Name: Análisis de los complejos de la proteína de membrana de tilacoides por electroforesis nativa azul (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprende a analizar complejos proteicos de tilacoides mediante electroforesis nativa azul (BN-PAGE) y SDS-PAGE bidimensional en Arabidopsis thaliana. Este método revela la organización dinámica de complejos fotosintéticos.

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Esta investigación fue apoyada financieramente por la Academia de Finlandia (números de proyecto 307335 y 303757) y la energía Solar en convenio de subvención de biomasa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). El protocolo se basa en la referencia3.

1. preparación de BN Gel1,2,3
<ol><li>Configurar la rueda de gel con las placas de 8 x 10 cm (rectangular de vidrio y placa de alúmina con muescas) según instrucciones del fabricante utilizando a espaciadores de 0,75 mm.</li>
	<li>Poner un mezclador de gradiente sobre una placa de agitación y conectar con la bomba peristáltica por una tubería. Coloque una aguja de jeringa en el otro extremo de la tubería y colocar la aguja entre la placa de vidrio y aluminio. Agitador magnético de lugar a la "pesada" (H)-cámara.</li>
	<li>Preparar el 3,5% (v/v) y el 12,5% (v/v) soluciones de acrilamida (AA) en tubos de centrífuga cónico de 15 mL para el gradiente del gel de separación (ver recetas en el cuadro 1). Para evitar la polimerización prematura Mantenga los tubos de la centrífuga en el hielo mientras se preparan las soluciones. PRECAUCIÓN: La acrilamida es guantes y ropa protectora neurotóxico y cancerígeno, desgaste.</li>
	<li>Añadir 5% APS y TEMED la derecha antes de pipetear las soluciones al mezclador de gradiente. Pipeta de la solución de 12,5% a la cámara de H.<ol>
<li>Quite las burbujas de aire del canal de conexión de la "luz" (L) y H-cámara abriendo la válvula que conecta las dos cámaras que permite la solución entrar a la cámara de L. Cierre la válvula y pipetee que los rastros de solución hacia H-cámara.</li>
		<li>Por último, pipeta de la solución 3.5% para la cámara de L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Encender el agitador magnético (la velocidad de la agitación no es crítica, pero debe asegurar una mezcla adecuada de las soluciones ligeras y pesadas), abrir las válvulas y del interruptor de la bomba peristáltica. Que las soluciones de gel fluya entre la placa de vidrio y el aluminio, el caudal debe ser aproximadamente 0,5 mL/min. La aguja debe estar por encima el líquido todo el tiempo, se puede conectar a la parte superior de la placa de cristal con una cinta.</li>
	<li>Cuando las cámaras H y L estén vacíos, llenarlos con agua ultrapura y agua a cubrir suavemente la superficie del gel. La polimerización del gel toma alrededor de 1-2 horas a TA.</li>
	<li>Preparar la solución de acrilamida del 3% (ver receta en la tabla 1) para el apilamiento de gel en RT. Pipetee el gel de apilamiento en la parte superior del gel polimerizado separación (antes de emitir el gel de apilamiento, retire el agua de la superficie del gel de sobreposición) y coloque un peine de gel muestra entre el vidrio y el aluminio la placa evitando las burbujas de aire.<ol>
<li>Dejar para polimerizar 30-60 min en RT. quitar el peine suavemente bajo el agua ultrapura. Guarde el gel en el ° c + 4. Punto de pausa. El gel puede almacenarse a + 4 ° c por unos días. El gel se debe mantener en condiciones de humedad para evitar que se sequen los pozos y la superficie del gel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tilacoides solubilización1,2,3
Nota: Todas las medidas deben realizarse bajo luz muy tenue. Mantener las muestras y tampones en el hielo.
<ol><li>Tilacoides aislados diluida con buffer 25BTH20G helada a una concentración de clorofila final de 1 mg/mL. Para análisis 2D-BN-SDS-PAGE aproximadamente 4-8 μg de clorofila muestra es adecuada. Nota: Los tilacoides utilizadas en los experimentos deben estar aislada de las hojas frescas (para protocolo de aislamiento de tilacoides, ver3)</li>
	<li>Añadir un volumen igual de buffer detergente, es decir, 2% β-DM (w/v) o 2% digitonin (w/v). Mezcle el detergente a la muestra de tilacoides suavemente con la punta de la pipeta y evitar burbujas de aire. La concentración final del detergente es 1% y la de los tilacoides 0.5 mg Chl/mL.<ol>
<li>Solubilizar los tilacoides por 2 min en hielo (β-DM) o 10 minutos a temperatura ambiente con mezcla suave continuo en una mecedora shaker (digitonin). Nota: Digitonin y β-DM se utilizan generalmente para la solubilización de complejos de proteína de tilacoides. Si se utilizan detergentes no iónicos, la concentración de detergente y el tiempo de solubilización deben optimizarse primero. Generalmente el concentración de detergente van de 0.5-5% (v/v). PRECAUCIÓN: Digitonin es tóxico, llevar ropa protectora y guantes</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire el material insolubilized por centrifugación a 18.000 x g por 20 min, a + 4 ° c.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL y añadir 1/10 (v/v) de tampón de enganche a la muestra. Nota: Cuando se examina la composición general de los complejos de proteínas de membrana de tilacoides, determinar el rendimiento y el dominio de tilacoides mentionada de fracción solubilizado se recomienda. Para determinar el rendimiento del material solubilizado, tomar 5 μl del sobrenadante a un tubo nuevo (antes de agregar el CBB) y medir el contenido de Chl y Chl un / b cociente5.</li>
</ol>3. BN-PAGE1,2,3
<ol><li>Configurar el gel a un sistema de electroforesis vertical (por ejemplo, Hoefer SE 250). Llene la cámara de amortiguación superior con tampón de cátodo azul (ver tabla 1) y verter buffer ánodo a la cámara inferior del tampón.</li>
	<li>Carga de tilacoides muestra (por ejemplo, 5 μg de clorofila) en los pocillos.</li>
	<li>La electroforesis y aumente gradualmente la tensión: 75 V durante 30 minutos, 100 V durante 30 minutos, 125 V por 30 min, 150 V durante 1 h y 175 V hasta los complejos se han separado completamente. Correr el gel a + 4, uso de cuarto frío o ajustar la temperatura del gel con un sistema de refrigeración. Nota: Cambiar el búfer del cátodo azul a un búfer de cátodo claro cuando el frente de la muestra ha emigrado cerca de un tercio del gel.</li>
	<li>Después del análisis electroforético, escanear el gel con un escáner fotográfico de archivo de imagen.</li>
</ol>4. 2D-SDS-PAGE
<ol><li>Montar el sistema de electroforesis vertical (gel tamaño 16 cm x 20 cm). Usar a separadores de 1 mm.</li>
	<li>Preparación estándar del gel de SDS (12% de acrilamida, 6 M Urea, ver las recetas en el cuadro 2) con un peine de 2D (solo gran bien para la tira y bien estándar para el marcador de peso molecular).</li>
	<li>Cortar el carril de BN-gel y colocar en un tubo (5 mL). Añadir 2 mL de Tampón Laemmli (contiene 5% β-mercaptoetanol) e incubar a la franja de 45 min con agitación suave a TA.</li>
	<li>Coloque el carril, con la ayuda de por ejemplo, un separador, en la parte superior del gel, evitando burbujas de aire.</li>
	<li>Pipeta de 5 μl del marcador de peso molecular en una estrecha franja de papel de filtro y coloque el papel para el estándar bien.</li>
	<li>Para sellar la tira BN-gel y el papel del marcador, vierte agarosa 0.5% (en buffer de marcha) en la parte superior la tira de gel y dejar para solidificar.</li>
	<li>Realizar electroforesis según protocolos estándar. Después de la electroforesis, visualizar las proteínas con p. ej., tinción Sypro Ruby o coloración según6de plata.</li>
</ol>

<ol><li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li>
<li>Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1005882406718">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li>
<li>Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes%3A+novel+super-+and+mega-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li>
<li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis%3A+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li>
<li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272889803470">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li>
<li>Aro, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+photosystem+II%3A+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li>
<li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+plant+journal+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Schägger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li>
<li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pld3.39">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El mecanismo de conversión de energía fotosintética está compuesto por complejos de grande multisubunit proteína, que se incrustan en la membrana de los tilacoides. Este protocolo describe un método básico para el análisis de los complejos de proteína de tilacoides plantas de Arabidopsis thaliana con BN-PAGE junto con 2D-SDS-PAGE. El protocolo también es adecuado para el análisis de los complejos de la proteína del thylakoid de tilacoides tabaco y espinacas, pero puede necesitar pequeños retoques.
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Grande multisubunit proteína complejos fotosistema PSI y PSII, Cyt b6f y ATPasa coordinan la producción de NADPH y de ATP en las reacciones de luz fotosintéticas. En cloroplastos de plantas superiores, los complejos se encuentran en la membrana del thylakoid, que es una estructura de membrana estructuralmente heterogéneo, compuesto por Appresso grana y tilacoides de estroma no appressed. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) es un método ampliamente utilizado en el análisis de complejos de grande multisubunit proteína en su forma natural y biológicamente activo. El método se estableció para la disección de la membrana mitocondrial proteínas complejos1, pero más tarde se ha personalizado para la separación de complejos de la proteína de la membrana de tilacoides red3. El método es adecuado (i) para la purificación de complejos proteicos de tilacoides individuales para análisis estructural, (ii) para determinar las interacciones nativas entre complejos de la proteína y (iii) para el análisis de la organización general de los complejos de la proteína a cambio de señales ambientales.
Antes de la separación, complejos de la proteína están aislados de la membrana con cuidada detergentes no iónicos, que son generalmente leves y preservar la estructura de los complejos de la proteína nativa. Los detergentes contienen hidrófobos y sitios hidrofílicos y micelas estable forma por encima de cierta concentración, llamada concentración micelar crítica (CMC). Aumento de la concentración de detergente sobre los resultados de la CMC en la interrupción de las interacciones lípido lípido y en la solubilización de complejos de la proteína. La elección del detergente depende la estabilidad de la proteína de interés y de la capacidad de solubilización del detergente. Detergentes usados habitualmente son α/β-dodecil-maltoside y digitonin. Después de la solubilización de complejos de proteína en su estado nativo, material insoluble se elimina por centrifugación. En las plantas superiores, la membrana del thylakoid es altamente heterogénea en la estructura y algunos detergentes (por ejemplo, digitonin) solubilizan selectivamente sólo una fracción específica de la membrana3. Por lo tanto, para caracterizar la organización compleja de la proteína o las interacciones entre los complejos de proteínas, es crucial determinar siempre la capacidad de solubilización del detergente solicitada por determinar el contenido de clorofila y la clorofila a/b proporción de sobrenadante para evaluar el rendimiento y el dominio mentionada tilacoides (sub), respectivamente, de la fracción solubles. La relación clorofila a/b en tilacoides intacto de luz de crecimiento plantas aclimatadas es típicamente alrededor de 3, mientras que la chl un / b el valor de fracciones de tilacoides en grana enriquecido o tilacoides de estroma inferior (~ 2,5) o superior (~ 4.5) el valor del total tilacoides, respectivamente.
Para proporcionar carga negativa a los complejos de proteínas, colorante de (CBB) de azul brillante de Coomassie se agrega a la muestra solubilizada. Debido al cambio de carga, complejos de proteínas migran hacia el ánodo y se separan en un gradiente de acrilamida (AA) según su masa molecular y la forma. Eficaz y de alta resolución de la separación se logra utilizando un gradiente de concentración de acrilamida lineal. Durante la electroforesis, los complejos de proteínas migran hacia el ánodo hasta llegar a su límite de tamaño de poro de tamaño dependiente. El tamaño del poro del gel de poliacrilamida depende de (i) el total acrilamida /bis- acrilamida concentración (T) y (ii) en la vinculante bis- acrilamida monómero concentración (C) en relación con los monómeros total4. Después de la separación con la página de la BN, los complejos de proteína pueden subdividirse aún más en sus subunidades de la proteína individual por segunda dimensión (2D) - SDS - PAGE. Aquí, describimos un protocolo detallado para el análisis de complejos de la proteína de la membrana del thylakoid por BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.

<table><tbody><tr><td>Ácido 6-aminocaproico (ACA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>BisTris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida (AA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td>Precaución: ¡Neurotóxico!</td></tr><tr><td>n-dodecilo-&beta;-D-maltósido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR</td><td>442444H</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VWR</td><td>28877.292</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>J.T. Baker</td><td>7044</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de sodio (NaF)</td><td>J.T. Baker</td><td>3688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sal disódica</td><td>J.T. Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td>Precaución:¡Tóxico!</td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11585916001</td><td></td></tr><tr><td>Serva Coomassie Blue</td><td>G Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>APS (Persulfato de amonio)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED (Tetrametiletilendiamina)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>(N,N'-Metileno)-Bis-Acrilamida</td><td>Omnipur</td><td>2610</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher</td><td>G0800</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de proteínas preteñido, amplio rango (7-175 kDa)</td><td>New England Biolabs</td><td>P7708</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, tubos de centrífuga cónicos 15 ml</td><td>Corning</td><td>352093</td><td></td></tr><tr><td>Doble rueda de gel con placas de 10 x 8 cm</td><td>Hoefer</td><td>SE215</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de degradado SG5</td><td>Hoefer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espaciadores en T de 0,75 mm</td><td>Hoefer</td><td>SE2119T-2-.75</td><td></td></tr><tr><td>Peine de gel de muestra, 0,75 mm</td><td>Hoefer</td><td>SE211A-10-.75</td><td></td></tr><tr><td>Mighty Small Sistema de electroforesis vertical SE250</td><td>Bomba IPC Hoefer</td><td>SE250</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de</td> alimentación <td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, centrífuga PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5097</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424R Rocker-Shaker</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biosan</td><td>BS-010130-AAI</td><td></td></tr><<tr><td>br/> PROTEAN II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651813</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de los complejos de la proteína de membrana de tilacoides por electroforesis nativa azul

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Cadena de transferencia de electrones fotosintética (ETC) convierte energía solar en energía química en forma de NADPH y ATP. Cuatro grandes complejos integrados en la energía solar de la cosecha la membrana del thylakoid para conducir electrones del agua al NADP+ a través de dos fotosistemas y el gradiente del protón creada para la producción de ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b6f (Cyt b6f) y ATPasa son todos los complejos de multiproteínas con distinta orientación y dinámica de la membrana del thylakoid. Puede obtenerse información valiosa sobre la composición e interacciones de los complejos de proteína en la membrana del thylakoid solubilizando los complejos de la integridad de la membrana por detergentes suaves, seguidos por separación electroforética gel nativo de la complejos. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) es un método analítico utilizado para la separación de complejos de proteína en su forma nativa y funcional. El método puede ser utilizado para la purificación de complejos de proteínas para análisis estructural más detallado, pero también proporciona una herramienta para analizar las interacciones dinámicas entre los complejos de proteína. El método fue desarrollado para el análisis de los complejos respiratorios mitocondriales, pero desde entonces ha optimizado y mejorado para la disección de los complejos de proteína de tilacoides. Presentamos un protocolo actualizado detallado para el análisis de los complejos fotosintéticos lábil y sus interacciones en Arabidopsis thaliana.

Un sistema representativo de 2D-BN/SDS-PAGE en la figura 1 muestra la separación de digitonin y complejos de la proteína β-DM-solubilizado tilacoides y su composición de la subunidad de proteína detallada. El patrón complejo de proteína de digitonin solubilizado tilacoides (gel horizontal en la parte superior la parte superior de la figura 1A) contiene el PSII-LHCII-PSI megacomplex, dos grandes supercomplexes de PSII-LHCII (sc), ...

Un protocolo para la aclaración de planta tilacoides proteína compleja organización y composición con poliacrilamida nativa azul gel electroforesis (BN-PAGE) y 2D-SDS-PAGE se describe. El protocolo está optimizado para Arabidopsis thaliana, , pero puede ser utilizado para otras especies de plantas con modificaciones menores.

Análisis de los complejos de la proteína de membrana de tilacoides por electroforesis nativa azul

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la composición y organización dinámica de los complejos de proteínas fotosintéticas en la membrana tilakoide vegetal. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis de interacciones funcionales entre complejos proteicos nativos y aclara la plasticidad de la organización del complejo proteico en diferentes condiciones ambientales. Configure las placas de 10 centímetros de la rueda de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando espaciadores de 0,75 milímetros.Coloque un mezclador de gradiente en una placa de agitación y conéctelo con la bomba peristáltica en tubo. Coloque una aguja de jeringa en el otro extremo del tubo y coloque la aguja entre el vidrio y la placa de aluminio. Coloque un agitador magnético en la cámara pesada.Preparar soluciones de 3,5% y 12,5% de acrilamida en tubos de centrífuga cónica de 15 mililitros, tal como se detalla en el protocolo de texto que se utilizará para el gradiente de gel de separación. Para evitar la polimerización prematura, mantenga los tubos centrífugos sobre hielo mientras prepara las soluciones. Agregue 5%APS y TEMED justo antes de pippetar las soluciones al mezclador de gradiente.Pipetear las soluciones del 12,5% a la cámara pesada. Retire las burbujas de aire del canal que conecta la cámara ligera y pesada abriendo la válvula que conecta las dos cámaras permitiendo que la solución entre a la cámara de luz. Cierre la válvula y pipetee los restos de la solución de vuelta a la cámara pesada.Por último, pipetear la solución del 3,5% a la cámara de luz. Encienda el agitador magnético. Abra las válvulas y encienda la bomba peristáltica.Permita que las soluciones de gel fluyan entre el vidrio y la placa de aluminio a un caudal de aproximadamente 0,5 mililitros por minuto. La aguja debe estar por encima del líquido en todo momento. Cuando las cámaras pesadas y ligeras se hayan vaciado llénalas con agua ultrapura.Y deje que el agua superponga suavemente la superficie del gel. La polimerización en gel tarda aproximadamente una o dos horas a temperatura ambiente. Preparar la solución de 3% de acrilamida para el gel de apilamiento a temperatura ambiente.Pipetear el gel de apilamiento en la parte superior del gel de separación polimerizado y colocar un peine de gel de muestra entre el vidrio y la placa de aluminio evitando las burbujas de aire. Después de permitir que el gel se polimerice durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente, retire el peine suavemente bajo agua ultrapura. En este punto el gel se puede almacenar a cuatro grados Celsius positivos en condiciones húmedas durante unos días.Diluir los tilakoids aislados con un tampón 25BTH20G helado a una concentración final de clorofila de un miligramo por mililitro. Preparar dos tubos para cada muestra de tilakoide para realizar solubilización de beta-DM y digitonina. Ahora agregue un volumen igual de detergente tampón.Mezcle suavemente el detergente y el tilakoide con una pipeta y evite hacer burbujas de aire. Solubilizar los tilakoids durante dos minutos en hielo para la solubilización beta-DM. O 10 minutos a temperatura ambiente con mezcla suave y continua en un balancín o agitador para la solubilización de digitónína.Después de la incubación, retire el material insolubilizado por centrifugación a 18.000 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados positivos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y añada 1/10 volumen de búfer azul brillante coomassie a la muestra. Configure el gel en un sistema de electroforesis vertical.Llene la cámara tampón superior con tampón de cátodo azul y vierta el tampón de ánodo a la cámara tampón inferior. Cargue las muestras de tilakoide en los pozos. Inicie la electroforesis y aumente gradualmente la tensión indicada en el protocolo de texto.Ejecute el gel a cuatro grados centígrados positivos, ya sea utilizando una sala fría o ajustando la temperatura del gel con un sistema de refrigeración. Cambie el búfer de cátodo azul a un búfer de cátodo transparente cuando el frente de la muestra haya migrado aproximadamente 1/3 del gel. Después de la ejecución electroforética escanear el gel con un escáner de fotos para el archivado de imágenes.Para realizar 2-SDS PAGE montar el sistema de electroforesis vertical utilizando espaciadores de un milímetro. Prepare un gel SDS estándar con un peine 2D como se describe en el protocolo de texto. Corte el carril del gel BN y colóquelo en un tubo de cinco mililitros.A continuación, agregue dos mililitros de tampón de Laemmli e incubar la tira durante 45 minutos con un suave temblor a temperatura ambiente. Coloque el carril con la ayuda de un espaciador en la parte superior del gel evitando burbujas de aire. Pipetear cinco microlitros de marcador de peso molecular en un trozo estrecho de papel de filtro y colocar el papel en el pozo estándar.Para sellar la tira de gel BN y el papel marcador verter un 0.5% de agarosa en tampón de funcionamiento en la parte superior de la tira de gel y dejar que se solidifique. Realizar electroforesis de acuerdo con los protocolos estándar. Después de la carrera electroforética visualizar las proteínas con mancha de rubí SUPRO o tinción de plata.Aquí se muestran los resultados representativos de patrones complejos de proteína tilakoide de muestras beta-DM y digitonina-solubilizadas. Los pequeños complejos migran más rápido durante la carrera electroforética y, por lo tanto, están en la parte inferior del gel. Mientras que los grandes complejos están en la parte superior del gel.La digitonina generalmente preserva los complejos proteicos en conjuntos más grandes, mientras que la DM beta interfiere con las interacciones proteína-proteína lábil entre los complejos. Aquí se presenta la composición de la subunidad de los complejos proteicos de los tilakoids beta-DM y digitonina-solubilizados. Las subunidades de cada complejo se encuentran a partir de la línea vertical por debajo del complejo alineado.En principio, cada punto en el gel 2-D representa una proteína individual. Pero en la práctica, varias proteínas de la misma masa molecular pueden estar presentes en un solo punto. La identificación de las manchas se basa en el análisis de espectrometría de masas.Después de aplicar este procedimiento se puede continuar con otros métodos como la microscopía electrónica y el análisis de partículas únicas de los complejos proteicos eluidos del gel nativo azul con el fin de obtener información estructural sobre los complejos proteicos. Para identificar subunidades de proteínas desconocidas, las manchas de proteína individuales de SDS PAGE bidimensionales se pueden analizar con especificaciones de masa. No olvide que trabajar con acrilamida y digitonina puede ser extremadamente dañino y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes protectores durante la realización de este procedimiento.

analysis-thylakoid-membrane-protein-complexes-blue-native-gel

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este video, se describe la caracterización de los complejos multiproteicos (PSM) por el azul electroforesis nativa en gel de poliacrilamida (BN-PAGE). En una primera dimensión, se dializan lisados ​​celulares están separados por BN-PAGE para identificar PSM individual. En una segunda dimensión SDS-PAGE, PSM de interés se subdividen para analizar sus componentes por inmunotransferencia.

Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados ​​celulares

En este video, demostramos una técnica electroforética, llamada PAGE nativa azul, para el análisis de complejos de proteínas respiratorias mitocondriales en su estado plegado nativo y funcionalmente activo. El tinte aniónico azul de Coomassie hace que los complejos de proteínas se carguen negativamente, lo que permite la separación en función del tamaño y la estructura.

Electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul: una técnica de separación no desnaturalizante para el análisis de complejos de cadenas respiratorias mitocondriales intactos

El enfoque descrito comparativa, cuantitativa proteómica tiene por objeto la obtención de conocimientos sobre la composición de los complejos multiproteicos bajo diferentes condiciones y se demuestra comparando genéticamente diferentes cepas. Para el análisis cuantitativo volúmenes iguales de diferentes fracciones de un gradiente de densidad de sacarosa se mezclan y se analizaron por espectrometría de masas.

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas

Este protocolo describe cómo preparar y realizar la electroforesis de atrapamiento de fracción líquida clara nativa eluida en gel (CN-GELFrEE), una técnica de separación nativa para ensamblajes biomoleculares no covalentes y proteínas de muestras heterogéneas que es compatible con varias técnicas de análisis de proteínas posteriores.

CN-GELFrEE - eluida-gel transparente nativo fracción líquida atrapamiento de electroforesis

El método de Purificación por Afinidad en Tándem (TAP) se ha utilizado ampliamente para aislar complejos nativos de extractos celulares, principalmente eucariotas, para proteómica. Aquí, presentamos un protocolo de método TAP optimizado para la purificación de complejos nativos para estudios estructurales.

Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Este protocolo describe la separación de complejos funcionales de cadenas de transporte de electrones mitocondriales (Cx) IV y sus supercomplejos utilizando electroforesis nativa para revelar información sobre su ensamblaje y estructura. El gel nativo puede someterse a inmunotransferencia, ensayos en gel y purificación por electroelución para caracterizar adicionalmente los complejos individuales.

Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

Aquí presentamos un protocolo para separar complejos de tilacoides solubilizado por electroforesis nativa en verde. Bandas de gel verde posteriormente se caracterizan por tiempo correlacionó solo fotón contando (TCSPC) y pasos básicos para el análisis de los datos se proporcionan.

Separación de espinacas tilacoides complejos de proteínas por electroforesis en Gel verde nativo y caracterización de banda utilizando conteo de fotones solo Time-Correlated

Este protocolo muestra el análisis de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial por electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul. Aquí se describe el método aplicado a las células humanas cultivadas.

Análisis de complejos de cadena respiratoria mitocondrial en células humanas cultivadas usando electroforesis en Gel de poliacrilamida nativo azul e Immunoblotting

Aquí presentamos un protocolo para extraer, resolver e identificar los supercomplejos mitocondriales que minimizan la exposición a los detergentes y al azul de Coomassie. Este protocolo ofrece un equilibrio óptimo entre la resolución y la preservación de las actividades enzimáticas, al tiempo que minimiza el riesgo de pérdida de interacciones entre proteínas y proteínas del lábil.

Híbrido claro/azul electroforesis nativa para la separación y análisis de Supercomplejos de cadenas respiratorias mitocondriales

Las proteinasas son vitales para la patogénesis bacteriana, lo que permite la invasión y la evasión inmune. La extracción en un solo paso de proteínas citoplasmáticas y de membrana de bacterias en su forma activa es desgarradora. Este artículo en video demuestra la extracción de proteínas celulares completas de Leptospira para el análisis de zimografía para detectar y caracterizar gelatinasas.

Extracción y análisis zimográfico de gelatinasas bacterianas en un solo paso

Aprende a analizar complejos proteicos de tilacoides mediante electroforesis nativa azul (BN-PAGE) y SDS-PAGE bidimensional en Arabidopsis thaliana. Este método revela la organización dinámica de complejos fotosintéticos.

Análisis de los complejos de la proteína de membrana de tilacoides por electroforesis nativa azul

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