Name: Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a analizar la invasión de células cancerosas usando un sistema de hidrogel con matriz de microcámaras para esferoides tumorales. Este método permite el monitoreo continuo y el cribado de fármacos anti-metastásicos.

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Este trabajo es apoyado por el legado de Moshe Shimon y Judith Weisbrodt.

1. HMCA placa repujado
Nota: El proceso completo para el diseño y fabricación de sello de polidimetilsiloxano (PDMS) y HMCA imagen usada en este protocolo se describe en detalle en nuestros anteriores artículos15,16. El sello PDMS (forma negativa) se utiliza para realzar el HMCA (forma positiva) que consiste en aproximadamente 450 MCs por pozo (figura 1A). Como se muestra en la figura 1B, cada uno de los MCs tiene forma de una pirámide truncada de forma cuadrada boca abajo (altura: 190 μm, pequeña base: 90 μm μm x 90 y gran área de la base: 370 μm μm x 370). La placa HMCA se utiliza para la preparación y cultivo de esferoides 3D del tumor y después de eso, para ensayo de invasión. Por otra parte, un sello comercial podría utilizarse para la producción de HMCA.
<ol><li>Preparar una solución de agarosa de fusión baja 6% (LMA). Introduzca el polvo de la LMA y el tampón de fosfato estéril salino (PBS) (0,6 g de LMA por 10 mL de PBS) en un frasco de vidrio con un agitador magnético. Coloque la botella en una placa de calentamiento y agitar la solución durante el calentamiento a 80 ° C por unas horas hasta que se logre una solución uniforme. No la solución a 70 ° C hasta su uso.</li>
	<li>Calentar previamente el sello PDMS para 70 ° C en el horno. Mantener caliente hasta su utilización. Alternativamente, utilice una marca comercial y siga las instrucciones.</li>
	<li>Coloque las placas de comercial pozo 6-fondo de cristal en un baño seco precalentado a 75 ° C. Espere unos minutos hasta que la placa esté totalmente caliente.</li>
	<li>Vierta una gota (400 μL) de la LMA precalentado en la parte inferior del cristal de cada uno de los pozos de la placa. Coloque suavemente el sello PDMS precalentado sobre la caída de la agarosa. Incubar a temperatura ambiente (RT) por 5-10 min para la gelificación y la prerefrigeración. Incubar a 4 ° C por 20 min lograr la gelificación de agarosa completo. Luego, suavemente Retire el PDMS, dejando el gel de agarosa estampado con MCs. Nota: Este paso se realiza simultáneamente en todos los pozos.</li>
	<li>Colocar la placa realzada en una sistema equipado con lámpara ultravioleta (UV) de polimerización e incubar durante 3 minutos. Nota: Ahora la placa HMCA es esterilizado UV.</li>
	<li>Llenar los pozos de macro con PBS estéril para asegurar que se mantienen húmedos, luego cubra la placa, envuélvalo con parafilm y almacenar a 4 ° C hasta su uso.</li>
	<li>Antes de usar, vaciar residuos de PBS de la placa HMCA. Lugar en la capilla biológica.</li>
</ol>2. carga de células y formación esferoide
<ol><li>Recoger las células como sigue: Retire Media todos de una monocapa de células de la placa 10 cm cultura, lavar dos veces con 10 mL de PBS para eliminar residuos de suero, añadir 5 mL de tripsina (previamente calentado a 37 ° C) e incube durante 3 min en la incubadora a 37 ° C. Luego, agitar la placa suavemente para asegurar el desprendimiento de la monocapa, añadir 10 mL de medio completo (previamente calentado a 37 ° C) y la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta logra una suspensión homogénea. Centrifugar y lavar la suspensión con 15 mL de medio fresco, entonces, suspender en concentraciones apropiadas en el medio completo fresco.</li>
	<li>Suavemente la suspensión de células de carga (50 μL, 150-360 x 103 células/mL en medio, ~ 16 – 40 células por MC) en el HMCA y permitir a las células a asentarse por gravedad durante 15 minutos.</li>
	<li>Suavemente agregar 6-8 alícuotas de 500 μl de medio fresco (total 3-4 mL) en el borde de la parte inferior plástico macro-bien fuera de la matriz de anillo y de hidrogel.</li>
	<li>Incubar las células HeLa por 72 h y células MCF7 durante 48 h a 37 ° C y 5% CO2, en un ambiente humidificado para la formación de esferoides.</li>
</ol>3. viabilidad detección por yoduro de propidio (PI) tinción
<ol><li>Preparar una solución stock de PI (500 μg de PI por cada 1 mL de PBS). Mantener a 4 ° C durante aproximadamente 6 meses. Recién preparar una dilución de 1:2,000 (0.25 μg/mL), mediante la adición de 6 μl de caldo a 12 mL de medio completo sin rojo de fenol, la placa de la pozo 6 HMCA (2 mL por pozo).</li>
	<li>Transferencia de la placa HMCA con esferoides de 48-72 h, de la incubadora a la campana biológica. Retire todo medio del HMCA por la punta, apoyado en el borde inferior plástico macro-bien al lado de la matriz de hidrogel, dejando el depósito de la matriz llena de medio.</li>
	<li>Suavemente agregar 2 mL de dilución de PI de paso 3.1 a cada pocillo, la punta, apoyado en el borde de la parte inferior de plástico macro-bien. Incube la placa HMCA por 1 h a 37 ° C y 5% CO2, en un ambiente humidificado. Continúe con el paso 7. Nota: Otros tintes podrían utilizarse aquí, así, por ejemplo, Hoechst para tinción del núcleo, tetramethylrhodamine metil éster (TMRM) para el potencial de membrana mitocondrial tinción fluoresceína diacetato (FDA) para la detección de células vivas, anexina V de apoptosis detección y otros.</li>
</ol>4. preparación de la mezcla colágeno
<ol><li>Preparar agua bidestilada estéril (DDW) por autoclave y un stock de 100 mL de solución de 1 M NaOH filtro esterilizado. Mantener los materiales en el RT y las puntas utilizadas para la preparación de la mezcla de colágeno congelado a-20 ° C, hasta su uso.</li>
	<li>10 – 20 minutos antes de usar, coloque todos los intergrades incluyendo: DDW estéril, solución estéril de 1 M NaOH, estéril 10 x PBS, colágeno de cola de rata (almacenado a 4 ° C durante 3 – meses) y un tubo estéril de tipo I en el cubo de hielo hasta que enfríe totalmente. Coloque el cubo de hielo dentro de la campana biológica.</li>
	<li>Preparar 1.800 μl de mezcla de colágeno a una concentración final de 3 mg/mL, 6 bien placa de ensayo de invasión de HMCA (300 μL por pozo) como sigue. Añadir los intergrades en el tubo de enfriado en el siguiente orden: 515 μl de DDW, 24,8 μl de 1 M NaOH y 180 μl de PBS 10 x. Homogeneizar bien vortex y en el hielo. Por último, añadir μl de 1080 de colágeno a la mezcla, vortex nuevo y coloque en hielo.</li>
</ol>5. HA y preparación de la mezcla de colágeno
<ol><li>Disolver 10 mg de HA en 2 mL de DDW estéril. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante unos minutos y agitar suavemente hasta que el polvo se disuelva totalmente. Almacenar la solución a 4 ° C hasta por dos años.</li>
	<li>Justo antes del uso, coloque la solución HA en el cubo de hielo dentro de la campana biológica.</li>
	<li>Preparar un 3 mg/mL de mezcla de colágeno como se describe en el paso 4. Añadir 36 μg (7.2 μL) de la HA en 1.800 μL de listo para usar mezcla de colágeno, para una concentración final de 20 μg/mL. Luego, mezclar otra vez brevemente y puesto en hielo.</li>
</ol>6. Además de la mezcla ECM
<ol><li>La placa HMCA, con esferoides de 48 – 72 h, la transferencia de la incubadora en la campana biológica y coloque en el hielo. Incubar por 10 min hasta que la placa se enfría. Caliente previamente una solución de 1% LMA a 37 ° C en un baño de agua.</li>
	<li>Quitar todo medio de alrededor de HMCA, inclinándose la punta en el borde inferior plástico macro-bien al lado de la matriz de hidrogel. Entonces, con mucho cuidado, saque medio todos el depósito de matriz con un fino gel punta carga punta, por la punta, apoyado en el borde de la matriz, lenta y suavemente chupar medio todo hacia fuera. Nota: Después de quitar todo medio de alrededor de la matriz de hidrogel, el depósito de matriz está lleno todavía de medio. Este medio tiene que ser eliminado muy suavemente para evitar destrucción de hidrogel MC y dislocación de esferoides.</li>
	<li>150 μL de la mezcla de colágeno o colágeno y HA mezcla (mezcla de ECM) con la punta fina precongelada y añadir en el depósito de matriz colocando la punta en el borde de la matriz. Lanzamiento de la mezcla lentamente para evitar la dislocación del esferoide. Repita este paso con otra alícuota de 150 μL, para un total de 300 μL por pocillo. Siga el mismo procedimiento para cada bien hasta que todos los pozos están llenos. Luego coloque la placa en la incubadora durante 1 h para la completa gelificación del ECM.</li>
	<li>Después de que se ha logrado la completa gelificación del ECM, pipetee 400 μL de precalentado 1% LMA en la parte superior del gel de la ECM. Cubra la placa con su tapa, incubar la placa a temperatura ambiente durante 5-7 min y 2 min a 4 ° C, para la gelificación de agarosa. Finalmente, agregar 2 mL de medio completo suavemente por la punta, apoyado en el borde de la parte inferior de plástico macro-bien. Nota: La capa de agarosa previene el desprendimiento de la matriz de gel de colágeno de la HMCA.</li>
</ol>7. Análisis y adquisición de ensayo invasión
<ol><li>Carga de la placa HMCA sobre un motor invertido platina del microscopio equipado con una incubadora, previamente ajustada a 37 ° C, 5% CO2 y ambiente humidificado.</li>
	<li>Averiguar las posiciones para la adquisición de la imagen en cada uno así para cubrir la zona de toda serie y utilizan 10 X y objetivos de X 4 (este paso es necesario para el software de adquisición de imagen usado aquí, vea la Tabla de materiales abajo para más detalles). Como alternativa, utilice cualquier software de adquisición de imagen para facilitar la exploración automática de toda la zona requerida, seleccionando la opción"Stich" .</li>
	<li>Adquirir imágenes de campo claro (BF) cada 2-4 h durante un período total de 24-72 h para la invasión de las células del cuerpo esferoide en el ECM circundante.</li>
	<li>Adquisición de imágenes fluorescentes para la detección de PI utilizando un cubo fluorescente dedicado (filtro 530 – 550 nm de excitación, espejo dicroico 565 nm largo pase y emisión filtro 600-660 nm).</li>
	<li>Exportar imágenes BF/fluorescente Time-lapse desde el software de adquisición de imagen y guardarlos en formato de archivo de imagen etiquetado (TIFF) en una carpeta dedicada mediante la ficha "Base de datos" en la barra de herramientas y luego en el botón "Exportar archivos de registro" . Nota: Hemos desarrollado un código de análisis interno especial en el software MATLAB que incluye una interfaz de diseño gráfica de usuario (GUI) en que la invasión análisis podrían ejecutarse más rápido y más fácil. En este código de análisis, se realiza la segmentación de la zona de invasión y esferoides semiautomática utilizando filtro de Sobel, seguido de los operadores morfológicos de erosión y dilatación. Después de segmentación automática de las zonas, se hicieron correcciones manuales donde sea necesario para mejor precisión. Después de la terminación de la segmentación, un conjunto de parámetros fueron calculados por el software y automáticamente exportado a un archivo de excel para su manipulación posterior. La lista de parámetros son: área seccional esferoide básica en tiempo = 0, zona de invasión de las células conectado al cuerpo esferoide = zona de invasión principal, área de células separadas del área de invasión principal, número de células separadas del área de invasión principal, distancia media de invasión de esferoide básica centro de masa a la circunferencia de la zona de invasión principal y separado de las células y parámetro de distancia de invasión colectiva = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) de la Coordenadas X e Y esferoide centro de masa, antes (X1, Y1) y después (X2, Y2) proceso de invasión colectiva). Por otra parte, análisis de imagen podrían hacerse con cualquier otro software especializado.</li>
	<li>Abrir la interfaz gráfica y pulse el botón "carga BF" . Después de abierta la imagen, ajustar los parámetros de segmentación (tamaño mínimo: > 1 y radio cierran: > 1) para lograr una segmentación precisa de esferoide y su área de invasión, a continuación, pulsa el botón de "Región de segmentación de interés (ROI)" para la ejecución y aparece un borde alrededor de cada esferoide. Si la segmentación automática es incorrecta, pulse el botón "Borrar" o "Agregar" y hacer las correcciones solicitadas manualmente. Repita los mismos pasos para las siguientes imágenes.</li>
	<li>Presione el botón "Seguimiento" a los esferoides y el software asignará al mismo número para cada esferoide en cada una de las imágenes de lapso de tiempo. Luego, presione el botón de "Medición" , que generará una hoja de cálculo con todos los parámetros. Guarde esta hoja de cálculo como un archivo de excel para uso posterior en los resultados de procesamiento y estadísticas en excel software.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Está bien documentado que los organismos vivos, caracterizados por su compleja organización multicelular 3D son muy distintos de las células de la monocapa 2D utilizados cultivada, haciendo hincapié en la crucial necesidad de utilizar modelos celulares que mejor imitan las funciones y procesos de un organismo vivo para drogas. Recientemente, esferoides multicelulares, culturas organotypic, organoides y órganos-en-un-chip han sido introducidas8 para el uso en el descubrimiento de fármacos estandari...

Muerte por cáncer se atribuye principalmente a la difusión de las células metastásicas a lugares distantes. Muchos esfuerzos en el tratamiento del cáncer se centran en objetivos o impedir la formación de colonias metastásicas y progresión de la enfermedad metastásica sistémica1. Migración de la célula de cáncer es un paso crucial en el proceso de metástasis de tumor, por lo tanto, la investigación de la cascada de invasión del cáncer es muy importante y un requisito previo a la búsqueda de terapias anti-metastásico.
El uso de modelos animales como herramientas para el estudio de enfermedad metastásica se ha encontrado para ser muy costoso y no siempre representativa del tumor en los seres humanos. Por otra parte, la topología de microambiente extracelular, mecánica y composición afectan fuertemente cáncer célula comportamiento2. En vivo modelos intrínsecamente carecen de la habilidad de separar y controlar estos parámetros específicos que contribuyen a la invasión del cáncer y la metástasis, es necesario para biomiméticos controlable en vitro modelos.
Para metastatizar a órganos distantes, las células cancerosas deben exhibir rasgos fenotípicos invasivos y migratorios que pueden ser destinados a la terapia. Sin embargo, puesto que la mayoría en vitro modelos de cáncer no imitar las reales características de tumores sólidos3, es muy difícil detectar fenotipos fisiológicamente relevantes. Además, la heterogeneidad fenotípica que existe dentro del tumor, dicta la necesidad de analizar la migración del tumor en el solo elemento de resolución para descubrir terapias dirigidas por fenotipo, por ejemplo, apuntando a la celda de inicio de la metástasis población dentro de los tumores heterogéneos4.
El estudio de la motilidad celular y la migración colectiva se lleva a cabo principalmente en cultivos monocapa de células epiteliales en las superficies planas homogéneas. Estos modelos celulares convencionales de migración de la célula de cáncer se basan en el análisis de la población de células invasoras a través de las membranas y componentes de ECM5, pero en estos sistemas, las diferencias intrínsecas entre las células individuales no pueden ser estudió. Generación 3D esferoides mediante andamios o en micro-estructuras de andamio-libre se considera como un superior significa estudiar el tumor de la célula crecimiento y cáncer invasión6,7,8. Sin embargo, la mayoría de los sistemas 3D no son adecuados a los formatos de alto rendimiento y esferoide entre interacción generalmente no puede lograrse desde esferoides individuales aisladas se generan en cada micro pozo9. Estudios recientes que involucran la migración del cáncer se basan en dispositivos microfluídicos3,10,11,12, sin embargo, estos sofisticación microfluídicos herramientas son difíciles de producir y no puede ser utilizado para alto rendimiento (HTS) de detección de drogas anti-invasivas.
Dos fenotipos principales, migración de la célula individual y colectiva, que juegan un papel en las células del tumor superando la barrera de ECM e invadiendo tejidos vecinos, han demostrado13,14, cada uno mostrando distintos morfológica características, mecanismos bioquímicos, moleculares y genéticos. Además, dos formas de migración de las células de tumor, fibroblasto-como y ameboides, se observan en cada fenotipo. Desde ambos, fenotipos de invasión y modos de la migración, principalmente se definen por las características morfológicas, hay una necesidad para celulares modelos que permiten basado en proyección de imagen de detección y examen de todas las formas de invasión tumoral y la migración de las células.
El objetivo general del método actual es proporcionar un simple y reproducible biomiméticos 3D en vitro sistema basadas en células para el análisis de la capacidad de invasión en grandes poblaciones de esferoides tumorales. Aquí, presentamos la base de HMCA 6 imagen placa de pozos para la investigación de invasión del tumor y terapia anti-metastásica. La tecnología permite la formación de un gran número de esferoides tumorales 3D uniforme (450 por pozo) en una estructura de micro-cámaras (MC) de hidrogel. Varios componentes de la ECM se añaden a la matriz de esferoide para permitir la invasión de las células en el entorno. Proceso de invasión es continuamente supervisado por observación de corto y largo plazo de las mismas células esferoides individuales/invadiendo y facilita la caracterización morfológica, tinción fluorescente y recuperación de esferoides específicos en cualquier momento. Puesto que numerosos esferoides comparten espacio y medio, interacción a través de moléculas solubles entre esferoides individuales y su impacto el uno del otro es posible. Análisis de semi-automática de la imagen se realizan utilizando interno código MATLAB que permite la más rápida y eficaz recopilación de gran cantidad de datos. La plataforma facilita la medición precisa y simultánea de numerosas células esferoides/invadiendo de manera eficiente, permitiendo la proyección del rendimiento medio de los medicamentos de lucha contra la invasión.

<table><tbody><tr><td>6 placas inferiores de vidrio de micropocillos con cubreobjetos de micropocillo de 14 mm #1.5</td><td>Cellvis</td><td>P06-14-1.5-N</td><td>Placas inferiores de vidrio comerciales que se utilizan para el estampado de HMCA</td></tr><tr>Agarosa <td>Invitrogen de</td><td>bajo punto de fusión UltraPure</td><td>16520100</td><td>Una solución de agarosa al 6% se calienta hasta 80 & grados; C antes de usar, se calienta una solución de agarosa al 1% a 37 & grados; C</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA solución B</td><td>Industrias Biológicas</td><td>03-052-1A</td><td>Calentado a 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>DMEM medio, glucosa alta</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td>Calentado a 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Suero especial para terneros recién nacidos (NBCS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-122-1A</td><td>DPBS inactivado por calor</td></tr><tr><td>(10x), sin calcio, sin magnesio</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td>Mantenido en hielo antes de usar</td></tr><tr><td>NaOH, anhidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>Se utiliza para la preparación de una solución de NaOH 1 M</td></tr><tr><td>Colágeno Cultrex Tipo I de cola de rata, 5 mg/mL</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>Mantener en hielo antes de usar</td></tr><tr><td>Sal sódica de ácido hialurónico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5542-10MG</td><td>Mantener en hielo antes de usar</td></tr><tr><td>Fisetin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F505-100MG</td><td>Añadido al medio de cultivo, inhibidor de invasión</td></tr><tr><td>DETA/NO</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>alx-430-014-m005</td><td>Añadido al medio de cultivo, donante de óxido nítrico</td></tr><tr><td>PI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Se utiliza a una concentración muy baja sin necesidad de lavar el</td></tr><tr><td>sistema completo de la lámpara de inundación UV Dymax 5000-EC con escudo de luz y Fuente de alimentación Dymax EC de 400 vatios</td><td>Dymax Corporation</td><td>PN 39823</td><td>Se utiliza para la esterilización de placas HMCA mediante</td></tr><tr><td>microscopio UV IX81 invertido</td><td>Olympus</td><td></td><td>Se utiliza para la adquisición automática de imágenes</td></tr><tr><td>Incubadora para microscopio</td><td>Life Imaging Services</td><td></td><td>Esencial para experimentos de lapso de tiempo con adquisición de imágenes, preajustado a 37 &deg; C, 5% CO2 y mantener una atmósfera humidificada</td></tr><tr><td>Platina motorizada submicrónica tipo SCAN-IM</td><td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td><td></td><td>Se utiliza para predeterminar áreas de adquisición de imágenes, para la adquisición automática</td></tr><tr><td>de imágenes Cámara refrigerada ORCA II C4742-98 de 14 bits</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Altamente sensible, utilizado para la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Cubo de filtro fluorescente para la detección de PI</td><td>Corporación de Tecnología Chroma</td><td></td><td>Especificaciones del cubo de filtro: filtro de excitación 530-550 nm, espejo dicroico 565 nm paso largo y filtro de emisión 600-660 nm</td></tr><tr><td>El software operativo Olympus Cell^P</td><td>Software Olympus</td><td></td><td>utilizado para controlar el microscopio, la platina motorizada, la cámara y la adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Software de análisis Matlab R2014B</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Se utiliza para desarrollar una interfaz gráfica de usuario interna para el análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Software</td> <td>ExcelMicrosoft</td><td></td><td>Se utiliza para la gestión de datos, el cálculo, la creación de gráficos y las estadísticas</td></tr></tbody></table>

análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel micro-cámara matriz (hmca) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Metástasis del cáncer se sabe que causan el 90% de mortalidad de cáncer. La metástasis es un proceso gradual que inicia con la penetración/invasión de células tumorales en el tejido vecino. Así, la invasión es un paso crucial en metástasis, haciendo la investigación del proceso de invasión y desarrollo de fármacos anti-metastásicos, altamente significativo. Para hacer frente a esta demanda, es necesario desarrollar modelos 3D en vitro que imitan la arquitectura de tumores sólidos y su microambiente más cerca a estado en vivo en una mano, pero al mismo tiempo ser reproducibles, robusta y conveniente para alto rendimiento y alto contenidas mediciones. Actualmente, la mayoría ensayos de invasión apoyan en tecnologías de microfluidos sofisticados que son adecuadas para la investigación pero no para la detección de drogas de alto volumen. Otros ensayos utilizando dispositivos basados en placa con esferoides individuales aisladas en cada pozo son material consumo y tamaño de la muestra baja por condición. El objetivo del protocolo actual es proporcionar un sistema de celulares 3D de biomiméticos simples y reproducibles para el análisis de la capacidad de invasión en grandes poblaciones de esferoides tumorales. Se desarrolló un modelo 3D para análisis de invasión basado en la placa de proyección de imagen de HMCA para la investigación de invasión del tumor y descubrimiento de fármacos anti-metastásico. Este dispositivo permite la producción de numerosos esferoides uniforme por pocillo (tamaño de la muestra alta por condición) rodeada por los componentes del ECM, mientras continuamente y al mismo tiempo observando y midiendo los esferoides en el solo elemento de resolución por medio proyección de producción de drogas anti-metastásicas. Esta plataforma se presenta aquí por la producción de HeLa y MCF7 esferoides para ejemplificar unicelular y la invasión colectiva. Comparar la influencia de la ECM componente el ácido hialurónico (HA) en la capacidad invasiva de colágeno que rodean esferoides de HeLa. Por último, no presentamos Fisetin (inhibidor de la invasión) HeLa esferoides y óxido nítrico () (activador de invasión) a MCF7 esferoides. Los resultados son analizados por el software interno que permite el análisis semi-automático, simple y rápido que facilita el examen de múltiples parámetro.

El único HMCA placa de la proyección de imagen se utiliza para el ensayo de invasión de esferoides tumorales 3D. El ensayo completo, comenzando con la formación esferoide y terminando con el proceso de invasión y manipulación adicional, se realiza en el mismo plato. Para la formación esferoide, células HeLa se cargan en la cuenca de la matriz y se instalan en el hidrogel MCs por gravedad. El hidrogel MCs, que tienen características de adherente/bajo sujeción, facilitar la interacción célu...

Una placa de imagen basado en el HMCA se presenta para el funcionamiento de ensayo de invasión. Esta placa facilita la formación de esferoides tumorales (3D) tridimensional y la medición de la invasión de células de cáncer en la matriz extracelular (ECM). La cuantificación del ensayo de invasión se logra por análisis semiautomático.

Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

El objetivo de este sencillo sistema biomimético 3D basado en células es facilitar el análisis de la capacidad de invasión en una gran población de esferoides tumorales para el cribado de fármacos antisetásicos. La principal ventaja de nuestra matriz de microcámaras de hidrogel es que permite la producción de un gran número de esferoides uniformes que pueblan el mismo plano focal por pozo. La posición del esferoide se mantiene debido a la estructura de la matriz de microcámaras de hidrogel incluso después de la adición de la matriz extracelular, facilitando el monitoreo continuo preciso de los esferoides y el proceso de invasión.Además, la caracterización morfológica y la tinción fluorescente de numerosos esferoides y células invasoras se pueden realizar in situ y analizarse a una resolución de un solo elemento de una manera eficiente en el tiempo. La demostración del procedimiento de producción de placas de imágenes de seis pozos de la matriz de microcámaras de hidrogel será Maria Sobolev de nuestro laboratorio. Para preparar las placas de matriz de microcámaras de hidrogel, primero precaliente seis sellos de polidimetilsiloxano, o PDMS, sellos a 70 grados Celsius, y coloque una placa de seis pocillos con fondo de vidrio en un baño seco precalentado a 75 grados Celsius durante varios minutos.Cuando la placa esté caliente, vierta una gota de 400 microlitros de agarosa precalentada de baja fusión en la parte inferior de cada pozo de la placa de seis pozos, y coloque suavemente un sello sobre cada gota. Deje que la configuración se enfríe durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de 20 minutos a cuatro grados Celsius para la gelificación completa de la agarosa. Cuando la agarosa se haya solidificado, despegue suavemente el PDMS de cada pozo, dejando los geles de agarosa estampados con microcámaras.Después de permitir que la lámpara UV alcance su mayor intensidad, coloque la placa en relieve en el sistema de curado de luz durante tres minutos, y llene los macro-pozos esterilizados por UV con PBS estéril. A continuación, cubra la placa y envuélvala con Parafilm para un almacenamiento Celsius de cuatro grados hasta su uso. Para cargar las células, retire el PBS de cada pozo y cargue suavemente 50 microlitros de las células de interés encima de cada matriz de hidrogeles.Después de permitir que las células se asienten por gravedad durante 15 minutos, agregue cuidadosamente seis a ocho alícuotas de 500 microlitros de medio fresco al borde del fondo plástico macro-pozo fuera de la matriz de anillo e hidrogel. Incubar las células durante el período de tiempo adecuado a 37 grados celsius y 5%dióxido de carbono con humedad para la formación de esferoides. Luego, transfiera los esferoides a una capucha de bioseguridad sobre hielo durante 10 minutos.Cuando la placa se haya enfriado, incline una punta de pipeta en el borde de la parte inferior de plástico macro-pozo junto a la matriz de hidrogeles, y retire todo el medio de alrededor de la matriz. A continuación, retire el medio del tanque de la matriz, incline una punta de pipeta de carga de gel en el borde del tanque de la matriz con mucho cuidado, teniendo cuidado de no molestar a las microcámaras y esferoides. A continuación, utilice una punta de pipeta fina precongelado para agregar dos alícuotas de 150 microlitros de la mezcla de colágeno de interés en el borde de la matriz de una en una, liberando la mezcla lentamente para evitar la luxación de esferoides.Después de que se haya añadido la segunda ronda de colágeno a cada pozo, devuelva los esferoides a la incubadora durante una hora para la gelación completa de la matriz extracelular. Cuando la matriz se haya solidificado, agregue 400 microlitros de agarosa precalegada al 1% de baja fusión en la parte superior del gel, e incubar la placa, cubierta a temperatura ambiente, durante cinco a siete minutos, antes de enfriar durante dos minutos a cuatro grados Celsius para la gelificación. A continuación, inclinando la pipeta en el borde de la parte inferior de plástico macro-pozo, añadir suavemente dos mililitros de medio completo a cada pozo.Para realizar un ensayo de invasión, cargue la placa de matriz de microcámara de hidrogel en una etapa de microscopio invertido motorizado equipada con una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono con una atmósfera humidificada, y utilice un objetivo de cuatro o 10x para pre-determinar las posiciones para la adquisición de la imagen en cada pozo de modo que se evalúe toda el área de la matriz. Luego, adquiera imágenes de campo brillante cada dos o cuatro horas para un total de 24 a 72 horas para rastrear la invasión celular desde el cuerpo esferoide en la matriz extracelular circundante. Al final de la adquisición de imágenes, exporte las imágenes de lapso de tiempo desde el software de adquisición de imágenes para guardar en un formato de archivo de imagen etiquetado a una carpeta dedicada.A continuación, abra la interfaz gráfica de usuario y haga clic en Cargar campo brillante. Ajuste los parámetros de segmentación de la imagen para lograr una segmentación precisa de los esferoides y sus áreas de invasión, y haga clic en Segmentación de región de interés para crear un borde alrededor de cada esferoide. Si la segmentación automática es incorrecta, pulse Suprimir o Agregar y realice las correcciones adecuadas manualmente.Haga clic en Seguimiento para numerar los esferoides en cada una de las imágenes de lapso de tiempo. A continuación, haga clic en Medición para generar una hoja de cálculo con todos los parámetros y guarde la hoja de cálculo en un formato adecuado para el procesamiento de datos y el análisis estadístico. Para examinar la influencia del ácido hialurónico en el proceso espontáneo de invasión de esferoides HeLa, en este experimento, los esferoides maduros de dos días se cubrieron con solución de colágeno y mezcla de ácido hialurónico y se compararon con esferoides maduros de dos días cubiertos con solución de colágeno solo.Después de 50 horas de incubación, los esferoides incrustados en colágeno y ácido hialurónico demostraron una dispersión celular inferior en la matriz extracelular circundante en comparación con los esferoides incrustados solo en colágeno. De hecho, el análisis de la cinética del área de invasión a lo largo del tiempo para 99 esferoides con una resolución de un solo esferoide indica claramente que la adición de ácido hialurónico al colágeno inhibe la dispersión celular fuera del esferoides, lo que resulta en áreas de invasión más pequeñas. El tratamiento del cultivo de esferoide HeLa con un flavonoide bioactivo con propiedades cito-y migratorias durante 24 horas da como resultado una dispersión celular inhibida alrededor de los esferoides en comparación con los esferoides HeLa no tratados.De hecho, el análisis de las áreas de invasión de 488 esferoides al final del experimento reveló una inhibición significativa después del tratamiento con tan poco como 10 micromolares de la droga. Debido a la baja fijación característica del hidrogel, esta tecnología basada en microcámaras facilita la formación de esferoides incluso en casos de muy pocas células. Esto es especialmente ventajoso en valiosas muestras limitadas de células primarias similares a tallos o derivados del paciente.La placa de imágenes de microcámara de hidrogel permite el análisis de la ubicación espacial exacta de los esferoides durante experimentos a largo plazo para la evaluación del proceso de invasión a nivel de un solo elemento y proporciona un alto grado de robustez estadística y precisión. Las aplicaciones futuras de esta metodología incluyen el cultivo unicelular en paralelo de células tumorales y estromales en diferentes regiones dentro del macro-pozo y la recuperación de esferoides individuales para el análisis molecular aguas abajo.

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A tiempo real Técnica de Impedancia Eléctrica base para medir la invasión de monocapa de células endoteliales de las células cancerosas

Este video describe un ensayo de invasión utilizando una matriz de tres cámaras basada en la impedancia eléctrica. Esta técnica mide el potencial invasivo de las células cancerosas bajo la influencia de factores solubles secretados por las células estromales residentes en microambientes tumorales.

Ensayo de impedancia basado en matrices de tres cámaras: una técnica de análisis en tiempo real para evaluar el potencial invasivo de las células cancerosas mediante la medición de la impedancia eléctrica

Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante.  Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I.  Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.

Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D

Este estudio divulga a dos diferentes métodos para el análisis de invasión celular y la migración: el análisis de la cámara de Boyden y en vitro video microscopio basado cicatrización ensayo. Los protocolos de estos dos experimentos se describen y se comparan con sus beneficios y desventajas.

Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden

El ensayo de invasión celular in vitro se utiliza para medir el potencial de la metástasis del cáncer mediante la cuantificación del potencial celular de invasión y migración utilizando inserciones de cultivo celular que contienen matriz proteica. Las células tienen el desafío de migrar a través de la matriz proteica y una membrana porosa, hacia un quimioatractor, y luego cuantificadas por microscopía ligera.

El uso de células tumorales mamarias de ratón en un ensayo de invasión in vitro como medida del comportamiento de las células oncogénicas

En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular, la biología del cáncer requiere nuevas herramientas in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado. Describimos protocolos para explotar cocultivos microfluídicos inmunes al tumor en entornos 2D y 3D, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico de las funciones celulares.

Modelos de cocultivo microfluídico para diseccionar la respuesta inmune en microambientes tumorales in vitro

Este es un método eficaz para detectar supresores o impulsores de metástasis del cáncer. Las células, transducidas con una biblioteca de expresión, se inyectan en la vasculatura de la membrana corioalantoica del pollo para formar colonias metastásicas. Las colonias que han disminuido o aumentado la invasividad se extirpan, se expanden, se reinyectan para confirmar su fenotipo y, finalmente, se analizan mediante secuenciación de alto rendimiento.

Descubrimiento de reguladores metastásicos utilizando un modelo de membrana corioalantoica intravital de pollitos rápido y cuantitativo

Describimos un enfoque para detectar y capturar subpoblaciones celulares invasivas en tiempo real. El diseño experimental utiliza el análisis celular en tiempo real mediante el monitoreo de los cambios en la impedancia eléctrica de las células. Se pueden capturar células invasivas de cáncer, inmunes, endoteliales o estromales en tejidos complejos y se puede evaluar el impacto de los cocultivos.

Detección y captura en tiempo real de subpoblaciones celulares invasivas a partir de cocultivos

El presente protocolo describe una plataforma experimental para evaluar los efectos de las señales mecánicas y bioquímicas en las respuestas quimioterapéuticas de las células de glioblastoma derivadas de pacientes en cultivos miméticos de matriz 3D utilizando un dispositivo de iluminación UV hecho a medida que facilita la fotoreticulación de alto rendimiento de hidrogeles con características mecánicas sintonizables.

Las matrices de hidrogel permiten un mayor rendimiento para los efectos de detección de los componentes de la matriz y la terapéutica en modelos tumorales 3D

El ensayo CAM-Delam para evaluar la capacidad metastásica de las células cancerosas es relativamente rápido, fácil y barato. El método se puede utilizar para desentrañar los mecanismos moleculares que regulan la formación de metástasis y para la detección de fármacos. Un ensayo optimizado para analizar muestras de tumores humanos podría ser un método clínico para el tratamiento personalizado del cáncer.

Ensayo CAM-Delam para puntuar las propiedades metastásicas mediante la cuantificación de la delaminación y la capacidad de invasión de las células cancerosas

La invasión es un fenómeno biológico importante en el desarrollo y la progresión del cáncer. Este proceso está influenciado por las células no neoplásicas y los componentes del microambiente tumoral. El propósito de este estudio es describir un método alternativo para analizar la invasión de células tumorales in vitro utilizando cultivos tridimensionales (3D).

Estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3D

Aprende a analizar la invasión de células cancerosas usando un sistema de hidrogel con matriz de microcámaras para esferoides tumorales. Este método permite el monitoreo continuo y el cribado de fármacos anti-metastásicos.

Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas (Video) | JoVE Journal

Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas

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