamiento dentro de una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y con un 5% de CO2. Inicie el flujo en la dirección descendente a un caudal de un microlitro por segundo durante ocho horas. Después de esto, invierta el flujo hacia arriba a un caudal de un microlitro por segundo durante ocho horas.A continuación, transfiera la placa al muelle de lavado y aspire todo el medio de los pozos. Añadir 400 microlitros de medio de mantenimiento de hepatocitos a cada pozo. E inicie el flujo en la dirección descendente a un caudal de un microlitro por segundo durante 3 minutos y medio.A continuación, aspirar todo el medio del depósito, y añadir 1,4 mililitros de medio de mantenimiento de hepatocitos. Transfiera la placa a la estación de acoplamiento dentro de una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% co2. Inicie el flujo en la dirección ascendente a un caudal de un microlitro por segundo durante 48 horas.Después de 48 horas, lave el plato transfiriéndolo al muelle de lavado. Aspirar todo el medio de los pozos. Y añadir 400 microlitros de medio de mantenimiento.E inicie el flujo en la dirección descendente en un microlitro por segundo durante 3,5 minutos. A continuación, aspirar todo el medio que aparece en el lado del depósito de los pozos. Añadir 1,4 mililitros de medio de mantenimiento de hepatocitos.A continuación, transfiera la placa de vuelta a la estación de acoplamiento de la incubadora humidificada. Inicie el flujo en la dirección ascendente a un caudal de un microlitro por segundo durante 48 horas. Sustituya el medio con este proceso de lavado y reemplazo cada 48 horas.Los hepatocitos humanos primarios generalmente sólo son estables durante una cantidad limitada de tiempo cuando se utilizan sistemas de cultivo convencionales. Sin embargo, utilizando el protocolo descrito aquí, se pueden mantener funcionalmente durante períodos de tiempo prolongados. La albúmina humana es secretada por hepatocitos funcionales, y se considera que es el mejor marcador para evaluar la funcionalidad hepática.La albúmina es vista estable y muy expresada por las culturas 3D hasta al menos el día 40 después de la siembra. Para los co-cultivos, la funcionalidad y la viabilidad de las células de Kupffer se evalúan midiendo la secreción de citoquinas específicas. Como se ve aquí, los niveles medidos de ALFA IL-6 y TNF indican que las células fueron funcionalmente mantenidas y viables.Además de conservar su metabolismo celular fisiológico, estos cultivos se volvieron excepcionalmente susceptibles a la infección por el VHB. El ADN del VHB y otros marcadores virales son fácilmente detectables desde el segundo día después de la infección. Mientras que los cultivos convencionales requieren inoculación con al menos 500 equivalentes del genoma del VHB complementados con DMSO y PEG, estos cultivos 3D están infectados con tan poco como 05 equivalentes del genoma sinabastecimiento.Además de los marcadores secretos de infección viral, los andamios que contienen hepatocitos se recuperan de estos cultivos. La microscopía de inmunofluorescencia revela que estos andamios contienen antígenos virales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar ser suave al manipular los hepatocitos antes de la siembra para evitar la muerte celular.Además, es esencial asegurarse de que las placas están correctamente montadas y todos los canales de flujo están permitiendo la correcta circulación de medios antes de sembrar los hepatocitos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunofluorescencia para responder preguntas adicionales. Incluyendo la ubicación y frecuencia de las células infectadas dentro del tejido.El estado fisiológico de los hepatocitos también se puede evaluar mediante la tinción de albúmina o estructuras hepáticas, incluida la proteína de unión estrecha ZO-1. Después de este desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la virología exploren la infección por hepatitis B y las respuestas inmunitarias en un sistema modelo 3D fisiológico. No olvide que trabajar con el virus de la hepatitis B puede ser peligroso, y las precauciones como la vacunación previa, el uso de EPI adecuado y el trabajo bajo las pautas adecuadas de bioseguridad siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

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Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

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"Hígado-en-un-Chip" cultivos de hepatocitos primarios y células de Kupffer para infección del Virus de la Hepatitis B

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