Name: Cultivo y manipulación de células de la cresta Neural O9-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a cultivar y manipular células de la cresta neural O9-1 de ratón mediante técnicas de siRNA y CRISPR-Cas9. Este protocolo permite estudiar biología del desarrollo y diferenciación celular.

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Nicole Stancel, pH.d., ELS, de publicaciones científicas en el Instituto del corazón de Texas, proporcionó apoyo editorial. También agradecemos a las siguientes fuentes de financiación: subvención de desarrollo de la American Heart Association nacional centro científico (14SDG19840000 a J. Wang), el Premio de investigación Lawrence de 2014 de la Rolanette y Berdona Lawrence hueso enfermedad programa de Texas (a J. Wang ) y los institutos nacionales de salud (DE026561 y DE025873 J. Wang, DE016320 y DE019650 a R. Maxson).

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<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li>
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<li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway%3A+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li>
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<li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo%2FYap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38(2016).</li>
<li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li>
<li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+organ+development%2C+homeostasis%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li>
<li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li>
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<li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118(2015).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li>
<li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208(2016).</li>
<li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li>
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<li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li>
<li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El NCC es un versátil y clave a diferentes tejidos y órganos durante la morfogénesis embrionaria. La línea celular O9-1 mantiene su potencial para diferenciarse en muchos tipos de células diferentes y simula las características en vivo de la NCCs, convirtiéndolo en una herramienta útil en vitro para estudiar la función génica y regulación molecular de la NCCs. Del estado diferente de células O9-1 puede corresponder a diferentes nervios de la cresta progenie en vivo, dependiendo de las condicion...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 &#181;M beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 &#181;M dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 &#181;g/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 &#181;M dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Las células de la cresta neural (NCCs) son células madre multipotentes con una notable capacidad migratoria y existencia transitoria durante el desarrollo embrionario. NCCs se originan entre el ectodermo superficial y el tubo neural y migran a otras partes del embrión durante el desarrollo embrionario1. Basado en sus dominios funcionales, NCCs pueden clasificarse en varios tipos, incluyendo craneal, tronco, vagal, sacro y cardiaca NCCs. Además, la NCCs pueden diferenciarse en varios linajes celulares, como las células musculares lisas, células óseas y las neuronas y dan lugar a diferentes tejidos2,3. El desarrollo de la NCCs se caracteriza por una compleja serie de eventos morfogenéticos que son afinados por varias señales moleculares. Dada la compleja regulación de la NCCs y sus importantes contribuciones a numerosas estructuras, la desregulación del desarrollo del NCC comúnmente puede conducir a defectos congénitos de nacimiento, que representan casi el 30% de defectos de nacimiento congénitos humanos todos. Anormalidades durante el desarrollo de la cresta neural pueden provocar labio leporino/paladar hendido, defectos defectos de formación de la nariz, síndromes, como el tracto de salida cardíaco defectuoso o incluso mortalidad1,4,5, 6 , 7. comprender los mecanismos moleculares del desarrollo de la NCC es importante para el desarrollo de tratamientos para enfermedades causadas por defectos en el desarrollo de la NCC. Con el uso de varios in vitro e in vivo acerca a8,9,10,11,12,13,14 ,15, han realizado progresos considerables en la investigación de NCC. In vivo, modelos animales, como pollos, anfibios, peces cebra y ratones, se han utilizado para investigar la NCCs1. Además, los embriones humanos se han utilizado para estudiar el proceso de migración de NCC en el temprano desarrollo de embrión humano16. In vitro, modelos de celulares de la NCCs, como NCCs humana que se originaron en paciente grasa subcutánea, se han utilizado para investigar la enfermedad de Parkinson17. La línea O9-1 NCC, que fue derivada originalmente de cultivos masivos de NCCs endógena aislada de embriones de ratón E8.518, es un modelo de celular de gran alcance para estudiar la NCCs. lo importante es que, bajo condiciones de cultivo no diferenciar, O9-1 células NCCs como vástago multipotent. Sin embargo, bajo diferentes condiciones de cultivo, las células O9-1 se pueden distinguir en tipos distinguidos de la célula, como las células musculares lisas, osteoblastos, condrocitos y células gliales18. Dadas estas propiedades, las células O9-1 se han utilizado ampliamente para estudios relacionados con la NCC, como investigar el mecanismo molecular de defectos craneales facial19,20.
Aquí, protocolos detallados se proporcionan para mantener las células O9-1, diferenciando las células O9-1 en diferentes tipos celulares y manipular células O9-1 mediante la realización de estudios de pérdida de función del gene con la edición del genoma Cas9 CRISPR y ARN interferente pequeño (siRNA)- mediada por tecnologías de precipitación. Como un ejemplo representativo, se describe el uso de células O9-1 estudio de Yap y Taz -de-función de pérdida. Yap y Taz son los efectores corriente abajo del hipopótamo señalización camino, que juega un papel fundamental en la proliferación celular, diferenciación y apoptosis. La vía Hipona también se ha demostrado para ser importante en el desarrollo y la homeostasis de varios diferentes tejidos y órganos, así como en la patogénesis de diferentes enfermedades20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Los componentes básicos del hipopótamo de señalización incluyen el tumor supresor estéril 20-como las quinasas Mst1/2 WW que contiene el dominio Salvador proteína y las quinasas de homólogo (Lats1/2) de supresor de tumor grande. Señalización de hipopótamo inhibe la actividad de Yap y Taz y promueve su degradación en el citoplasma. Sin represión de Hippo, Yap Taz translocan en núcleos y funcionan como activadores transcripcionales de cooperación. Recientemente demostramos que inactivar específicamente el hipopótamo señalización efectores Yap y Taz en el ratón la NCCs utilizando Wnt1cre y controladores de Wnt1Cre2SOR dio lugar a mortalidad embrionaria en E10.5 con severa defectos craneofaciales20. También hemos realizado estudios usando células O9-1 para investigar el papel de Yap y Taz en la NCCs. Para estudiar la función Yap y Taz en la NCC proliferación y diferenciación, Yap y Taz caída células obtuvieron en O9-1 células utilizando siRNA, y células de nocaut de Yap se generaron utilizando CRISPR Cas9 edición del genoma. Las mismas estrategias de pérdida de función del gene se pueden aplicar a genes diferentes en otras vías. Además, estudios de ganancia de función y ensayos de transfección pueden aplicarse también a células O9-1 para estudiar la regulación y función génica. Los protocolos descritos aquí están destinados a ser utilizados por investigadores como guías para el cultivo de células de O9-1 para mantener la troncalidad multipotent, para diferenciar las células O9-1 en otros tipos de células bajo condiciones de cultivo diferentes y para estudiar la función genética y los mecanismos moleculares de la NCCs.

<table><tbody><tr><td>Células alimentadoras de STO activas</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1503</td><td>También disponible en forma inactivada por mitomicina C, catálogo # Línea celular de</td></tr><tr><td>cresta neural craneal de ratón</td> ATCC 56-X O9-1 <td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto en glucosa, sin glutamina</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS (suero fetal bovino)</td><td>Millipore Sigma</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina - estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25% en HBSS</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) sin calcio o magnesio</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales (MEM NEAA) 100Xx</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO factor inhibidor de la leucemia (LIF) 106 unidad/mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos humanos recombinante-básico (rhFGF-básico)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>matriz Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsulfóxido)</td><td>Millipore Sigma</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x)</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo, alfa 1x con sales de Earle, ribonucleósidos, desoxirribonucleósidos, & L-glutamina</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-041057</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Yap1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-046247</td><td></td></tr><tr><td>FCS (suero fetal de ternero)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ITS (insulina-transferrina-selenio)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF-b3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td><td></td><td></td><td></td>ascórbico</tr><tr><td>BMP2 (proteína morfogenética ósea 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suplemento</td> de dexametasona <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cultivo y manipulación de células de la cresta neural o9-1

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Las células de la cresta neural (NCCs) están migrando las células madre pluripotentes que pueden diferenciarse en diversos tipos celulares y dar lugar a múltiples tejidos y órganos. La línea celular O9-1 se deriva de la endógena NCCs embrionaria del ratón y mantiene su multipotencia. Sin embargo, bajo condiciones de cultivo específicas, O9-1 células pueden diferenciarse en diversos tipos celulares y ser utilizadas en una amplia gama de aplicaciones de investigación. Recientemente, con la combinación de estudios con ratones y estudios del O9-1 celular, hemos demostrado el hipopótamo señalización efectores vía Yap y Taz desempeñan papeles importantes en el desarrollo craneofacial derivado de cresta neural. Aunque el proceso de cultivo de células O9-1 es más complicado que para otras líneas celulares, la línea celular O9-1 es un potente modelo para la investigación de NCCs in vitro. Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo de la línea celular de O9-1 para mantener su troncalidad, así como protocolos para diferenciar las células O9-1 en diferentes tipos celulares, como las células musculares lisas y los osteoblastos. Además, se describen los protocolos para realizar estudios de pérdida de función del gene en células O9-1 mediante eliminación de Cas9 CRISPR y caída de mediada por RNA interferente pequeños.

El objetivo de nuestros experimentos de caída y golpe de gracia fue estudiar los efectos de Yap y Taz pérdida-de-función en células O9-1. Antes de los experimentos de precipitación y golpe de gracia, tenemos que asegúrese de que preparar para los medios basales y células en cultivo O9-1 como se describe anteriormente (por ejemplo, la membrana del sótano matriz necesidades para cubrir la placa entera como se muestra en la figura 1y las célula...

O9-1 es una línea de células de cresta neural ratón pluripotentes. Aquí describimos protocolos detallados paso a paso para cultivar células O9-1, diferenciar células O9-1 hacia tipos celulares específicos y manipular genéticamente las células O9-1 mediante caída mediada por siRNA o CRISPR Cas9 edición del genoma.

Cultivo y manipulación de células de la cresta Neural O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

La línea celular O9-1 es una herramienta muy útil para estudiar las células de la cresta neural in vitro. Tiene un gran potencial para su uso en una amplia gama de aplicaciones en varios usos de la investigación. Las células O9-1 tienen ventajas obvias, como el fácil acceso, y la obtención rápida de números de células suficientes para experimentos, por lo que es un método poderoso complementario a los estudios in vitro de las células de la cresta neural.Para empezar, prepare medios basales para el cultivo celular O9-1, de acuerdo con el protocolo de texto. Luego, filtre el medio basal y envuélvalo en papel de aluminio para protegerlo de la luz. Después de esto, recoja los medios basales condicionados de una célula STO activada de acuerdo con el protocolo de texto.En primer lugar, descongelar una alícuota de matriz de membrana del sótano sobre hielo durante dos horas. A continuación, diluir la matriz de membrana del sótano con DMEM esterilizado filtrado con 10%FBS a una concentración final de 0,5mg/ml. Recubrir la placa con la matriz de membrana del sótano a temperatura ambiente durante una hora.A continuación, aspirar la matriz de membrana del sótano mientras se inclina la placa. S

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Para cultivar las células troncales de la cresta neural (NCSC) in vitro, un medio especial (NCSCM) es necesario. Parte esencial de NCSCM es el extracto de embrión de pollo (CEE). Se describen las técnicas precisas para producir una cantidad al máximo de calidad en estado puro y de alta CEE, incluyendo detalles como el aislamiento, la maceración, la centrifugación, y los procesos de filtración.

La producción de extracto de embrión de pollo para el Cultivo de murino crestas de células neurales madre

Aislamiento de cresta neural embrionario del tubo neural facilita el uso...

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

Este video demuestra el uso de ARN interferente pequeño (siRNA) para silenciar genes específicos de interés en células madre neurales y diferenciarlas en los tipos de células deseados utilizando el medio de diferenciación adecuado. Este procedimiento permite estudiar el papel crítico de genes específicos en el proceso de diferenciación de las células madre neurales.

Silenciamiento génico mediado por siRNA en células madre neurales

Este video ilustra una técnica para aislar los pliegues neurales craneales de la región del mesencéfalo de embriones de pollo. Presenta un proceso de disección detallado de los pliegues neurales, su colocación y fijación en cubreobjetos recubiertos de fibronectina, seguido de la observación de la migración de las células de la cresta neural desde los pliegues neurales.

Aislamiento de pliegues neurales craneales de un embrión de pollo para un cultivo de células de cresta neural

Este protocolo describe la disección y el cultivo de células de la cresta neural craneal a partir de modelos de ratón, principalmente para el estudio de la migración celular. Describimos las técnicas de imagen en vivo utilizadas y el análisis de la velocidad y los cambios en la forma celular.

Disección, cultivo y análisis de células de cresta neural craneal primarias de ratón para el estudio de la delaminación y migración de células de cresta neuronal

En este protocolo, describimos una estrategia de diferenciación estable y altamente eficiente para la generación de neuronas simpáticas postgangliónicas a partir de células madre pluripotentes humanas. Este modelo hará que las neuronas estén disponibles para el uso de estudios de múltiples trastornos autonómicos.

Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente

Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Aquí se describen protocolos detallados paso a paso para estudiar señales mecánicas in vitro utilizando células de cresta neural O9-1 multipotentes e hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable.

Un sistema optimizado de O9-1/hidrogel para estudiar señales mecánicas en células de cresta neural

Este protocolo versátil describe el aislamiento de células de la cresta neural premigratoria (NCC) a través de la escisión de pliegues neurales craneales de embriones de pollo. Tras el recubrimiento y la incubación, las NCC migratorias emergen de los explantes del pliegue neural, lo que permite la evaluación de la morfología celular y la migración en un entorno 2D simplificado.

Preparación y análisis morfológico de cultivos de células de cresta neural craneal de pollo

Este protocolo describe un experimento de migración in vitro adecuado para el análisis funcional de las moléculas involucradas en la migración in vivo de las células de la cresta neural a la matriz extracelular rica en hialuronano.

In vitro Investigación de los efectos de la matriz extracelular rica en hialuronanos en la migración de células de cresta neural

Presentamos un protocolo de diferenciación in vitro tridimensional (3D) que genera neuroesferas de tamaño reproducible para producir células de cresta neural craneal a partir de células madre embrionarias de ratón. Demostramos que esta metodología reduce la variabilidad en comparación con los protocolos anteriores y cómo se puede utilizar para el ensayo multiplexado para estudiar el desarrollo de las células de la cresta neural craneal.

Células de la cresta neural craneal Protocolo de diferenciación tridimensional in vitro para ensayos multiplexados

Aprende a cultivar y manipular células de la cresta neural O9-1 de ratón mediante técnicas de siRNA y CRISPR-Cas9. Este protocolo permite estudiar biología del desarrollo y diferenciación celular.

Cultivo y manipulación de células de la cresta Neural O9-1

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