Name: Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a realizar imagen intravital de dos fotones en mucosa traqueal de ratón para analizar interacciones de células inmunes durante infección por virus influenza. Este protocolo permite visualizar dinámicas de neutrófilos y células dendríticas en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por las donaciones de la Fundación Nacional Suiza (SNF) (176124 145038 y 148183), europeo Marie Curie reintegración subvención de la Comisión (612742) y SystemsX.ch para una beca a D.U.P. (2013/124).

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo presenta un protocolo detallado para la generación de imágenes de 4D que muestra la migración de neutrófilos eventualmente transferidos y sus interacciones con DC durante una infección de gripe en la tráquea de ratón. El modelo descrito P 2-IVM será relevante para el estudio de dinámica celular inmune durante una infección en las vías respiratorias.
Recientemente, varios modelos basados en la visualización de la dinámica de la célula en las vías respiratorias han sido desarrollado...

Dos fotones microscopía intravital (2P-IVM) es una técnica eficaz para proyección de imagen en tiempo real de las interacciones célula a célula que se producen en su entorno natural1. Una de las principales ventajas de este método es que permite el estudio de procesos celulares en una mayor profundidad de la muestra (500 μm a 1 mm) en comparación con otras técnicas por imágenes tradicionales2. Al mismo tiempo, el uso de dos fotones de baja energía generada por el láser de dos fotones reduce el foto-daño de tejido por lo general asociado con el proceso de adquisición de imagen2. Durante la última década, 2P-IVM ha sido aplicado para estudiar diferentes tipos de interacciones célula-célula en varias disciplinas3,4,5. Estos estudios han sido especialmente relevantes para investigar las células inmunes, que se caracterizan por su alto dinamismo y la formación de destacados contactos siguiendo las señales generadas por otras células y el medio ambiente. 2P-IVM se ha aplicado también para estudiar las interacciones entre el patógeno y huésped6. De hecho, se ha demostrado previamente que algunos patógenos pueden alterar el tipo y la duración de los contactos entre las células inmunes, dificultando, en consecuencia, la respuesta inmune7.
La mucosa de las vías respiratorias es el primer sitio en el que la respuesta inmune contra patógenos aerotransportados es generado por la8. Por lo tanto, en vivo análisis de las interacciones patógeno-host en este tejido es fundamental para entender la iniciación de los mecanismos de defensa del huésped durante la infección. Sin embargo, 2P-IVM de las vías respiratorias es difícil principalmente debido a los artefactos producidos por el ciclo de respiración de los animales, que compromete el proceso de adquisición de la imagen. Recientemente, se han descrito diferentes modelos quirúrgicos para imagen tráquea murino9,10,11,12 y pulmones13,14,15, 16. Modelos traqueal P 2-IVM representan una excelente configuración para visualizar la fase inicial de la reacción inmunitaria en las vías aéreas superiores, mientras que el pulmón alvéolos 2P-IVM modelos son más adecuados para el estudio de la fase tardía de infecciones. Los modelos de pulmón desarrollados presentan una limitación asociada a la presencia de alvéolos llenos de aire, que restringen la penetración óptica del láser y la capa mucosa de las vías aéreas intrapulmonares inaccesibles para el en vivo de17 . Por el contrario, la estructura de la tráquea, formada por un epitelio continuo, facilita la adquisición de la imagen.
Aquí, presentamos un protocolo que incluye una descripción detallada de los pasos necesarios para realizar la infección por influenza, preparación quirúrgica de los animales y 2P-IVM de la tráquea. Además, se describe un montaje experimental específico para la visualización de los neutrófilos y las células dendríticas (DC), dos tipos de células inmunes que juegan un papel importante como mediadores de lo mecanismo de defensa contra influenza virus18,19 . Por último, se describe un procedimiento para analizar las interacciones del neutrófilo-DC. Estos contactos se ha demostrado que modulan la activación de la DC y, posteriormente, afectar la respuesta inmune contra patógenos20.

<table><tbody><tr><td>Gigasept instru AF</td><td>Sch&uuml; LKE & Ratones</td> CD11c-YFP con <td>solución al 4%</td>de Mayr GmbH <td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratorios Jackson</td><td>008829</td><td>ratones fueron criados internamente</td></tr> ratones <tr><td>CK6-ECFP</td> Jackson <td>Laboratories</td><td>004218</td><td>ratones fueron criados internamente</td></tr><tr><td>1x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco modificada sin chorro de calcio y cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco modificada sin Cloruro de Calcio y Cloruro de Magnesio</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>Sigma</td><td>E0414-1L Almacenar</td><td>a 4&deg; C</td></tr><tr><td>Ketamin Labatec</td><td>Labatec Pharma 7680632310024</td><td></td><td>Tienda en RT, tienda en 4 & deg; C cuando está en solución de mezcla ket/xilo</td></tr><tr><td>Rompun 2% (xilacina)</td><td>Bayer</td><td>6293841.00.00</td><td>Tienda en RT, tienda a 4 & grados; C cuando está en solución de mezcla ket/xilo</td></tr><tr><td>26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak</td><td>BD Plastipak 305501</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 G, 0,3 mL BD Jeringas de insulina microfinas</td><td>BD 324826</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; m Filtro de células</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de 2 mL</td><td>BD Plastipak</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 3x 18 agujas de 18 G</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety 20 G (catéter)</td><td>Braun</td><td>4251652.01</td><td></td></tr><tr><td>Clúster de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medio 1640 + HEPES (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>42401-018</td><td>Tienda en 4&deg; C</td></tr><tr><td>Liberase TL Grado de Investigación</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>Tienda a -20 &deg; C / Mezcla de colagenasa (I y II)</td></tr><tr><td>ADNasa I Amresco</td><td>(VWR)</td><td>0649-50KU</td><td>Almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>CellTrace Tinción violeta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34557</td><td>Almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Tienda en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>PE-10 Micro Tubo Médico</td><td>2Instrumentos Biológicos SNC</td><td>#BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>Cinta Plástica Quirúrgica</td><td>M Plast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Bausch & Tienda Lomb</td><td></td><td>en RT</td></tr><tr><td>Plastilina</td><td>Ohropax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio de alta tolerancia 15 mm Redondo</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0733</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite Sistema de anestesia animal portátil</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Nuvo Lite mark 5</td><td>GCE medline</td><td>14111211</td><td></td></tr><tr><td>MiniTag (banco de anestesia gaseosa y calefacción)</td><td>Tem Sega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SURGICAL BOARD</td><td>Universidad de Berna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrimScope II Microscopio de dos fotones</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision Láseres Ti:Sa</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25X NA 1.05 objetivo de inmersión en agua</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>The Cube& La caja Cámara de incubación y controlador de temperatura</td><td>Life Imaging Services</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.1.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Software de imagen</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Software estadístico</td></tr></tbody></table>

proyección de imagen de interacción de células en mucosa traqueal durante la infección del virus de la influenza usando microscopia intravital de dos fotones

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

El análisis de célula o célula-patógeno interacción en vivo es una herramienta importante para entender la dinámica de la respuesta inmune a la infección. Dos fotones microscopía intravital (2P-IVM) permite la observación de las interacciones de la célula en tejidos profundos en animales vivos, reduciendo al mínimo el fotoblanqueo generado durante la adquisición de la imagen. Hasta la fecha, se han descrito distintos modelos de 2P-IVM de órganos linfoides y no linfoides. Sin embargo, la proyección de imagen de órganos respiratorios sigue siendo un reto debido al movimiento asociado con el ciclo de la respiración del animal.
Aquí, describimos un protocolo para visualizar en vivo la célula inmune interacciones en la tráquea de ratones infectados con el virus de la influenza usando 2P-IVM. Para ello, hemos desarrollado una plataforma de proyección de imagen personalizada, que incluía la exposición quirúrgica y la intubación de la tráquea, seguida por la adquisición de imágenes dinámicas de neutrófilos y células dendríticas (DC) en el epitelio de la mucosa. Además, detallan los pasos necesitados para llevar a cabo la gripe intranasal infección y flujo análisis cytometric de células inmunes en la tráquea. Finalmente, se analizaron del neutrófilo y motilidad de DC así como sus interacciones en el transcurso de una película. Este protocolo permite la generación de imágenes de 4D estable y brillante es necesario para la evaluación de las interacciones célula-célula en la tráquea.

En este trabajo describen un protocolo detallado para el estudio en vivo la motilidad y las interacciones entre neutrófilos y DC durante la infección por influenza en tráquea murino (Figura 3A). Para ello, se aislaron neutrófilos PPC+ (92% pureza; Figura 3B) de ECFP CK6 ratones y eventualmente trasladaron en un ratón de CD11c-YFP infectado con influenza. Después de eso, realizamos 2P-IVM de la tráquea en día 3...

En este estudio, presentamos un protocolo para realizar dos fotones intravital proyección de imagen y de la célula análisis de interacción en la mucosa traqueal murina después de la infección con virus de la gripe. Este Protocolo será relevante para los investigadores que estudian la dinámica celular inmune durante las infecciones respiratorias.

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de las respuestas inmunitarias a los patógenos transportados por el aire sobre la dinámica de las interacciones de las células inmunitarias durante las infecciones respiratorias. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de obtener imágenes 4D brillantes y estables del epitelio traqueal a lo largo de la cirugía simple. Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones entre los neutrófilos y las células líticas durante la infección por gripe, también se puede aplicar al estudio de diferentes células inmunitarias o patógenos transportados por el aire.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para mantener una cirugía estable y mínimamente inflamada. Además, el análisis de imágenes puede ser complicado debido a la presencia de defectos cardíacos. Para la infección intranasal por influenza, coloque un ratón CD11c-YFP anestesiado de seis a ocho semanas de edad en posición supina y confirme la sedación profunda por falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie.Colocando la pipeta cerca de la fosa nasal izquierda, dispense pequeñas gotas en la cavidad nasal con aproximadamente 20 segundos de diferencia, hasta que el ratón haya inhalado todo el volumen de 15 microlitros de PR8 inoculado. Después de dos a cinco minutos, administre 15 microlitros de virus en la fosa nasal derecha de la misma manera. Cuando se haya entregado todo el inóculo, confirme que el ratón está respirando normalmente y coloque al animal en su jaula en decúbito lateral con monitoreo hasta la recuperación completa.Tres días después de la infección, extraiga el fémur y las tibias de un ratón transgénico que exprese CFP y limpie suavemente los huesos con fórceps. Corte la epífisis ósea y use una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26 para enjuagar la médula ósea de cada hueso con PBS frío estéril en un tubo de 50 mililitros en hielo. Cuando se haya extraído toda la médula ósea, aspire la médula a través de la punta de la aguja varias veces y filtre la suspensión celular disociada a través de un colador de 40 micrómetros.Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de PBS frío. A continuación, coloque cuidadosamente dos mililitros de cada uno de los tres gradientes de Percoll en un tubo de 15 mililitros de mayor a menor concentración. A continuación, añada con cuidado dos mililitros de suspensión de células de médula ósea en la capa superior de gradiente para la separación del gradiente de densidad centrífuga.Al final de la centrifugación, retire con cuidado la banda de la interfaz con un gradiente de 64 y 72% y lave los neutrófilos con PBS frío. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de PBS fresco en hielo para su recuento, y vuelva a suspender las células a una concentración de cinco veces 10 a la sexta célula por cada 100 microlitros de PBS para su inyección intravenosa en los animales receptores de CD11c-YFP inoculados. 12 horas después de la transferencia adoptiva, coloque el animal receptor anestesiado en una tabla quirúrgica personalizada sobre una superficie calentada a 37 grados centígrados y retire el pelo del cuello del ratón con afeitado y una crema depilatoria.Coloque el ratón por encima de la posición de plástico del ratón con la cabeza fuera de la posición en un ángulo que facilite la intubación de la tráquea, y asegure las extremidades delanteras, las patas y la cola con cinta quirúrgica. Aplique ungüento en los ojos y desinfecte la piel expuesta. A continuación, haz una incisión de un centímetro a lo largo del eje medial del cuello entre la parte superior del tórax y la línea que pasa por el punto inferior de la mandíbula, y mueve lateralmente los parches de piel y las glándulas salivales para visualizar la tráquea.Use fórceps para diseccionar cuidadosamente la tráquea, intube al ratón con un catéter e inicie inmediatamente la ventilación artificial. Use un gancho quirúrgico conectado a una varilla en la tabla quirúrgica para fijar la altura y la orientación del catéter, y exponga la tráquea hasta el mentón. Rodea la tráquea con vaselina e hidrata la tráquea con unas gotas de PBS tibio.A continuación, pegue un cubreobjetos en un soporte metálico y atornille el soporte al traductor XYZ para permitir que el cubreobjetos se coloque encima de la preparación quirúrgica. Es muy importante exponer y extender adecuadamente la tráquea, y presionarla ligeramente con el cubreobjetos, para mantener el tejido estable el tiempo suficiente para la toma de imágenes. Para obtener imágenes de lapso de tiempo in vivo, coloque la placa quirúrgica dentro de la cámara de incubación a 37 grados Celsius del microscopio de dos fotones y agregue una gota de agua al cubreobjetos.Después de centrar la configuración y enfocarse en el tejido traqueal, establezca la frecuencia de escaneo en 800 hercios con 520 por 520 píxeles, un campo de visión de 440 por 440 micrómetros y un promedio de línea de uno. Ajuste los láseres de zafiro de titanio a la longitud de onda y el porcentaje de potencia adecuados de acuerdo con los fluoróforos de excitación, y configure el modo de adquisición 3D y time-lapse con excitación simultánea. A continuación, defina un rango de 50 micrómetros a lo largo del eje z con un tamaño de paso de tres micrómetros y grabe imágenes cada 30 segundos durante 30 minutos.Después de esta configuración experimental, se pueden capturar imágenes 4D estables in situ dentro de la tráquea infectada durante un período de seguimiento de 30 minutos. El análisis de las imágenes 4D revela diferencias significativas entre el movimiento de las células dendríticas y el de los neutrófilos reclutados, con una velocidad significativamente más rápida demostrada por estos últimos. La compleja morfología de las células dendríticas provoca errores frecuentes en el seguimiento celular, lo que a su vez produce trazas con una duración disminuida y una mayor varianza en el comportamiento direccional medido.Por lo tanto, se creó una métrica robusta para medir la direccionalidad considerando la duración de la trayectoria, revelando una diferencia significativa en la direccionalidad de los neutrófilos en comparación con las células dendríticas. Además, el cálculo de la distancia entre los neutrófilos y las células dendríticas permite la detección y el análisis de sus contactos a lo largo del tiempo, con algunos neutrófilos en este experimento representativo formando múltiples contactos breves con las células dendríticas y algunos no formando ningún contacto con las células dendríticas durante el período de imagen. Además, el estudio de la tendencia media de la distancia entre neutrófilos y células dendríticas a lo largo del tiempo facilita el estudio de la posición general de las células, mientras que la investigación de la tendencia en células específicas permite caracterizar el comportamiento de cada célula individual.Conociendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la citometría de flujo de la tráquea para evaluar la cuantificación y caracterización de los reclutamientos de diferentes células inmunitarias en la tráquea infectada. No olvide que trabajar con cualquier cepa del virus de la influenza, incluso si está adaptada a ratones, puede ser peligroso y que, por lo tanto, todos los procedimientos deben realizarse bajo condiciones de nivel de bioseguridad dos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Una infección concurrente con el virus de la influenza es uno de los factores implicados en la inducción de la enfermedad neumocócica invasiva en...

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Se muestra, cómo el uso de 2-fotón microscopio para la observación de la dinámica de los granulocitos neutrófilos en los pulmones infectados, mientras que fagocitan los agentes patógenos o producir trampas de neutrófilos extracelular (NET).

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Hemos desarrollado nuevas herramientas de laboratorio y protocolos para la adquisición de imágenes intravital del timo. Nuestra técnica debería ayudar en la identificación de "nichos" en el timo en el desarrollo de células T se produce.

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Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

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Se demuestran modelos de infección sistémica y localizada del pez cebra por el virus de la influenza A humana. Utilizando un modelo de infección sistémica, el pez cebra se puede utilizar para detectar medicamentos antivirales. Utilizando un modelo de infección localizada, el pez cebra puede utilizarse para caracterizar las respuestas de las células inmunitarias del huésped.

El uso de modelos de pez cebra de Infecciones por Virus de la Influenza Humana A a la pantalla medicamentos antivirales y caracterizar inmune del huésped respuestas de las células

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

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Describimos un método para visualizar los IEL con la etiqueta GFP utilizando imágenes intravitales del intestino delgado murina mediante microscopía confocal de disco giratorio invertido. Esta técnica permite el seguimiento de células vivas dentro de la mucosa hasta 4 h y se puede utilizar para investigar una variedad de interacciones inmunoepiteliales intestinales.

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La microscopía de fluorescencia intravital se puede utilizar para estudiar las interacciones leucocitario-endotelial y la perfusión capilar en tiempo real. Este protocolo describe métodos para obtener imágenes y cuantificar estos parámetros en la microcirculación pulmonar utilizando un sistema de imágenes pulmonares estabilizadas por vacío.

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Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes intravitales del pulmón izquierdo del ratón trasplantado utilizando microscopía de dos fotones. Esto representa una herramienta valiosa para estudiar la dinámica celular y las interacciones en tiempo real después del trasplante de pulmón murino.

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Este protocolo proporciona instrucciones para la administración intranasal de IAV y el análisis posterior del daño pulmonar del ratón y los cambios transcripcionales asociados a los tipos de células pulmonares.

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Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana

Aprende a realizar imagen intravital de dos fotones en mucosa traqueal de ratón para analizar interacciones de células inmunes durante infección por virus influenza. Este protocolo permite visualizar dinámicas de neutrófilos y células dendríticas en tiempo real.

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones (Video) | JoVE Journal

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

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