Síntesis y determinación estructural de μ-Conotoxina PIIIA isómeros con disulfuro diferentes conectividades

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la síntesis de péptidos, como sintetizar péptidos ricos en disulfuro y determinar su patrón de puente de disulfuro correspondiente. La principal ventaja de esta técnica es que permite la síntesis selectiva de diferentes isómeros de péptidos de unión de disulfuro y su posterior caracterización química y estructural. Generalmente los individuos nuevos en este método lucharán porque cada péptido rico disulfuro se comporta de manera diferente.

La síntesis y el análisis pueden tener que ser parcialmente optimizados para péptidos o proteínas individuales. Transfiera los reactivos enumerados en el protocolo de texto a los recipientes correspondientes y colóquelos en las raquetas apropiadas del sintetizador de péptidos de fase sólida. A continuación, añadir 100 miligramos de resina seca a las columnas de reacción y ponerlos en la raqueta del sintetizador.

Inicie la síntesis de péptidos de fase sólida como se detalla en el protocolo de texto. Una vez completada la síntesis, la resina se liofilizó durante la noche. Ahora separar el péptido de la resina y realizar una protección profunda de las cadenas laterales.

Para ello, combine la resina seca en un tubo de 12 mililitros y enfríe a cero grados Centígrados sobre hielo. Primero, agregue 150 microlitros de una mezcla de carroñeros, luego agregue un mililitro de 95%ácido trifluoroacético por 100 miligramos de resina. Deje la mezcla agitando suavemente durante tres horas a temperatura ambiente.

Ahora, filtre la mezcla a través de una frita de vidrio. Recoger el filtrado en tubos, lleno individualmente con éter de dietil frío en hielo a un mililitro de mezcla de escote por ocho a 10 mililitros de éter dietílico. El péptido se precipita como un sólido blanco.

Después de enjuagar y centrifugar los tubos como se describe en el protocolo de texto, límpiate los péptidos. Para purificar el precursor lineal con cromatografía semicurtiva añadir aproximadamente 70 miligramos del péptido crudo a un tubo de 15 mililitros. A continuación, disolver el péptido crudo en 0,1%TFA y acetonitrilo uno a uno para el agua.

Separe la mezcla de péptidos usando un gradiente de cero a 50%Eluent B durante 120 minutos a un caudal de 10 mililitros por minuto. Recopile las fracciones en tubos individuales a medida que aparecen y prepare las fracciones seleccionadas para la espectrometría de masas y el análisis HPLC como se describe en el protocolo de texto. Seque las fracciones y combine las fracciones de pares.

Iniciar la formación selectiva de enlaces de disulfuro realizando la primera oxidación. Para ello, disolver 15 miligramos del péptido lineal liofilización en 105 mililitros de una mezcla de agua isopropanol. Dejar la mezcla revolviendo al aire en condiciones básicas durante 12 a 48 horas.

El procedimiento de oxidación escalonada es muy crítico. Los controles de reacción se toman en las tres medidas de oxidación para asegurar la formación rica en disulfuro individual. La tercera oxidación es la más crucial porque el diulfuro puede ocurrir cuando se supera el tiempo de reacción óptimo.

Ahora realiza la segunda oxidación. Disolver 15 miligramos del péptido liofilado en 105 mililitros de agua isopropanol, una mezcla de ácido clorhídrico molar. Añadir 158 microlitros de una solución de yodo molar 0.1 en metanol a la solución.

Revuelva la reacción a temperatura ambiente hasta que se complete la oxidación. A continuación, detenga la reacción añadiendo 79 microlitros de un ácido ascórbico molar en el agua. Finalmente realizar la tercera oxidación.

Disolver 15 miligramos del péptido liofilado en 5,5 mililitros de TFA que contengan una mezcla de carroñeros. Precipite el péptido en tubos que contengan éter dietílico frío a un mililitro de solución de reacción por ocho a diez mililitros de éter dietílico. Para realizar la purificación de péptidos a 15 miligramos del producto crudo liofilario a un tubo de 15 mililitros.

Disolver el producto crudo en el volumen del bucle de muestra HPLC utilizando una mezcla de 0.1%TFA y uno a uno Acetonitrile al agua. Después de vórquel hasta la disolución completa, centrifugar la solución de un minuto a 3400 veces G.Extraiga la mezcla de 3,6 mililitros en una jeringa de 5 mililitros e inyecte la muestra sin burbujas de aire en el bucle de inyección. Inicie la inyección en el sistema HPLC.

Purificar la mezcla de péptidos usando un gradiente de cero a 50%Eluent B durante 120 minutos a un caudal de 10 mililitros por minuto. Recoger las fracciones en tubos individuales a medida que aparecen. Una vez completada la ejecución, prepare las fracciones seleccionadas para el análisis de MS y HPLC como se describe en el texto.

Seque todas las fracciones y guárdelas a menos 20 grados centígrados. Para realizar hpLC analítica, transfiera muestras de las fracciones de péptidos o controles de reacción a un vial de HPLC y disuelva en la mezcla de 0,1%TFA en una a una Acetonitrile al agua. Coloque el vial de HPLC en el muestreador automático de la fase inversa analítica HPLC para inyectar 250 microlitros de cada muestra.

Utilice un sistema de elución de gradiente de 0.1%TFA en agua como Eluent A en 0.1%TFA en Acetonitrile como un Eluent B.Analizar el péptido usando un gradiente de 10%a 40%Eluent B durante 30 minutos a un caudal de 1.0 mililitro por minuto. Para realizar análisis de aminoácidos, transfiera 100 microgramos del péptido puro a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros y disuelva el polvo en 200 microlitros de seis molares HCL. Después de transferir la solución a una ampolla de vidrio, cierre la ampolla calentando el cuello con una llama de quemador de bunsen.

A continuación, coloque un tubo de vidrio sosteniendo la ampolla en un bloque de calentamiento durante 24 horas a 110 grados Celsius para la hidrólisis. Después de 24 horas, abra la ampolla y transfiera la solución a un tubo de micro centrífuga de dos mililitros. Centrifugar la solución durante seis horas a sesenta grados centígrados y 210 veces G en un concentrador de vacío rotacional.

A continuación, disuelva el producto hidrolizado en 192 microlitros del tampón de dilución muestreado y transfiera la solución a un filtro micro centrífugo. Después de centrifugar la muestra durante un minuto a 2300 veces G, transfiera 100 microlitros del filtrado a un tubo de muestra de análisis de aminoácidos. Coloque el tubo en el analizador de aminoácidos e inicie el análisis.

Durante este protocolo de reducción pasado, es crucial tomar varios controles de reacción para obtener dos o cuatro veces kappa mido especies metiladas que son indispensables para el posterior análisis de desulfuro a través de espectrometría de masas. Disolver primero 600 microgramos del péptido puro en 1,2 mililitros de tampón de citrato molar 0,05 que contiene TCEP. Incubar la mezcla a temperatura ambiente tomando varias muestras de control de reacción de 100 microlitrotros que van de cero a 30 minutos.

Mezclar las muestras en un tubo de micro-centrífuga de 1,5 mililitros con 300 microlitros de tampón de alquilación para detener la reacción y realizar la metilación carbonil de los grupos de tiol libre. Detenga la reacción después de cinco minutos añadiendo 100 microlitros de 10%TFA y agua y almacene las muestras en hielo seco. Ahora realice HPLC en las muestras como se detalla en el protocolo de texto.

Transfiera una pequeña cantidad de cada fracción recolectada a un tubo de microterrífuga de 1,5 mililitros para el análisis de MS/MS de las formas oxidadas. Disolver el péptido restante en 0,1%TFA en agua y añadir un volumen adecuado sobre una solución de TCEP de 100 milimolar para obtener una concentración final de TCEP de 10 milimolar. En este punto, alquilación selectiva de cisteína se puede comprobar a través de la secuenciación de péptidos.

Con los dos péptidos en el medio, una determinación del patrón de puente de disulfuro es posible. El análisis de RMN de los diferentes isómeros se lleva a cabo para revelar las estructuras de péptidos individuales. Se muestran las 20 estructuras con las energías más bajas, así como la conectividad disulfuro de los diferentes isómeros.

En particular, se requiere una combinación de fragmentación HPLC MS/MS de fase inversa y análisis de RMN para la identificación inequívoca de la conectividad de disulfuro. La comparación del valor de desviación cuadrada media de la raíz aclaró que un péptido rígido conduce principalmente a una estructura de RMN mejor resuelta. Este video debe darle un ejemplo de cómo sintetizar selectivamente péptidos con un patrón de unión de disulfuro deseado.

También muestra la posibilidad de comprobar la conectividad correcta del disulfuro a través de la espectrometría de masas tierna y obtener una estructura tridimensional a través de la espectroscopia de RMN. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la síntesis de péptidos exploraran la importancia de los patrones de unión de disulfuro para la estructura tridimensional y, en consecuencia, la actividad de dichos isómeros péptidos. Siguiendo este procedimiento, otros métodos como la actividad ASAS se pueden realizar para obtener información sobre las relaciones de actividad de la estructura de diferentes isómeros del péptido en el objetivo biológico específico.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la síntesis y el análisis de las conotoxinas, también se puede aplicar a otros péptidos de puente de disulfuro y proteínas como los fenzens, toxinas animales ricas en disulfuro y otras moléculas múltiples que contienen cisteína.