Name: 蓝色本机凝胶电泳法分析囊体膜蛋白配合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学习使用蓝色本机凝胶电泳技术分析拟南芥囊体膜蛋白配合物的组成与动态组织。该方法可揭示光合蛋白复合物的功能相互作用及其在环境变化中的可塑性。

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本研究由芬兰科学院（项目编号 307335 和 303757）以及“太阳能转化为生物质”（SE2B）玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议（675006）提供资金支持。本实验方案基于参考文献3。

1. 准备BN凝胶1,2,3
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用 0.75 mm 间隔垫，将 8 cm × 10 cm 的玻璃板（矩形玻璃板和带凹槽的氧化铝板）安装到凝胶铸模器中。</li>
	<li>将梯度混合器置于磁力搅拌器上，并通过一段软管将其与蠕动泵连接。将注射器针头连接到软管的另一端，并将针头置于玻璃板与铝板之间。将磁力搅拌子放入“重”（H）室中。</li>
	<li>在 15 mL 圆锥形离心管中配制用于分离胶梯度的 3.5%（v/v）和 12.5%（v/v）丙烯酰胺（AA）溶液（参见表 1中的配方）。为防止过早聚合，在配制过程中将离心管置于冰上。 
	注意：丙烯酰胺具有神经毒性和致癌性，操作时应穿戴防护服和手套。</li>
	<li>在将溶液移入梯度混合器前，立即加入 5% 过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）。将 12.5% 的溶液移入 H 室。
	<ol>
		<li>打开连接“轻”（L）室与 H 室的阀门，使溶液流入 L 室，以排除连接通道中的气泡。关闭阀门，并将残留溶液重新移回 H 室。</li>
		<li>最后，将 3.5% 的溶液移入 L 室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动磁力搅拌器（搅拌速度无需精确，但应确保重液与轻液充分混合），打开阀门并启动蠕动泵。使凝胶溶液在玻璃板与铝板之间流动，流速约为 0.5 mL/min。针头必须始终位于液面之上，可用胶带将其固定在玻璃板上端。</li>
	<li>当 H 室和 L 室中的溶液排空后，向其中加入超纯水，使水&#160;缓慢覆盖凝胶表面。凝胶在室温下聚合约需 1–2 小时。</li>
	<li>在室温下配制 3% 丙烯酰胺溶液（参见表 1中的配方）用于浓缩胶。在聚合完成的分离胶上层灌注浓缩胶（灌胶前需去除覆盖在凝胶表面的水），并在玻璃板与铝板之间插入样品梳，避免产生气泡。
	<ol>
		<li>在室温下静置聚合 30–60 分钟。在超纯水中轻轻取出梳子。将凝胶储存于 +4 ˚C。 
		暂停点：凝胶可在 +4 ˚C 下保存数天。应保持湿润环境，防止加样孔和凝胶表面干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 类囊体膜的溶解1,2,3
注意：所有步骤均应在极弱光条件下进行。样品和缓冲液需保持在冰上。
<ol>
	<li>用预冷的25BTH20G缓冲液稀释分离的类囊体，使叶绿素终浓度为1 mg/mL。用于2D-BN-SDS-PAGE分析时，大约需要4-8 &#181;每克叶绿素/样品较为合适。 
	注意：实验中所用的类囊体必须从新鲜叶片中分离（类囊体分离方案详见3)</li>
	<li>加入等体积的去污剂缓冲液， 即， 2% &#946;-DM（w/v）或 2% 皂苷（w/v）。用移液枪头轻轻将去垢剂与类囊体样品混合，避免产生气泡。最终去垢剂浓度为 1%，类囊体浓度为 0.5 mg Chl/mL。
	<ol>
		<li>在冰上孵育 2 分钟以溶解类囊体（&#946;-DM）或在室温下用摇床/振荡器持续轻柔混匀10分钟（皂苷）。 
		注意：皂苷素（digitonin）和 &#946;-DM 通常用于溶解类囊体蛋白复合物。若使用其他非离子型去污剂，必须首先优化去污剂浓度和溶解时间。去污剂浓度通常在 0.5%–5%（v/v）范围内。 
		注意：皂苷毒性强，操作时需穿戴防护服和手套</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 °C、18,000 × g 条件下离心 20 分钟，去除不溶物 &#730;C.</li>
	<li>将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，并向样品中加入1/10（v/v）的CBB缓冲液。 
	注意：当检测类囊体膜蛋白复合物的整体组成时，建议确定可溶化组分的得率及其代表的类囊体结构域。为确定可溶化物质的得率，取5 &#181;将上清液 1 L 转移至新试管（加入考马斯亮蓝之前），测定叶绿素含量及叶绿素 a/b 比值5.</li>
</ol>
3. BN-PAGE1,2,3
<ol>
	<li>将凝胶安装至垂直电泳系统中例如， Hoefer SE 250）。将蓝色阴极缓冲液加入上层缓冲液室（参见 表1）并将阳极缓冲液倒入下层缓冲室。</li>
	<li>上样类囊体样品（例如， 5 &#181;g 叶绿素）加入到加样孔中。</li>
	<li>开始电泳并逐步提高电压：75 V 运行 30 分钟，100 V 运行 30 分钟，125 V 运行 30 分钟，150 V 运行 1 小时，然后 175 V 持续运行直至蛋白复合物完全分离。将凝胶在 +4 °C 条件下运行&#730;C，可使用低温室或通过冷却系统调节凝胶温度。 
	注意：当样品前沿迁移至凝胶约三分之一处时，将蓝色阴极缓冲液更换为透明阴极缓冲液。</li>
	<li>电泳结束后，使用照片扫描仪扫描凝胶以存档图像。</li>
</ol>
4. 二维SDS-PAGE
<ol>
	<li>组装垂直电泳系统（凝胶尺寸为 16 cm × 20 cm），使用 1 mm 间隔垫片。</li>
	<li>制备标准 SDS 凝胶（12% 丙烯酰胺，6 M 尿素，配方见表 2），使用 2D 梳子（一个大孔用于胶条，一个标准孔用于分子量标记）。</li>
	<li>切下 BN 凝胶的泳道，放入 (5 mL) 离心管中。加入 2 mL Laemmli 缓冲液（含 5% β-巯基乙醇），在室温下轻轻振荡孵育 45 分钟。</li>
	<li>借助e.g., 间隔垫片等工具，将胶条置于凝胶上方，避免产生气泡。</li>
	<li>将 5 µL 分子量标记液加到一小片滤纸上，然后将滤纸放入标准加样孔中。</li>
	<li>为密封 BN 凝胶条和标记滤纸，在胶条上方加入 0.5% 琼脂糖（溶于电泳缓冲液中），待其凝固。</li>
	<li>按照标准电泳程序进行电泳。电泳结束后，使用e.g., Sypro Ruby 染色或银染法对蛋白质进行显色6。</li>
</ol>

<ol><li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li>
<li>Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1005882406718">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li>
<li>Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes%3A+novel+super-+and+mega-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li>
<li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis%3A+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li>
<li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272889803470">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li>
<li>Aro, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+photosystem+II%3A+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li>
<li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+plant+journal+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Schägger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li>
<li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pld3.39">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

光合作用能量转换系统由嵌入类囊体膜中的大型多亚基蛋白复合物组成。本方案描述了一种利用非变性凝胶电泳（BN-PAGE）结合二维SDS-PAGE分析拟南芥（Arabidopsis thaliana）类囊体蛋白复合物的基本方法。该方案也适用于烟草和菠菜类囊体蛋白复合物的分析，但可能需要进行少量调整。
为了溶解膜蛋白复合物，通常使用非离子型去污剂，因其能够保持复合物的天然构象。本研究中采用了两种常用的去污剂：β-DM 和皂苷（digitonin）。十二烷基麦芽糖苷（dodecyl maltoside）可溶解单个蛋白复合物，而皂苷则适用于较大蛋白复合物组装体的分析10。由于皂苷分子结构较大，无法进入紧密堆叠的基粒类囊体区域，因此仅能溶解类囊体膜中非堆叠区域3,11。这使其适用于基质类囊体和基粒边缘区域的分析。然而，当皂苷与氨基己酸（aminocaproic acid, ACA）联合使用时，该组合可溶解整个类囊体...

大型多亚基蛋白复合物光系统PSI和PSII、细胞色素b6f以及ATP合酶共同协调光合作用光反应中NADPH和ATP的生成。在高等植物叶绿体中，这些复合物位于类囊体膜上，该膜是一种结构异质性的膜系统，由堆叠的基粒类囊体和非堆叠的基质类囊体组成。蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）是一种广泛用于分析大型多亚基蛋白复合物天然且具有生物学活性形式的方法。该方法最初建立用于线粒体膜蛋白复合物的解析1，随后被优化用于分离类囊体膜网络中的蛋白复合物3。该方法适用于：（i）纯化单个类囊体蛋白复合物以进行结构分析；（ii）确定蛋白复合物之间的天然相互作用；以及（iii）分析在不同环境信号变化下蛋白复合物整体组织结构的变化。
在分离之前，需使用精心选择的非离子型去垢剂从膜中分离蛋白质复合物，这类去垢剂通常较为温和，能够保持蛋白质复合物的天然结构。去垢剂含有疏水和亲水位点，在达到一定浓度（称为临界胶束浓度，CMC）以上时可形成稳定的胶束。当去垢剂浓度超过CMC时，会破坏脂质-脂质相互作用，从而使蛋白质复合物溶解。去垢剂的选择取决于目标蛋白质复合物的稳定性以及去垢剂的溶解能力。常规使用的去垢剂包括α/β-十二烷基麦芽糖苷（α/β-dodecyl-maltoside）和皂苷（digitonin）。在保持蛋白质复合物天然状态的前提下完成溶解后，通过离心去除不溶性物质。在高等植物中，类囊体膜在结构上具有高度异质性，某些去垢剂（例如，digitonin）仅选择性地溶解膜的特定部分3。因此，为了表征蛋白质复合物的组织结构或复合物之间的相互作用，必须通过测定上清液中的叶绿素含量以及上清液与沉淀中叶绿素a/b比值，来评估所选去垢剂的溶解能力，分别反映可溶部分的得率及其代表的类囊体（亚）区域。在适应生长光条件的植物中，完整类囊体的叶绿素a/b比值通常约为3，而富含基粒或基质类囊体的类囊体组分，其叶绿素a/b比值则分别低于（约2.5）或高于（约4.5）总类囊体的该比值。
为了给蛋白质复合物提供负电荷，将考马斯亮蓝（CBB）染料加入溶解后的样品中。由于电荷的改变，蛋白质复合物向阳极迁移，并根据其分子质量和形状在丙烯酰胺（AA）梯度凝胶中实现分离。通过使用线性丙烯酰胺浓度梯度，可实现高效且高分辨率的分离。在电泳过程中，蛋白质复合物向阳极迁移，直至达到与其大小相关的孔径极限。聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小取决于（i）总丙烯酰胺/bis-丙烯酰胺浓度（T）以及（ii）交联剂bis-丙烯酰胺单体浓度（C）相对于总单体的比例4。在通过BN-PAGE完成分离后，可通过第二维（2D）SDS-PAGE将蛋白质复合物进一步分离为其各自的蛋白质亚基。本文详细描述了利用BN-PAGE/2D-SDS-PAGE分析类囊体膜蛋白质复合物的实验方案。

<table><tbody><tr><td>6-氨基己酸（ACA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>BisTris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺（AA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td>注意：具有神经毒性！</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR</td><td>442444H</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>VWR</td><td>28877.292</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>J.T. Baker</td><td>7044</td><td></td></tr><tr><td>氟化钠（NaF）</td><td>J.T. Baker</td><td>3688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐</td><td>J.T. Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td>注意：有毒！</td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11585916001</td><td></td></tr><tr><td>Serva 考马斯亮蓝 G</td><td>Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>APS（过硫酸铵）</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED（四甲基乙二胺）</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>（N,N'-亚甲基）双丙烯酰胺</td><td>Omnipur</td><td>2610</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher</td><td>G0800</td><td></td></tr><tr><td>预染蛋白 Marker，宽范围（7–175 kDa）</td><td>New England Biolabs</td><td>P7708</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml 锥形离心管</td><td>Corning</td><td>352093</td><td></td></tr><tr><td>双凝胶铸模装置，配有 10 × 8 cm 板</td><td>Hoefer</td><td>SE215</td><td></td></tr><tr><td>梯度混合器 SG5</td><td>Hoefer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm T 型间隔片</td><td>Hoefer</td><td>SE2119T-2-.75</td><td></td></tr><tr><td>样品胶梳，0.75 mm</td><td>Hoefer</td><td>SE211A-10-.75</td><td></td></tr><tr><td>Mighty Small SE250 垂直电泳系统</td><td>Hoefer</td><td>SE250</td><td></td></tr><tr><td>IPC 泵</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电源，PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5097</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>摇床-振荡器</td><td>Biosan</td><td>BS-010130-AAI</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; PROTEAN II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651813</td><td></td></tr></tbody></table>

通过蓝色天然凝胶电泳分析类囊体膜蛋白复合物

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

光合电子传递链（ETC）将太阳能转化为NADPH和ATP形式的化学能。嵌入类囊体膜中的四个大型蛋白复合物利用太阳能，通过两个光系统将电子从水传递至NADP+，并利用所产生的质子梯度合成ATP。光系统PSII、PSI、细胞色素b6f（Cyt b6f）和ATP合酶均为多亚基蛋白复合物，在类囊体膜中具有特定的空间取向和动态行为。通过温和去垢剂将这些复合物从保持完整性的膜中溶解出来，再经非变性凝胶电泳分离，可获得有关类囊体膜中蛋白复合物组成及其相互作用的有价值信息。蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）是一种用于在天然且有功能的状态下分离蛋白复合物的分析方法。该方法既可用于蛋白复合物的纯化以进行更深入的结构分析，也可作为研究蛋白复合物间动态相互作用的工具。该技术最初为线粒体呼吸链蛋白复合物分析而开发，现已针对类囊体蛋白复合物的研究进行了优化和改进。本文提供了一个详细且最新的实验方案，用于分析拟南芥（Arabidopsis thaliana）中不稳定的光合蛋白复合物及其相互作用。

一种具有代表性的二维氮化硼/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统 图1 展示了皂苷素和β-DM溶解的类囊体蛋白复合物的分离及其蛋白质亚基组成的详细分析。皂苷素溶解类囊体的蛋白复合物图谱（上方水平胶） 图1A包含PSII-LHCII-PSI巨型复合物、两个大型PSII-LHCII超级复合物（sc）、PSI-LHCII超级复合物、PSI单体（m）以及PSII m/Cyt b6f，松散结合的（L）-LHCII三聚体（图1A）。稍强的去垢剂β-DM可溶解整个类囊体膜（顶部的水平凝胶） 图1B)，但无法保留蛋白质复合物之间的弱相互作用。使用β-DM溶解类囊体通常会产生四种PSII-LHCII超级复合物（结合不同数量的LHCII天线）、PSII二聚体（d）和PSI单体、ATP酶、PSII单体以及细胞色素b6f、...

一种利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和二维SDS-PAGE解析植物类囊体蛋白复合物结构与组成的实验方案被详细描述。该方案已针对 拟南芥, 但经过少量修改后也可用于其他植物物种。

光合电子传递链（ETC）将太阳能转化为化学能，形成 NADPH 和 ATP。四个嵌入在...中的大型蛋白质复合物

该方法有助于解答有关植物类囊体膜中光合作用蛋白复合物组成及其动态组织方式的关键问题。该技术的主要优势在于，能够分析天然蛋白复合物之间的功能相互作用，并揭示在不同环境条件下蛋白复合物组织的可塑性。根据制造商的说明，使用0.75毫米间隔片安装凝胶铸模器，配置8厘米×10厘米的玻璃板。将梯度混合器置于搅拌台上，并用管路将其与蠕动泵连接。将注射器针头连接到管路的另一端，并将针头放置在玻璃板与铝板之间。将磁力搅拌子放入较重的腔室中。按照文本方案中的说明，在15毫升锥形离心管中配制3.5%和12.5%的丙烯酰胺溶液，用于制备分离胶梯度。为防止过早聚合，在配制溶液期间应将离心管置于冰上。在将溶液转移至梯度混合器之前，立即加入5%过硫酸铵（APS）和TEMED。用移液器将12.5%的溶液转移至重液室。打开连接轻液室与重液室的阀门，使溶液流入轻液室，从而排出连接通道中的气泡。关闭阀门，并将残留的溶液重新移回重液室。最后，用移液器将3.5%的溶液加入光反应室中。打开磁力搅拌器。打开阀门，并启动蠕动泵。让凝胶溶液在玻璃板和铝板之间以大约每分钟0.5毫升的流速流动。针头必须始终位于液面之上。当重链室和轻链室排空后，用超纯水将其重新充满。让水缓慢地覆盖在凝胶表面。凝胶聚合在室温下需要约一到两小时。在室温下配制用于浓缩胶的3%丙烯酰胺溶液。用移液器将浓缩胶加在已聚合的分离胶上方，并在玻璃板和铝板之间插入样品胶梳，注意避免产生气泡。室温下静置聚合30至60分钟后，在超纯水中轻轻取出胶梳。此时，凝胶可在湿润条件下于4°C保存数天。用预冷的25BTH20G缓冲液将分离的类囊体稀释至叶绿素终浓度为1毫克/毫升。每种类囊体样品准备两管，分别用于β-DM和皂苷溶剂化处理。然后加入等体积的去垢剂缓冲液。用移液器轻轻混合去污剂和类囊体样品，避免产生气泡。对于β-DM溶解，将类囊体在冰上溶解两分钟；对于皂苷溶解，则在室温下持续轻柔地在摇床或振荡器上混合10分钟。孵育结束后，在4°C条件下以18,000 g离心20分钟，去除不溶性物质。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并向样品中加入十分之一体积的考马斯亮蓝缓冲液。在垂直电泳系统中安装凝胶。向阳极缓冲液室中加入蓝色阴极缓冲液，并将阳极缓冲液倒入下层缓冲液室。将类囊体样品加入上样孔中。启动电泳，并按照文本方案中列出的条件逐步增加电压。在4°C条件下运行凝胶电泳，可通过冷室或使用冷却系统调节凝胶温度来实现。当样品前沿迁移至凝胶约三分之一处时，将蓝色阴极缓冲液更换为无色阴极缓冲液。电泳结束后，使用图像扫描仪对凝胶进行扫描以存档图像。进行2-SDS PAGE时，使用一毫米垫片组装垂直电泳系统。按照文本方案中的描述，制备含有2-D梳子的标准SDS凝胶。切下BN凝胶中的泳道，并将其放入5毫升离心管中。然后加入 2 毫升 Laemmli 缓冲液，将条带在室温下轻轻振荡孵育 45 分钟。借助间隔器将条带放置在凝胶上方，避免产生气泡。取 5 微升分子量标记物滴加到一小条窄滤纸上，并将滤纸放入标准加样孔中。为了密封BN胶条和标记纸，将0.5%琼脂糖运行缓冲液倒在胶条上方，使其凝固。按照标准方案进行电泳。电泳结束后，使用SUPRO Ruby染色或银染法对蛋白质进行显色观察。此处展示了使用β-DM和皂苷溶解释放的类囊体蛋白复合物模式的代表性结果。在电泳过程中，较小的复合物迁移较快，因此位于凝胶的下部，而较大的复合物则位于凝胶的上部。Digitonin 通常能够保持蛋白质复合物在较大组装结构中的完整性，而 beta DM 则会干扰复合物之间不稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。本文展示了经 beta-DM 和 digitonin 溶解的类囊体中蛋白质复合物的亚基组成。每个复合物的亚基可通过其下方对应的垂直线确定。理论上，二维凝胶中的每个点代表一种单独的蛋白质。但实际上，一个点中可能含有多种分子质量相同的蛋白质。这些点的鉴定依赖于质谱分析。应用此方法后，可进一步采用其他技术，如电子显微镜及对从蓝色天然凝胶中洗脱的蛋白质复合物进行单颗粒分析，以获得蛋白质复合物的结构信息。为了鉴定未知的蛋白质亚基，可对二维SDS-PAGE中的各个蛋白质斑点进行质谱分析。请注意，丙烯酰胺和皂苷（digitonin）具有极强的危害性，在操作本实验流程时，务必采取防护措施，例如佩戴防护手套。

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科研

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Biochemistry

生物化学

蓝色本机凝胶电泳法分析囊体膜蛋白配合物

在本视频中，我们介绍了通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）对多蛋白复合物（MPCs）进行表征的方法。在第一维中，将透析后的细胞裂解液通过BN-PAGE分离，以鉴定各个MPCs。在第二维SDS-PAGE中，对感兴趣的MPCs进一步分离，以便通过免疫印迹分析其组成成分。...

用于分析细胞裂解液中多蛋白复合物的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）

在本视频中，我们演示了一种称为蓝色天然PAGE的电泳技术，用于分析线粒体呼吸蛋白复合物在其天然折叠且功能活性状态下的情况。阴离子考马斯亮蓝染料使蛋白复合物带负电荷，从而能够基于其大小和结构进行分离。...

蓝非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种用于分析完整线粒体呼吸链复合物的非变性分离技术

所述的比较性定量蛋白质组学方法旨在深入了解不同条件下多蛋白复合物的组成 ，并通过比较遗传背景不同的菌株来加以示范。在定量分析中，将蔗糖密度梯度离心中不同组分的等体积样品混合后，通过质谱进行分析。...

基于15N代谢标记与定量质谱法的多蛋白复合物比较分析新方法

本方案描述了如何制备并实施透明天然凝胶洗脱液相分离电泳（CN-GELFrEE），这是一种适用于从异质样品中分离非共价生物分子复合物和蛋白质的天然分离技术，且可与多种下游蛋白质分析技术兼容。...

CN-GELFrEE - 清亮天然凝胶洗脱液相组分捕获电泳

串联亲和纯化（TAP）方法已广泛用于从细胞提取物（主要是真核细胞）中分离天然复合物，以进行蛋白质组学研究。本文介绍了一种经过优化的TAP方法实验方案，适用于为结构研究纯化天然复合物。...

使用串联亲和标签法纯化用于结构研究的天然复合物

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

本方案描述了利用天然电泳分离功能性线粒体电子传递链复合物（Cx...

利用天然电泳、凝胶内活性检测和电洗脱分析线粒体电子传递链的超复合物

本文介绍了一种通过天然绿色凝胶电泳分离可溶性类囊体复合物的实验方案。随后利用时间相关单光子计数法（TCSPC）对绿色凝胶条带进行表征，并提供了数据分析的基本步骤。...

利用天然绿色凝胶电泳分离菠菜类囊体蛋白复合物及通过时间相关单光子计数进行条带表征

本方案展示了通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分析线粒体呼吸链复合物的方法。此处描述的是应用于培养的人源细胞的实验方法。...

利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳与免疫印迹法分析培养的人类细胞中线粒体呼吸链复合物

本文介绍一种提取、分离和鉴定线粒体超复合体的方案，该方案最大限度地减少了去垢剂和考马斯亮蓝的使用。此方法在分辨率与酶活性保持之间实现了最佳平衡，同时降低了不稳定蛋白质-蛋白质相互作用丢失的风险。...

用于分离与分析线粒体呼吸链超复合物的混合型透明/蓝色天然电泳

蛋白酶对细菌致病至关重要，可促进侵袭并逃避宿主免疫。以单步法提取细菌胞质和膜蛋白并保持其活性状态极具挑战性。本视频文章展示了从钩端螺旋体（Leptospira）中提取全细胞蛋白，用于明胶酶谱分析，以检测和表征明胶酶。...

一步法提取与细菌明胶酶的明胶酶谱分析

学习使用蓝色本机凝胶电泳技术分析拟南芥囊体膜蛋白配合物的组成与动态组织。该方法可揭示光合蛋白复合物的功能相互作用及其在环境变化中的可塑性。

通过蓝色天然凝胶电泳分析类囊体膜蛋白复合物

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