Name: Un modelo de ratón Hyperandrogenic para estudiar el síndrome de ovario poliquístico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprende a generar un modelo de ratón hiperandrogénico con pellets de dihidrotestosterona para estudiar el síndrome de ovario poliquístico y sus efectos en la descendencia.

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Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (subvenciones R00-HD068130 a S.W.) y el centro de investigación de Diabetes de Baltimore: pilotos y viabilidad subsidio (S.W.).

Aquí, presentamos protocolos detallados para la inserción y preparación de pellets DHT y para la prueba metabólica y reproductiva. Los ratones utilizados en este estudio fueron un fondo mixto (C57/B6, CD1, 129Sv) y se mantuvieron con alimento y agua ad libitum en un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 h a 24 ° C en las instalaciones de edificio de Broadway de investigación animal en la Facultad de Universidad de Johns Hopkins de Medicina. Todos los procedimientos fueron aprobados por la Comisión de uso y de Johns Hopkins Universidad Animal Care.
1. crear el modelo de ratón de síndrome-como
<ol><li>
Preparación de pellets DHT
	<ol>
<li>Tubo de silastic de autoclave para esterilizar. Cortar los tubos de silastic a una longitud de 15 mm con una cuchilla de afeitar;</li>
		<li>Sellar un lado inyectando silicona adhesiva médica en el tubo con una aguja blunted 20 G conectada a una jeringa de 3 mL. Émbolo debe ser retirado de la jeringa y luego adhesivo insertada en el depósito. El émbolo se reinserta y adhesivo hacia abajo hasta que comience a salir de la aguja. La aguja blunted se hace cortando el lado de la extremidad aguda de la aguja de 20 G con cualquier tijera fuerte. La longitud de silicio en el tubo debe ser más de 2 mm para permitir el recorte de la producción;</li>
		<li>Seque durante la noche; Si hay burbujas de aire en el lado cerrado. Los sin burbujas de aire se utilizan para las pelotillas de DHT. Otros pueden utilizarse para las pelotillas de control no-DHT.</li>
		<li>Usar guantes, mascarilla, gafas y bata de laboratorio antes de hacer pellets de DHT en una campana para evitar la exposición de la DHT a la piel.</li>
		<li>Verter polvo DHT en un recipiente plástico peso barco y presione el lado abierto del adhesivo capsulada tubos (producidos en A1.1) en el polvo de la DHT.</li>
		<li>Polvo DHT puede se apisona con un clip de papel grande que se endereza.  Continúe hasta que la DHT alcanza una altura de 4 m m (o la longitud deseada). Compruebe la longitud de la DHT con una regla y selle el lado abierto con silicio, seco durante la noche.</li>
		<li>Corte cada lado sellado para hacer que la longitud de silicona 2 mm de largo. La longitud total de la pelotilla será 8 mm.</li>
		<li>Sellar ambos lados del tubo de vacío de silastic como pelotilla del control (no-DHT).</li>
		<li>Mantenga pastillas en un tubo cónico de 50 mL, envuelto con papel de aluminio (para evitar la exposición a la luz) a temperatura ambiente hasta su uso. Los pellets DHT mantienen eficacia plena durante al menos 3 meses de almacenamiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reemplazo e inserción de DHT
	<ol>
<li>Hasta 20 DHT pellets o gránulos de control se introducen por separado en un tubo cónico de 50 mL con solución salina al de 0.9% estéril 30 mL por 24 h a 37 °C para conseguir el equilibrio justo antes de la inserción.</li>
		<li>Antes de la cirugía, las superficies y los guantes son desinfectados con clidox y las superficies de trabajo están cubiertas con papel absorbente con plástico (cojín quirúrgico).  Todos los instrumentos que entran en contacto con animales son descontaminados antes de entrar en el Animalario en autoclave.  Instrumentos permitirá seco y fresco antes de su uso.</li>
		<li>se utilizan ratones hembra 2 meses de edad (4-5 ratones/jaula). Ratones se inyectaron por vía intraperitoneal con xilacina (3,5 mg/kg bw) y ketamina (78,8 mg/kg bw) usando una jeringa de insulina. Cálculos para la mezcla y dosificación de la anestesia es en la tabla 1.</li>
		<li>Después de anestesia adecuada se logra, según lo medido por la pérdida del reflejo del dedo del pie y lenta la respiración, el ratón será preparado para la cirugía.</li>
		<li>Desinfectar la piel de la zona con betadine con una gasa estéril y de limpiar con etanol al 70%.  Otra vez se pintarán la zona con betadine.</li>
		<li>Un orificio de alrededor de 5 mm de longitud con las tijeras debajo de la piel cerca del cuello. Usando un trochar de 10 G, haga un pequeño túnel (15 mm) en dirección rostral. La pastilla se inserta dorsalmente con el trochar.</li>
		<li>La apertura luego se sella con pegamento quirúrgico. Manual aproximado la herida los bordes con pinzas y movimientos de cepillado suave para aplicar una capa delgada de adhesivo líquido a los bordes de la herida aproximados. Capas delgadas de 3 la acumulación de pegamento para asegurar que el adhesivo se distribuye uniformemente sobre la herida. El adhesivo debe extenderse 1 cm a cada lado de los bordes de la herida yuxtapuestos. Suturas o clips quirúrgicos pueden utilizarse también para cerrar el agujero. Vuelva a poner ratones en la jaula, alojada individualmente, con una almohadilla de calor para la recuperación. Reemplazar pellet cada 4 semanas para mantener un nivel constante de exposición del andrógeno. Se eliminará la pastilla original y nuevo pellet se insertará como se describe en A1.15 en posición similar.</li>
		<li>Prueba de ciclicidad estral después de 3 días de la inserción de la DHT. Etapa del ciclo estral es evaluado mediante citología vaginal.  Las células vaginales son recogidas por 16 días consecutivos utilizando una pipeta p10 para chorros de solución salina estéril (aproximadamente 10 μl) en la cavidad vaginal y luego retirar la solución salina con la misma punta de pipeta estéril.  Las células vaginales mudadas de la pared vaginal mezclan con solución salina y se recogen.</li>
		<li>Solución salina con las células sobre un portaobjetos rotulado se separó. Cada diapositiva puede contener seis muestras. Diapositivas están etiquetadas a la nota que muestra se coloca en cada uno de los seis lugares.</li>
		<li>Después de la solución salina haya secado por completo de la diapositiva, poner el portaobjetos en un recipiente con etanol al 100% para fijar las células. Diapositivas se fijarán durante al menos 5 minutos, pero pueden permanecer en fijador indefinidamente hasta su uso posterior.</li>
		<li>Poner diapositivas en soluciones de tinción para 1 minuto de tampón B y C. Wash portaobjetos con agua corriente y seca a temperatura ambiente.</li>
		<li>Examinar la morfología celular en un microscopio de luz objetiva de 10 X.  Morfología de la célula para distinguir el proestro (P), (E) de estro, metestro (M) y diestro (D) se describe en referencias27,28,29.</li>
		<li>Cuenta los días en cada etapa y dividirán por el número total de días para calcular porcentaje tiempo en cada etapa.</li>
		<li>Prueba de tolerancia a la glucosa a los 21 días después de la inserción de DHT por ayuno los ratones durante la noche (16 h) y la inyección intraperitoneal de 2 g/kg de peso corporal de dextrosa 20%. Por ejemplo, si un peso corporal de ratón es 25 g, este ratón se inyectará con 250 μl de dextrosa 20% con una jeringa de insulina de 50 cc (0,5 mL). Glucómetro y las tiras reactivas evalúa los niveles de glucosa mediante el muestreo de sangre de vena de la cola en el 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Esto se describe en detalle en otra parte30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colección de la sangre
	<ol>
<li>Recoja la sangre en varios días después de la inserción de la DHT (que límite de volumen de la colección 100 μL para esteroides y 30ul para análisis de LH/FSH) entre el 9 y 10:00 por vena submaxilar sangrado con la lanceta. Esto se describe en11.</li>
		<li>Centrifugar la sangre a 6.000 x g a 4 ˚C por 10 min y recoger la capa de suero en otro tubo de 1.5 mL que puede ser almacenado a-80 °C hasta análisis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. evaluación reproductiva perfiles de descendencia femenina de crónico DHT insertan presas
<ol><li>
Apareamiento
	<ol>
<li>Desplazar el ratón hembra a probarse en la jaula con un macho fértil probada (que previamente ha tenido cachorros con un ratón hembra) a los 15 días después de la inserción de pellets.</li>
		<li>Documento de peso corporal de la presa cada semana para determinar si el ratón está embarazado. Presa aumenta de peso de más de 3 g en una semana indica embarazo.</li>
		<li>Recoger la sangre de las presas la segunda semana después de que observamos mayor peso de las presas más de 3 g de la semana anterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinado por la abertura vaginal y el primer estro de la pubertad
	<ol>
<li>Compruebe la abertura vaginal mediante inspección visual cada día después de que los cachorros son destetados a 21 días después del parto (PND), medir la distancia anogenital y registrar la edad de apertura vaginal.</li>
		<li>Una vez que se abre la vagina, recoger las células vaginales todos los días, como se describe en 1.2.8–1.2.11 para comprobar ciclicidad estral.</li>
		<li>Observar la morfología de la célula como 1.2.12 descrito, y el primer estro se define como la fecha que todas las células son cornified las células epiteliales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cuerpo peso y oído punch
	<ol>
<li>Sumergir la extremidad de la lanceta en la pasta de tatuaje y marque cada cachorro con tatuaje en el dedo del pie como se describe en la referencia12 7 PND y pesar ratones cada 7 días hasta los 70 días de edad.</li>
		<li>Ratones de golpe de oído a numerarlos utilizando el sistema en la figura 1 entre 12 a 16 PND. Para distinguir el sexo, examinar el lado ventral del cuerpo, las hembras tienen pezones visibles.</li>
		<li>Recoja la sangre en el 21, 26, 70 PND después del nacimiento como se describió anteriormente en 1.3.1</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis hormonales
	<ol>
<li>Los niveles de DHT en suero de sangre se miden por ambos análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) y por tándem cromatografía líquida masa espectrometría (LC-MS)23,24,31,32. T se mide por LC-MS, o un rata/ratón ELISA que ha sido validado por la base de ensayo de ligando de Universidad de Virginia en el centro de investigación en reproducción23,24.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+sex+steroids+in+murine+blood+and+reproductive+tissues+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).</li>
<li>Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+Seoul+virus+infection+are+not+related+to+adult+sex+steroid+concentrations+in+Norway+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats.</a> J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).</li>
<li>Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17beta-estradiol+alters+the+activity+of+conventional+and+IFN-producing+killer+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells.</a> J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).</li>
</ol>

Nada que revelar.

Hiperandrogenismo es una característica clave de PCOS. Los niveles séricos DHT (dos veces más en ratones DHT que en ratones no-DHT) utilizados en este protocolo son inferiores a los reportados por otros investigadores en estudios previos y están calibrados para imitar proporcionalmente las mujeres con SOP5,19, 20,21. A diferencia de otros modelos, este modelo DHT 2 veces no altera el peso corp...

Hiperandrogenismo es el síndrome de ovario poliquístico (SOP) según los criterios del NIH y del exceso de andrógenos y SOP (AE-SOP) la sociedad. Las mujeres con SOP tienen dificultad para quedar embarazadas y han aumentado el riesgo de embarazo complicaciones1. Incluso si consiguen embarazadas, su descendencia femenina tiene una de2,de los resultados adversos para la salud3. Se han desarrollado modelos animales usando varias estrategias4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 y exhibe muchas características del SOP (anovulación, y tolerancia deteriorada de la glucosa y la insulina) con mayor peso corporal y obesidad había asociada con el tamaño del adipocito agrandado y aumentó el peso del adipocito. Hay dos estrategias principales para producir modelos de animales que se utilizan para el estudio de PCOS. Uno es el tratamiento con altos niveles de andrógenos directamente (inyección de andrógenos exógenos, inserción) o indirectamente (por ejemplo, bloqueando la conversión de andrógenos a estrógenos con inhibidor de la aromatasa) después nacimiento13. Otro es por hyperexposure fetal de andrógenos durante la gestación14,15 estudiar la descendencia. Por ejemplo, la hembra crías de mono rhesus16,17, ovejas18y roedores expuestos a niveles masculinos de andrógenos durante el período intrauterino desarrollan SOP-como rasgos más adelante en la vida. Estos modelos habían mejorado significativamente nuestra comprensión de los efectos de andrógenos elevados y programación fetal y uterinos efectos ambientales. Sin embargo, estos modelos tienen sus propias limitaciones: 1) los animales desarrollan obesidad y por lo tanto es difícil separar los efectos del hyperandrogenemia reproductiva inducida por la obesidad y la disfunción metabólica; 2) antes del embarazo, las mujeres con SOP ya exhiben altos niveles de andrógenos, así ovocitos han sido expuestos a andrógenos en exceso antes de la fecundación; 3) las dosis farmacológicas de la testosterona (T) o dihidrotestosterona (DHT) usado después del nacimiento o durante la gestación pueden no reflejar el ambiente de andrógeno de PCOS. Se han medido los niveles de testosterona y DHT en suero y en líquido folicular ovárico y testosterona y los niveles DHT son 1.5 a 3.9 veces mayor en mujeres con SOP5,19,20,21 ,22,23 en comparación con las mujeres. Hemos creado un ratón adulto modelo23,24,25 que se desarrolla la disfunción reproductiva y metabólica dentro de dos semanas de la iniciación de la exposición crónica de DHT de la inserción de un pellet con 4 mm de longitud de polvo de cristal DHT (longitud total de la pelotilla es 8 m m). Este modelo produce suero DHT niveles sobre 2 superior (denominado 2xDHT) que el de los ratones de control sin tratamiento de DHT. Los ratones 2xDHT no presentan alteraciones del estradiol del suero basal, testosterona, LH y no no desarrollar obesidad y muestran similar peso ovárico, los niveles séricos de colesterol, ácidos grasos libres, leptina, TNFα y IL-623,24, 25 relativas a controles hasta 3,5 meses después de DHT inserción23,24,25. Además, por el apareamiento de las hembras que ya han desarrollado características del SOP, podemos estudiar el impacto de un ambiente materno hyperandrogenic en la salud metabólica y reproductiva de la descendencia15.
Este nuevo paradigma (pertinente a los criterios NIH y sociedad AE-SOP) modelos de la enfermedad mediante la producción de niveles relativamente similares de andrógenos a las mujeres con SOP 2 - 3-fold mayor testosterona o niveles de DHT en comparación con las mujeres. Sin embargo, este modelo se mantiene por DHT exógena continua y no de hiperandrogenismo endógeno programada, una vez que se retira el DHT. El objetivo general de este artículo es concentrarse en 1) Cómo hacer que el perdigón DHT; 2) Cómo generar un SOP lean como modelo de ratón; 3) estrategias para evaluar la descendencia femenina de estas represas. Otras medidas y la evaluación de fenotipos no se abordan en este manuscrito, pero pueden encontrarse en5,15,23,24,25,26.

<table><tbody><tr><td>Polvo cristalino de 5&alpha;-DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8380-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Tubo Silastic</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15D</td><td>0,04 pulgadas/1 mm de diámetro interior x0,085 pulgadas/2,15 mm de diámetro exterior</td></tr><tr><td>Adhesivo médico de silicona</td><td>Factor II, InC.</td><td>A-100</td><td></td></tr><tr><td>Gafas, batas de laboratorio, guantes y mascarillas.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 y micro; Puntas de pipeta L sin filtro</td><td>Portaobjetos de</td><td>11113700</td><td></td>Scientific de EE. UU</tr>. para <tr><td>frotis</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>Diff Quik para tinción de células</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> NC9979740 <td></td></tr><tr><td>Lanceta</td><td>Fisher Scientific NC9416572</td><td></td><td></td>Fisher Scientific</tr><tr><td>Jeringa de 3 mL</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD),</td><td>30985</td><td></td></tr><tr><td>aguja adjunta: 20 G</td><td>BD</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Regla: cualquier longitud superior a 10 cm con escala milimétrica.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise</td><td>NDC13985-704-10</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina</td><td>Hospira, Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Grapa quirúrgica</td><td>AutoClip&reg; Sistema, Fine Science Tool</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina</td><td>BD</td><td>329461</td><td>1/2 CC, dosis baja Jeringa de insulina U-100</td></tr><tr><td>Trocar</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss Primo Star</td><td>415500-0010-001</td><td>Alemania</td></tr><tr><td>Puñetazo de oreja</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-201</td><td></td></tr><tr><td>Testosterona rata/ratón ELISA kit</td><td>IBL</td><td>B79174</td><td></td></tr><tr><td>DHT kit ELISA</td><td>Alpha Diagnostic International</td><td>1940</td><td></td></tr><tr><td>ultra glucómetro de un toque</td><td>Life Scan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiras reactivas ultra de un toque Life</td><td>Scan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-18</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Clidox</td><td></td><td></td> Almohadilla quirúrgica Fisher Scientific NC0089321 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific 50587953</td><td></td><td>Fabricante: Andwin Scientific 56616018</td></tr><tr><td>Betadine Solución Antiséptica Walgreens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond (cianoacrilato de n-butilo)</td><td>3M Science. Aplicado a la vida</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón hyperandrogenic para estudiar el síndrome de ovario poliquístico

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenemia juega un papel fundamental en la función reproductiva y metabólica en las hembras y es el sello distintivo del síndrome de ovario poliquístico. Desarrollo de un modelo de ratón de SOP-como magro que imita a las mujeres con SOP es clínicamente significativo. En este protocolo, se describe dicho modelo. Mediante la inserción de una longitud de 4 mm de pastilla de polvo de cristal DHT (dihidrotestosterona) (longitud total de la pelotilla es 8 m m), y reemplazarlo cada mes, que son capaces de producir un modelo de ratón de SOP-like con doblez de 2 los niveles DHT suero mayor que los ratones no implantados con DHT (no-DHT). Se observó disfunción reproductiva y metabólica sin cambiar el peso corporal y composición corporal. Mientras que exhibe un alto grado de infertilidad, un pequeño subconjunto de estos ratones hembra SOP-como puede quedar embarazado y sus hijos muestran retraso de la pubertad y aumento de la testosterona como adultos. Este modelo de ratón magro como PCOS es una herramienta útil para el estudio de la fisiopatología del SOP y la descendencia de estas presas como PCOS.

Niveles de DHT y prueba de tolerancia a la glucosa
Niveles de DHT se midieron de suero recolectado por tanto ELISA y por LC-MS según protocolo 1.24, 1.25 y 2.9, 3.0. Los valores absolutos DHT son diferentes entre espectrometría de masas y ELISA, sin embargo, el repliegue relativo (aproximadamente 2 veces) de vs DHT DHT no es similar de ambos ensayos y a través de experimentos de15,<sup class="xref...

Describimos el desarrollo de un modelo de ratón de SOP-como magro con dihidrotestosterona pelotilla para el estudio de la fisiopatología del SOP y la descendencia de estas presas como SOP.

Un modelo de ratón Hyperandrogenic para estudiar el síndrome de ovario poliquístico

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reproducción. Y la endocrinología. Y son aplicables al estudio del síndrome de ovario poliquístico o SOP e hiperandrogenismo.La ventaja de esta técnica es que facilita una liberación constante, uniforme y a largo plazo de las hormonas de una manera rentable y efectiva. JHUs que tratará el procedimiento será Ping Xue, un técnico de mi laboratorio. Para la preparación de dihidrotestosterona o pellets DHT, utilice una cuchilla de afeitar para cortar una pieza de 15 milímetros de tubo de silicona.Y utilice una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 20 contundente para inyectar silicona adhesiva médica de dos a cinco milímetros en un extremo del tubo. Deje que el tubo se seque durante la noche. Y compruebe si hay burbujas de aire en el extremo sellado.El uso del equipo de protección personal adecuado verter polvo DHT en un bote de plástico en la fluidez. Impresione el extremo abierto del tubo tapado adhesivo en el polvo. Usando un clip de papel grande enderezado, aplace el polvo hacia abajo en el tubo, hasta que el DHT alcance la profundidad experimental adecuada.A continuación, selle el lado abierto del tubo con silicona durante la noche. A la mañana siguiente, corte cada lado sellado para obtener una longitud de dos milímetros de silicona en ambos lados del DHT y sin pellets de control DHT. A continuación, almacene los pellets en el tubo cónico de 50 mililitros envuelto con papel de aluminio a temperatura ambiente durante un máximo de tres meses.Para la generación de modelos de ratón SOP equilibrar hasta 20 DHT o controlar pellets en tubos cónicos separados de 50 mililitros que contienen 30 mililitros de 0.9 por ciento de solución salina durante 24 horas a 37 grados Celsius. Al día siguiente, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón hembra anestesado de dos meses de edad y use gasa estéril para administrar povidona-yodo secuencial y 70 por ciento exfoliantes de etynol a la zona quirúrgica. A continuación, haga una incisión de cinco milímetros a través de la piel cerca del cuello.Y usa un trocar de diez calibres para hacer un túnel de 15 milímetros en la dirección rostral. Utilice el trocar para insertar un pellet dorsalmente en el túnel y sellar la incisión con el adhesivo quirúrgico. Aproximar manualmente los bordes de la herida con fórceps y utilizar suaves pinceladas para aplicar tres finas capas de película de adhesivo líquido a un centímetro de cada lado de los bordes opuestos de la herida.A continuación, coloque el ratón solo en una jaula sobre una almohadilla de calor con monitoreo hasta la recumbencia completa. Sustitución del pellet cada cuatro semanas para mantener un nivel constante de exposición a andrógenos. Tres días después de la inserción del pellet, utilice una pipeta p10 para chorros diez microlitros de solución salina estéril en la cavidad vaginal y utilice la punta de la pipeta para recuperar inmediatamente la solución salina.Extienda la muestra de solución salina de la célula vaginal en un portaobjetos etiquetado. Y deje que la solución salina se seque a temperatura ambiente. Fijar los portaobjetos secos en un recipiente de 100 por ciento de etynol durante al menos cinco minutos.A continuación, manche las diapositivas durante un minuto cada una en el búfer B y el tampón C de un kit de tinción dif-quick. Al final de la inveneción C lave los toboganes con agua del grifo durante tres segundos y séquelos a temperatura ambiente. Para determinar la cíclica estrosa ver las diapositivas bajo el objetivo de diez veces de un microscopio de luz.Cuente los días en cada etapa y divida por el número total de días para calcular el porcentaje de tiempo en cada etapa. Para probar la tolerancia a la glucosa, 20 días de inserción de DHT, ayuna los ratones durante la noche. Pesar los ratones a la mañana siguiente, y utilizar un glucómetro y tiras de prueba para medir el nivel de glucosa de albahaca de la sangre de la vena de la cola.Inyectar a los ratones con dos gramos por kilogramo de peso corporal de 20 por ciento dextrosa. A continuación, mida el nivel de glucosa de las muestras de sangre de la vena de cola a 15, 30, 60, 90, 120 minutos después de la administración de dextrosa. Para adquirir la descendencia femenina de las damas insertadas DHT, mueva el ratón hembra a probado en la jaula con un macho fértil probado en el día 15, después de la inserción del pellet.Documente el peso corporal de las damas cada semana para determinar si el ratón está embarazada. En el día siete después del parto, sumerge una punta de lanceta en pasta de tatuaje y marca cada cachorro con un tatuaje en la punta. Pesar los ratones marcados cada siete días hasta los 70 días de edad.Entre la fecha postnatal 12 a 16, pon un puñetazo en los ratones para numerarlos según el sistema como se ilustra en la figura. Para distinguir el sexo, examine el lado ventral de cada ratón etiquetado. Las hembras tendrán pezones visibles.Para recoger muestras de sangre para varios análisis aguas abajo, utilice una lanceta para recoger el volumen experimental aproximado de sangre entre las nueve y diez de la mañana mediante sangrado de vena submandibular. Y centrifugar las muestras para permitir la recolección de suero. A continuación, almacene las muestras de suero en tubos de micro centrífuga de 1,5 mililitros a menos 80 grados centígrados hasta su análisis.Para evaluar la pubertad en la descendencia femenina DHT, todos los días después del destete en el día 21 después del parto, compruebe la abertura vaginal mediante inspección visual. Y usa calibres para medir la distancia anó genital. Aunque los valores absolutos de DHT sérico son diferentes entre la espectrometría de masas y el análisis de Elisa, el cambio popular relativo de la inserción de DHT frente a la inserción sin DHT es similar tanto de los ensayos como de los experimentos.Los niveles de DHT se incrementan significativamente desde la preconcepción hasta el embarazo en DHT y no ratones DHT. Sin embargo, los niveles de DHT son dos veces más altos en ratones DHT en comparación con ningún ratone DHT en puntos de tiempo preconcepcionales y gestacionales. Las hijas adultas de DHT exhiben diferencias en la función reproductiva.Por ejemplo, la cíclica eestrosa interrumpida en comparación con las hijas adultas sin DHT que experimentan tiempos significativamente más largos en metestrus diestrus y menos tiempo en pro-esterous y esterous. Al intentar este procedimiento es importante recordar incubar los pellets durante 24 horas antes de que se utilizan para la liberación uniforme de la hormona. Después de este procedimiento, también se pueden examinar las consecuencias reproductivas y metabólicas de la exposición a DHT.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la endrocronología y las interacciones fetales maternas estudiaran el SOP y el impacto del hiperandrogenismo de bajo nivel en ratones hembra. No olvide que trabajar con DHT puede ser extremadamente peligroso y las precauciones como usar guantes y una máscara y gafas, y trabajar en una capucha de bioseabilidad, siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este artículo describe una forma de preparar e insertar gránulos de dihidrotestosterona (DHT) para modelar el síndrome de ovario poliquístico (SOP) en ratones. El protocolo de ejemplo muestra el procedimiento en ratones utilizado para estudios reproductivos y metabólicos.

Tratamiento subcutáneo con dihidrotestosterona (DHT): modelo de ratón del síndrome de ovario poliquístico (SOP)

Muchos modelos de roedores de endometriosis están limitados por la complejidad técnica, la reproducibilidad y / o la necesidad de animales inmunocomprometidos o ratones reporteros especiales. Presentamos un sistema simplificado de inducción de lesiones utilizando cualquier ratón experimental con un sistema de puntuación objetivo verificable de forma independiente y sin necesidad de ovariectomía o cirugía de supervivencia.

Un modelo murino singénico de endometriosis utilizando ratones de ciclo natural

Este estudio describe la medición directa de la producción hepática de glucosa en un modelo de ratón con síndrome de ovario poliquístico mediante el uso de un trazador de glucosa isotópico estable a través de la vena de la cola en estados de ayuno y ricos en glucosa en tándem.

Evaluación de la producción hepática de glucosa en un modelo de ratón con síndrome de ovario poliquístico

La hormona folículo estimulante (FSH) en varios tejidos y órganos extragonadales se asocia con la patogénesis de múltiples enfermedades. El modelo de ratón ovariectomizado y tratado con FSH (OVF) se puede utilizar para explorar las acciones extragonadales de la FSH.

Exploración de los efectos independientes de la hormona folículo estimulante in vivo en un modelo de ratón

Este estudio presenta un nuevo modelo de ratón diseñado específicamente para simular el endometrioma, un subtipo clínicamente significativo de endometriosis. Mediante la utilización de ratones C57BL/6J, el modelo tiene como objetivo dilucidar los mecanismos fisiopatológicos que subyacen a la infertilidad relacionada con el endometrioma, ofreciendo una herramienta refinada para cerrar la brecha de conocimiento actual en medicina reproductiva.

Establecimiento de un modelo experimental de endometrioma en ratones para estudiar su infertilidad relacionada

Este protocolo introduce una técnica para inducir modelos de síndrome de ovario poliquístico (SOP) en ratones mediante la liberación controlada de letrozol utilizando minibombas. Bajo la anestesia adecuada, la minibomba se implantó por vía subcutánea y se indujo con éxito el SOP en los ratones después de un cierto período de liberación de la minibomba.

Una técnica modificada para inducir el síndrome de ovario poliquístico en ratones

La validación experimental de la actividad potenciadora se aborda mejor mediante el análisis de pérdida de función. Aquí se presenta un protocolo eficiente que utiliza la deleción mediada por CRISPR/Cas9 para estudiar la regulación específica de alelos de la transcripción génica en células ES F1 que contienen un genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón

Este protocolo presenta un método para llevar a cabo cuantitativa, de una sola célula en el análisis in situ de la expresión de la proteína a estudiar especificación linaje en embriones de preimplantación ratón. Los procedimientos necesarios para la recogida de los blastocistos, todo el montaje de detección de inmunofluorescencia de las proteínas, se describen las imágenes de las muestras en un microscopio confocal, y la segmentación nuclear y análisis de imágenes.

Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones

Este protocolo describe el aislamiento, la cultura y la calcificación de las células intersticiales de rata-derivado de la válvula, un modelo altamente fisiológica en vitro de enfermedad de la válvula aórtica calcificada (CAVD). Explotación de este modelo de rata facilita investigación CAVD en la exploración de la célula y los mecanismos moleculares que subyacen a este complejo proceso patológico.

Células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica

Aquí, describimos un método imagenológico de alta resolución Monte todo en la piel de oreja de ratón adulto entero, que nos permite visualizar la ramificación de la morfogénesis y el patrón de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como distribución de células inmunes.

Whole-mount Microscopía Confocal para el oído adulto piel: un sistema modelo para el estudio de morfogénesis Neuro-vascular de ramificación y distribución de células inmunes

Aprende a generar un modelo de ratón hiperandrogénico con pellets de dihidrotestosterona para estudiar el síndrome de ovario poliquístico y sus efectos en la descendencia.

Un modelo de ratón Hyperandrogenic para estudiar el síndrome de ovario poliquístico

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