Análisis de los complejos de la proteína de membrana de tilacoides por electroforesis nativa azul
28 de septiembre de 2018
Un protocolo para la aclaración de planta tilacoides proteína compleja organización y composición con poliacrilamida nativa azul gel electroforesis (BN-PAGE) y 2D-SDS-PAGE se describe. El protocolo está optimizado para Arabidopsis thaliana, , pero puede ser utilizado para otras especies de plantas con modificaciones menores.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la composición y organización dinámica de los complejos de proteínas fotosintéticas en la membrana tilakoide vegetal. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis de interacciones funcionales entre complejos proteicos nativos y aclara la plasticidad de la organización del complejo proteico en diferentes condiciones ambientales. Configure las placas de 10 centímetros de la rueda de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando espaciadores de 0,75 milímetros.
Coloque un mezclador de gradiente en una placa de agitación y conéctelo con la bomba peristáltica en tubo. Coloque una aguja de jeringa en el otro extremo del tubo y coloque la aguja entre el vidrio y la placa de aluminio. Coloque un agitador magnético en la cámara pesada.
Preparar soluciones de 3,5% y 12,5% de acrilamida en tubos de centrífuga cónica de 15 mililitros, tal como se detalla en el protocolo de texto que se utilizará para el gradiente de gel de separación. Para evitar la polimerización prematura, mantenga los tubos centrífugos sobre hielo mientras prepara las soluciones. Agregue 5%APS y TEMED justo antes de pippetar las soluciones al mezclador de gradiente.
Pipetear las soluciones del 12,5% a la cámara pesada. Retire las burbujas de aire del canal que conecta la cámara ligera y pesada abriendo la válvula que conecta las dos cámaras permitiendo que la solución entre a la cámara de luz. Cierre la válvula y pipetee los restos de la solución de vuelta a la cámara pesada.
Por último, pipetear la solución del 3,5% a la cámara de luz. Encienda el agitador magnético. Abra las válvulas y encienda la bomba peristáltica.
Permita que las soluciones de gel fluyan entre el vidrio y la placa de aluminio a un caudal de aproximadamente 0,5 mililitros por minuto. La aguja debe estar por encima del líquido en todo momento. Cuando las cámaras pesadas y ligeras se hayan vaciado llénalas con agua ultrapura.
Y deje que el agua superponga suavemente la superficie del gel. La polimerización en gel tarda aproximadamente una o dos horas a temperatura ambiente. Preparar la solución de 3% de acrilamida para el gel de apilamiento a temperatura ambiente.
Pipetear el gel de apilamiento en la parte superior del gel de separación polimerizado y colocar un peine de gel de muestra entre el vidrio y la placa de aluminio evitando las burbujas de aire. Después de permitir que el gel se polimerice durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente, retire el peine suavemente bajo agua ultrapura. En este punto el gel se puede almacenar a cuatro grados Celsius positivos en condiciones húmedas durante unos días.
Diluir los tilakoids aislados con un tampón 25BTH20G helado a una concentración final de clorofila de un miligramo por mililitro. Preparar dos tubos para cada muestra de tilakoide para realizar solubilización de beta-DM y digitonina. Ahora agregue un volumen igual de detergente tampón.
Mezcle suavemente el detergente y el tilakoide con una pipeta y evite hacer burbujas de aire. Solubilizar los tilakoids durante dos minutos en hielo para la solubilización beta-DM. O 10 minutos a temperatura ambiente con mezcla suave y continua en un balancín o agitador para la solubilización de digitónína.
Después de la incubación, retire el material insolubilizado por centrifugación a 18.000 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados positivos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y añada 1/10 volumen de búfer azul brillante coomassie a la muestra. Configure el gel en un sistema de electroforesis vertical.
Llene la cámara tampón superior con tampón de cátodo azul y vierta el tampón de ánodo a la cámara tampón inferior. Cargue las muestras de tilakoide en los pozos. Inicie la electroforesis y aumente gradualmente la tensión indicada en el protocolo de texto.
Ejecute el gel a cuatro grados centígrados positivos, ya sea utilizando una sala fría o ajustando la temperatura del gel con un sistema de refrigeración. Cambie el búfer de cátodo azul a un búfer de cátodo transparente cuando el frente de la muestra haya migrado aproximadamente 1/3 del gel. Después de la ejecución electroforética escanear el gel con un escáner de fotos para el archivado de imágenes.
Para realizar 2-SDS PAGE montar el sistema de electroforesis vertical utilizando espaciadores de un milímetro. Prepare un gel SDS estándar con un peine 2D como se describe en el protocolo de texto. Corte el carril del gel BN y colóquelo en un tubo de cinco mililitros.
A continuación, agregue dos mililitros de tampón de Laemmli e incubar la tira durante 45 minutos con un suave temblor a temperatura ambiente. Coloque el carril con la ayuda de un espaciador en la parte superior del gel evitando burbujas de aire. Pipetear cinco microlitros de marcador de peso molecular en un trozo estrecho de papel de filtro y colocar el papel en el pozo estándar.
Para sellar la tira de gel BN y el papel marcador verter un 0.5% de agarosa en tampón de funcionamiento en la parte superior de la tira de gel y dejar que se solidifique. Realizar electroforesis de acuerdo con los protocolos estándar. Después de la carrera electroforética visualizar las proteínas con mancha de rubí SUPRO o tinción de plata.
Aquí se muestran los resultados representativos de patrones complejos de proteína tilakoide de muestras beta-DM y digitonina-solubilizadas. Los pequeños complejos migran más rápido durante la carrera electroforética y, por lo tanto, están en la parte inferior del gel. Mientras que los grandes complejos están en la parte superior del gel.
La digitonina generalmente preserva los complejos proteicos en conjuntos más grandes, mientras que la DM beta interfiere con las interacciones proteína-proteína lábil entre los complejos. Aquí se presenta la composición de la subunidad de los complejos proteicos de los tilakoids beta-DM y digitonina-solubilizados. Las subunidades de cada complejo se encuentran a partir de la línea vertical por debajo del complejo alineado.
En principio, cada punto en el gel 2-D representa una proteína individual. Pero en la práctica, varias proteínas de la misma masa molecular pueden estar presentes en un solo punto. La identificación de las manchas se basa en el análisis de espectrometría de masas.
Después de aplicar este procedimiento se puede continuar con otros métodos como la microscopía electrónica y el análisis de partículas únicas de los complejos proteicos eluidos del gel nativo azul con el fin de obtener información estructural sobre los complejos proteicos. Para identificar subunidades de proteínas desconocidas, las manchas de proteína individuales de SDS PAGE bidimensionales se pueden analizar con especificaciones de masa. No olvide que trabajar con acrilamida y digitonina puede ser extremadamente dañino y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes protectores durante la realización de este procedimiento.
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Resumen
Este artículo describe un protocolo para analizar la organización y composición de complejos proteicos tilacoides vegetales mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE) y electroforesis en gel 2D-SDS-PAGE. Aunque está optimizado para Arabidopsis thaliana, el método puede adaptarse a otras especies vegetales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología vegetal
- Fotosíntesis
- Análisis de complejos proteicos
Antecedentes
- Comprender la composición de los complejos de proteínas fotosintéticas es fundamental para la biología vegetal.
- Las membranas tilacoides desempeñan un papel clave en la fotosíntesis.
- La organización de los complejos proteicos puede variar bajo diferentes condiciones ambientales.
- La BN-PAGE permite el análisis de complejos proteicos nativos.
Objetivo del estudio
- Elucidar la organización y composición de los complejos de proteínas tilacoides.
- Investigar las interacciones funcionales entre complejos de proteínas.
- Evaluar la plasticidad de la organización de los complejos de proteínas.
Métodos Utilizados
- Electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE)
- Electroforesis en gel SDS-PAGE bidimensional (2D-SDS-PAGE)
- Configuración del mezclador de gradientes para la preparación del gel
- Uso de bomba peristáltica y agitador magnético para la elaboración del gel
Resultados principales
- El protocolo revela con éxito la composición de los complejos de proteínas tilacoides.
- Se pueden analizar las interacciones funcionales entre complejos de proteínas nativos.
- Se puede evaluar la organización dinámica de los complejos de proteínas bajo condiciones variables.
- Se confirma la adaptabilidad del método para diferentes especies vegetales.
Conclusiones
- Este método proporciona información sobre la organización de los complejos de proteínas fotosintéticas.
- Mejora la comprensión de la adaptabilidad de las proteínas vegetales a los cambios ambientales.
- El protocolo puede ser una herramienta valiosa para investigadores que estudian la biología vegetal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la composición y la organización dinámica de los complejos de proteínas fotosintéticas proporciona información mecanicista sobre las vías de conversión de energía relevantes para el desarrollo de productos basados en biotecnología. La electroforesis en gel nativo azul permite el análisis de interacciones funcionales de ensamblajes nativos de múltiples proteínas, lo que facilita la validación de objetivos en sistemas fotosintéticos. Este método ayuda a reducir los riesgos de hipótesis en etapas iniciales al aclarar la estabilidad de los complejos y sus interacciones bajo condiciones ambientales variables.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la determinación de la composición de complejos proteicos nativos y la organización de sus subunidades en membranas tilacoides.
- Valor operativo: Permite la desactivación de riesgos biológicos mediante la visualización directa de la plasticidad y estabilidad de los complejos bajo condiciones controladas de solubilización.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos al distinguir interacciones proteína-proteína estables frente a lábiles, utilizando detergentes digitonina frente a beta-DM.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Preparación para ensayos: Prepara complejos tilacoides solubilizados para análisis posteriores mediante separación estandarizada por BN-PAGE con patrones de migración reproducibles.
- Resultado cuantitativo: Genera perfiles de complejos resolubles que permiten la comparación de estados de ensamblaje entre diferentes condiciones experimentales.
- Reutilización de la plataforma: Facilita un análisis posterior por 2D-SDS-PAGE para la identificación de subunidades, extendiendo su utilidad más allá del perfilado inicial de complejos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Traductiva: Conecta la organización compleja en fase de descubrimiento con el rendimiento funcional fotosintético bajo distintos factores de estrés ambiental.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Clarifica cómo las perturbaciones ambientales afectan el ensamblaje de supercomplejos, aportando información a modelos predictivos de la robustez de las vías.
- Alineación de Biomarcadores: Permite el monitoreo de la disociación o reensamblaje de complejos como posibles indicadores de la eficiencia fotosintética.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en flujos de trabajo de descubrimiento temprano donde se requiere la integridad del complejo nativo antes del análisis reduccionista, permitiendo avanzar desde el aislamiento de orgánulos hasta la interrogación funcional y el seguimiento estructural.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la integridad de la cadena de transporte de electrones fotosintética mediante la resolución de los complejos PSII, PSI, Cyt b6f y ATPasa en su forma nativa.
- Tamizaje: Proporciona perfiles de complejos listos para ensayos con resolución cuantitativa de bandas para el análisis comparativo de los efectos de la solubilización con detergentes.
- Análisis: Genera lecturas basadas en la migración que permiten a los equipos comparar la estabilidad y abundancia de los complejos en distintas condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona la organización de los complejos con la función fotosintética, estableciendo un vínculo con los resultados fenotípicos bajo condiciones de estrés.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el perfilado de complejos de proteínas de membrana en sistemas vegetales, adaptable a otras especies mediante ajustes del protocolo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos al preservar las interacciones nativas y elucidar las dinámicas complejas.
- Valor operativo: Asegura la estandarización mediante la elaboración de geles con gradiente y la separación electroforética reproducible bajo temperatura controlada.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o detención al reducir la ambigüedad mecanicista en la ingeniería de vías fotosintéticas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en perfiles complejos de estabilidad e interacción.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la solubilización de proteínas de membrana y en técnicas electroforéticas nativas.
- Depende de un mezclador de gradientes, una bomba peristáltica y sistemas electroforéticos verticales con control de temperatura.
- Necesita la estandarización de protocolos de solubilización con detergentes (beta-DM frente a digitonina) para garantizar la preservación reproducible de los complejos.
- Incluye consideraciones de adaptación para diferentes especies vegetales debido a las variaciones en la composición de las membranas tilacoides.
- Comprende limitaciones prácticas, como la ruptura de complejos inestables por beta-DM y la necesidad de compatibilidad con cuartos fríos o sistemas de enfriamiento durante la electroforesis.
