Name: Un protocolo de preferencia de lugar condicionada para medir la incubación de antojo en ratas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Aprenda a medir la incubación de antojo en ratas mediante el protocolo de preferencia de lugar condicionada con morfina. Este método permite estudiar los mecanismos de la adicción y la memoria de recompensa a largo plazo en modelos animales.

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Este trabajo fue apoyado por nacional Ciencias naturales Fundación de China (NSFC) 31741058 (Y.Z.,) subvenciones gubernamentales de Shenzhen (JCYJ20170818162613877 y JCYJ20170818163217196) y China Postdoctoral Science Foundation concesión 2017 M 622826 (K.Z.).

Los procedimientos experimentales fueron realizados siguiendo las directrices de la atención nacional y uso de los animales y los experimentos fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en institutos de avanzada tecnología de Shenzhen, China Academia de Ciencias.
1. animal habituación
<ol><li>Obtener ratas adulto macho de laboratorio animal y mantenerlas bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (luz de 7:00 a 19:00) con libre acceso al alimento y agua.</li>
	<li>Manejar los animales por jugar con ellos o toques dos veces al día durante dos semanas antes de los experimentos.</li>
	<li>Asignar al azar los animales en grupos de solución salina o la morfina.</li>
</ol>2. preparación de la droga
<ol><li>Preparación de clorhidrato de morfina 10 mg/ml e inyectar ratas por vía intraperitoneal (i.p.) en un volumen de 1 mL/kg.</li>
	<li>Como control, inyectar ratas con una solución salina en un volumen de 1 mL/kg.</li>
</ol>3. CPP aparato
<ol><li>Construir un aparato CPP de tres cámaras con señales táctiles (piso) y prueba de preferencia inicial de ratas a dos cámaras laterales. El aparato consiste en dos compartimientos laterales negros grandes (30 cm x 25 cm × 30 cm, L × W × H) y una media blanca cámara (11 cm x 25 cm × 30 cm, L × W × H) con piso de PVC liso blanco. Las cámaras laterales tienen texturas de piso como señales somatosensoriales: una con suelo de rejilla del plexiglás y la otra con un áspero piso de PVC.</li>
	<li>Variar la combinación de señales táctiles para asegurarse de que el aparato es imparcial, ya que un aparato parcial es susceptible a la obtención de resultados falsos positivos4. Nota: Un problema metodológico importante en el diseño de los aparatos CPP es si el aparato está "sesgado" o "imparcial"4. Si un grupo de ratas no muestra ninguna preferencia inicial por cámara de un lado sobre otro, el aparato se considera "imparcial". De lo contrario, lo consideran como "sesgada"13.</li>
</ol>4. procedimiento CPP
<ol><li>Establecer el paradigma CPP inducida por morfina principalmente según anteriores estudios21,22 con la modificación del acondicionamiento de puntos de tiempo, número de sesiones de acondicionamiento, acondicionamiento del periodo de prueba y pruebas momentos20 . Una breve descripción se da a continuación, de los cuales el programa experimental se muestra en la figura 1.</li>
	<li>Fase de acondicionamiento previo<ol>
<li>Durante esta etapa (día 1 a 3), quitar puertas guillotina para permitir el acceso libre a todo el aparato y colocar el animal en la cámara media.</li>
		<li>Registrar la actividad de los animales durante 15 minutos.</li>
		<li>Calcular el tiempo empleado en las cámaras laterales el día 3 como base y se refieren a esto como T0.</li>
		<li>Eliminar las ratas que entran menos de - cuatro veces a cualquiera de las cámaras del lado del experimento23 como estas ratas son propensos a tener problemas en bienestar general (p. ej., pelaje sucio y tener tumores). Verifique el estado de salud de los animales durante el periodo experimental todo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fase de condicionamiento Nota: La fase de condicionamiento incluye 6 (días 4 a 9).<ol>
<li>Para temas de morfina-condicionada, inyectar ratas i.p. con morfina (10 mg/kg) o solución salina (1 mL/kg) alternativamente en la mañana (9:00) y sesiones de tarde (19:00) (10 h aparte).</li>
		<li>Limitar las ratas inmediatamente después de cada inyección para su fármaco vinculado (no preferido) o solución salina emparejado (preferido) cámara por 45 min (figura 1B).</li>
		<li>Mantenga el sistema de grabación de vídeo. Nota: Según nuestra experiencia, aproximadamente el 5% de las ratas tienen la depresión respiratoria después de la primera inyección de morfina (10 mg/kg). En tal caso, para aumentar la tasa de supervivencia de ratas depresión respiratorias, salir la rata de la cámara de acondicionamiento, saca su lengua y ponerlo sobre un papel blanco en su jaula casera.</li>
		<li>Solución salina acondicionado controles, dar ratas inyecciones de solución Salinas (1 mL/kg) antes de la exposición a un compartimiento lateral del aparato CPP durante la sesión de la mañana y al otro lado durante la sesión de noche de 45 min/sesión en línea con el grupo de morfina (figura 1 C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fase de pruebas<ol>
<li>Durante esta fase, quitar puertas guillotina para permitir el acceso libre a todo el aparato y colocar el animal en la cámara media dejarlos explorar libremente todo el aparato durante 15 minutos.</li>
		<li>Registrar su actividad durante este 15 min.</li>
		<li>Realizar tres pruebas de acondicionamiento posteriores, es decir, prueba 1 (T1), test 2 (T2) y 3 (T3), la prueba 2 días, 10 días y 18 días después de la última sesión de acondicionamiento en un estado libre de morfina, respectivamente (figura 1A).</li>
		<li>Variar puntos de tiempo prueba para diferentes objetivos experimentales. Nota: Para minimizar el número de ratas requerido, se emplea un diseño sujeto. Sin embargo, al excluir el efecto de extinción, una entre el tema se requiere diseño.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58384/58384fig1.jpg"> Figura 1: procedimientos experimentales. (A) experimentales procedimientos de todo el proceso CPP. (B) experimental programa de la fase de condicionamiento del grupo morfina. Experimental (C) programa de la fase de condicionamiento del grupo salina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58384/58384fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
5. Análisis de datos
<ol><li>Calcular el puntaje de CPP en el grupo de morphine(saline) como: puntuación de CPP = el tiempo pasado en la cámara de drogas vinculado (no preferido) / tiempo total pasado en ambas cámaras de acondicionamiento.</li>
	<li>Realizar análisis de datos de partituras CPP y entradas a cámaras laterales con apropiados métodos estadísticos utilizando SPSS.</li>
	<li>Presentar todos los datos de comportamiento como la media ± SEM, donde SEM es el error estándar de la media. Considerar valores de p &lt; 0.05 como estadísticamente significativas e indican por asteriscos (*) y octothorpesin (#) en las figuras.</li>
</ol>

<ol><li>Leshner, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addiction+is+a+brain+disease%2C+and+it+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Addiction is a brain disease, and it matters.</a> Science. 278 (5335), 45-47 (1997).</li>
<li>Koob, G. F., Volkow, N. D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/npp2009110">Neurocircuitry of Addiction.</a> Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).</li>
<li>Zhu, Y., Wienecke, C. F., Nachtrab, G., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thalamic+input+to+the+nucleus+accumbens+mediates+opiate+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A thalamic input to the nucleus accumbens mediates opiate dependence.</a> Nature. 530 (7589), 219-222 (2016).</li>
<li>Tzschentke, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reward+with+the+conditioned+place+preference+paradigm%3A+a+comprehensive+review+of+drug+effects%2C+recent+progress+and+new+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Measuring reward with the conditioned place preference paradigm: a comprehensive review of drug effects, recent progress and new issues.</a> Progress in Neurobiology. 56 (6), 613-672 (1998).</li>
<li>Tzschentke, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reward+with+the+conditioned+place+preference+%28CPP%29+paradigm%3A+update+of+the+last+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade.</a> Addiction Biology. 12 (3-4), 227-462 (2007).</li>
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<li>Sun, Y., Pan, Z., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+entrances+to+side+compartments+indicate+incubation+of+craving+in+morphine-induced+rat+and+tree+shrew+CPP+models%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Increased entrances to side compartments indicate incubation of craving in morphine-induced rat and tree shrew CPP models.</a> Pharmacology Biochemistry and Behavior. 159, 62-68 (2017).</li>
<li>Sun, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+caudal+part+of+the+posterior+insula+of+rats+participates+in+the+maintenance+but+not+the+acquisition+of+morphine+conditioned+place+preference%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neuroscience+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The caudal part of the posterior insula of rats participates in the maintenance but not the acquisition of morphine conditioned place preference.</a> CNS Neuroscience & Therapeutics. , (2018).</li>
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<li>Bardo, M. T., Miller, J. S., Neisewander, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+place+preference+with+morphine%3A+the+effect+of+extinction+training+on+the+reinforcing+CR%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Conditioned place preference with morphine: the effect of extinction training on the reinforcing CR.</a> Pharmacology Biochemistry and Behavior. 21 (4), 545-549 (1984).</li>
<li>Sun, Y., Zong, W., Zhou, M., Ma, Y., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-conditioned+place+preference+treatment+of+chloral+hydrate+interrupts+the+rewarding+effect+of+morphine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Pre-conditioned place preference treatment of chloral hydrate interrupts the rewarding effect of morphine.</a> Pharmacology Biochemistry and Behavior. , 60-63 (2015).</li>
<li>Lin, X., Wang, Q., Cheng, Y., Ji, J., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+protein+expression+profiles+in+the+amygdala+during+the+process+of+morphine-induced+conditioned+place+preference+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Changes of protein expression profiles in the amygdala during the process of morphine-induced conditioned place preference in rats.</a> Behavioural Brain Research. 221 (1), 197-206 (2011).</li>
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<li>Meng, Z., Liu, C., Hu, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatosensory+cortices+are+required+for+the+acquisition+of+morphine-induced+conditioned+place+preference%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Somatosensory cortices are required for the acquisition of morphine-induced conditioned place preference.</a> PLoS One. 4 (11), e7742(2009).</li>
<li>Shalev, U., Morales, M., Hope, B., Yap, J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+changes+in+extinction+behavior+and+stress-induced+reinstatement+of+drug+seeking+following+withdrawal+from+heroin+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Time-dependent changes in extinction behavior and stress-induced reinstatement of drug seeking following withdrawal from heroin in rats.</a> Psychopharmacology. 156 (1), 98-107 (2001).</li>
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<li>Vanderschuren, L. J., Everitt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+seeking+becomes+compulsive+after+prolonged+cocaine+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drug seeking becomes compulsive after prolonged cocaine self-administration.</a> Science. 305 (5686), 1017-1019 (2004).</li>
<li>Deroche-Gamonet, V., Belin, D., Piazza, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+addiction-like+behavior+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for addiction-like behavior in the rat.</a> Science. 305 (5686), 1014-1017 (2004).</li>
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<li>Sun, Y. M., Yang, J. Z., Sun, H. Y., Ma, Y. Y., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+tree+shrew+chronic+morphine+dependent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dongwuxue+Yanjiu%22%5BJournal%5D)">Establishment of tree shrew chronic morphine dependent model.</a> Dongwuxue Yanjiu. 33 (1), 14-18 (2012).</li>
<li>Duan, Y., Shen, F., Gu, T., Sui, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addiction%3A+From+Context-Induced+Hedonia+to+Appetite%2C+Based+on+Transition+of+Micro-behaviors+in+Morphine+Abstinent+Tree+Shrews%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Psychology%22%5BJournal%5D)">Addiction: From Context-Induced Hedonia to Appetite, Based on Transition of Micro-behaviors in Morphine Abstinent Tree Shrews.</a> Frontiers in Psychology. 7, 816(2016).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, un método usando un paradigma CPP de morfina se describe para establecer memoria recompensa a largo plazo en ratas con señales somatosensoriales como contexto condicionada. Para construir tal una memoria a largo plazo de la recompensa, un anterior protocolo21 con un aparato equilibrado del CPP es modificado y las sesiones de solución salina y la morfina son conjunto de al menos 10 h aparte. Además, más sesiones de acondicionado se agregan durante la fase de condicionamiento para mejorar el aprendizaje. Aparte de los puntajes CPP, se miden las entradas a las dos cámaras laterales y el patrón de entradas mayor a cámaras laterales es similar a la de las respuestas más activadas en el paradigma de autoadministración.
Varios factores influyen en el establecimiento del paradigma CPP mencionado anteriormente. Un factor clave es el diseño del aparato: las ratas en general deberían tener preferencia similar a ambas cámaras laterales para asegurar el aparato está equilibrado. Un aparato no balanceado puede enmascarar la adquisición de CPP debido a la alta preferencia inicial a un lado de cámara13. Por lo tanto, preferencia extrema en una cámara lateral (más del 90% del tiempo total en cualquiera de las cámaras laterales) se debe evitar al elegir la textura de la planta u otras claves contextuales. Para los propósitos experimentales diferentes, experimentadores pueden equilibrar el aparato CPP mediante la modificación de los estímulos contextuales. Para el aparato de equilibrado, dos formas de diseño experimental son utilizados4. Una forma sesgada es fármacos de par con la cámara no preferido con todos los temas; manera imparcial es par la mitad de los animales con drogas en la cámara no preferida, la otra mitad con la cámara preferida. Ambas formas pueden establecer CPP13 pero estudios17,25 con el último diseño siempre excluyen a muchos temas debido a su fuerte preferencia a la cámara de un lado. Existe vulnerabilidad individual a la droga adicción26,27,28 , un diseño parcial fue elegido en este estudio para evitar exclusión de sujetos sanos. Una limitación de diseño tendencioso es el efecto de preferencia inconsistente para cámaras laterales. Como se muestra en la figura 2, las ratas en el grupo de solución salina tienen consistente puntuaciones bajas de CPP para la cámara inicial no preferida. Por lo tanto, se excluye la posibilidad de que preferencia incompatible a cámaras laterales podría afectar los resultados CPP en el grupo de morfina estableciendo los controles salinos. Para evitar el efecto del techo de la cámara preferida, utilizamos la cámara inicial no preferida como la cámara de pares de morfina. Para evitar el efecto de novedad y de estrés en la preferencia de línea de base a cámaras laterales, se realizan tres sesiones de acondicionamiento previo, y la tercera sesión se utiliza como base. El cuarto factor es el intervalo entre sesiones Salinas y morfina. En nuestro paradigma, elegimos a intervalos de al menos 10 horas para evitar el efecto de abstinencia en el período de acondicionamiento salina. La dosis de morfina es también un factor importante. Dosis muy bajas de morfina, como 0,01 mg/kg6, no indujo la preferencia de lugar. Una dosis de 10 mg/kg induce mayor CPP puntuación17 en ratas y se utiliza comúnmente en rata morfina CPP estudios17,21,23. Sin embargo, la morfina de 10 mg/kg (i.p.) podría inducir depresión respiratoria en alrededor del 5% de las ratas. Dosis bajas de morfina, por ejemplo 5 mg/kg, podrían usarse en futuros estudios. Para otras especies como la musaraña de árbol, tolerancia a las drogas debe considerarse al construir el paradigma de la CPP. Puesto que la musaraña de árbol desarrolla rápida tolerancia a la morfina, dosis crecientes de morfina deben utilizarse durante el acondicionamiento fase29,30.
Con el protocolo modificado, una memoria a largo plazo de la recompensa se establece durante al menos 18 días después de 6 días de acondicionamiento11 (figura 2). Estudios futuros deben evaluar CPP podría mantenerse por más tiempo. Repetida la recaída es la mayor barrera en el tratamiento de adicción a las drogas. Tensión, señales ambientales y drogas podrían inducir recaídas. Después de la extinción de la memoria CPP, este modelo podría utilizar para modelar la recaída inducida por estrés o por medicamentos.
Las entradas de las cámaras de drogas emparejado en el grupo de morfina aumentaron en el período de abstinencia11 (figura 3), que es similar con las respuestas más activadas en el paradigma de autoadministración. Sin embargo, las entradas a la cámara salina emparejado también aumentaron con el paradigma CPP en ratas y musarañas de árbol11, que es diferente de las respuestas inactivadas del paradigma de autoadministración. Esta diferencia podría debido a los diferentes principios de los dos paradigmas: uno es el condicionamiento clásico, la otra es a condicionamiento operante. Además, las musarañas de árbol con comida que experiencias de CPP no mostraron tal patrón de entradas mayor30. Por lo tanto, las entradas mayor a ambas cámaras laterales en animales morfina experimentaron se piensan para representar deseo incubado de drogas. Aunque la limitación del uso de medidas repetidas en un tema no puede ser excluida, el patrón de entradas mayor fue conservado en11de las ratas, las musarañas de árbol11,30 y monos31. Sin embargo, una entre el diseño del tema durante la abstinencia período recomienda para que futuros estudios excluir el efecto de extinción de medidas repetidas.
Aparte de las entradas mayores puntuaciones CPP con dosis bajas de morfina (1 mg/kg y 3 mg/kg) aumentaron progresivamente durante el período de abstinencia17. Estos resultados sugieren que el paradigma CPP también podría modelo la incubación de fenómeno de craving. Sin embargo, un puntaje mayor de CPP también podría representar un aumento de memoria para el estímulo condicionado. En este aspecto, las entradas a las salas de lado en un aparato de tres cámaras, que son similares a las respuestas activas en el paradigma de autoadministración, asemejan más a la búsqueda de drogas o el efecto gratificante de fármacos. Sería interesante comprobar las tendencias de las entradas a cámaras laterales durante el período de abstinencia en paradigmas CPP de rata de dosis bajas de morfina. Futuros estudios con otros fármacos y ratones se deben hacer para verificar si este fenómeno se conserva a través de las drogas de abuso y las especies.

La drogadicción es una enfermedad crónica1 con varias diferentes etapas2: borrachera, intoxicación, abstinencia/negativa afecto y preocupación/anticipación. En la etapa de borrachera/intoxicación inicial del ciclo de adicción de drogas, temas toman medicamentos debido al efecto refuerzo2. En la etapa de retiro/negativa afecta, sujetos experimentan estados somáticos y emocionales negativos de abstinencia de drogas, que promuevan mecanismos de refuerzo negativo asociados con el desarrollo de la adicción3. En la etapa de preocupación/anticipación, temas reinstalación de drogas en la búsqueda después de la extinción, que podría activarse por estímulos asociados a drogas o factores estresantes. En estudios con animales de adicción a las drogas, paradigmas (CPP) de preferencia de lugar condicionada se utilizan para imitar el efecto refuerzo positivo de drogas4,5,6 y, por lo tanto, se utiliza para modelar la etapa inicial de la droga ciclo de adicción. Un miembro de la familia opiáceos, la morfina, produce un efecto refuerzo positivo mediante la activación de los receptores opioides en el cerebro de7,8.
El paradigma de la CPP está basado en el principio del clásico (pavloviano) acondicionado y comúnmente utilizado para medir el efecto gratificante de drogas de abuso, tales como morfina4,5,9,10, debido a su fácil disponibilidad a través de laboratorios. Un paradigma CPP típico consta de tres fases: las fases de acondicionamiento previo, acondicionado y prueba. Durante la fase de condicionamiento, las propiedades gratificantes de una droga (estímulo incondicionado) se aparean con uno o más estímulos neutrales contextuales, de que ganan propiedades adictivas después de varios emparejamientos de acondicionado y sirven como estímulos condicionados. Durante la fase de prueba, la preferencia de los animales para compartimientos de drogas vinculado se miden y se refleja como la memoria de la recompensa. Por esta razón, el paradigma CPP también se utiliza para investigar los mecanismos de aprendizaje y la memoria. Para establecer una memoria a largo plazo de la recompensa de la morfina, las variables que afectan el establecimiento de CPP se han ajustado y optimizado con el debajo descrito protocolo11. Estímulos contextuales son una combinación visual, táctil y señales de olor. Las variaciones de estímulos contextuales y pruebas puntos de tiempo se hacen según propósitos de investigación. Por ejemplo en nuestro anterior estudio12, las señales somatosensoriales (texturas de piso) se utilizan principalmente como estímulos contextuales para investigar el papel de la parte caudal de la corteza insular, una región del cerebro con la función somatosensorial, en la adquisición y mantenimiento de la memoria a largo plazo de la recompensa. El diseño del aparato y la asignación de las ratas a lados preferido/no-preferida afectan el establecimiento del CPP. Se utiliza un aparato de tres cámaras en lugar de un aparato de dos cámaras en el debajo de protocolo para evitar opciones forzadas. El equilibrio de dos cámaras laterales y la asignación inicial de los animales en ellas afectan la adquisición de CPP4,13. Así, un equilibrado diseño de las cámaras de lado y asignación sesgada de los animales se aplican en el presente Protocolo para la adquisición de una preferencia de lugar fuerte. Mantenimiento de la memoria a largo plazo de recompensa requiere ensayos más de acondicionamiento durante la fase de condicionamiento. Para reducir el costo de tiempo durante la fase de condicionamiento, se realizan dos ensayos de acondicionado por día y se contrabalancean las inyecciones de morfina/solución salina para evitar el efecto de la abstinencia aguda de morfina en los ensayos de pares salinos4.
Reintegro modelos animales14 se han establecido para la etapa de preocupación/anticipación del ciclo de adicción de drogas. CPP se utiliza también para el estudio de reintegro que modela la recaída a comportamiento adictivo5. La recaída es una de las barreras en el tratamiento de la adicción a las drogas. Deseo es una causa de repetidas recaídas. El ansia de drogas aumenta constantemente durante el período de abstinencia, un fenómeno llamado incubación de ansia por15,16. Incubación de antojo se estudia ampliamente en el paradigma de autoadministración de drogas pero no el paradigma de la CPP. El uso del paradigma CPP para reflejar incubación de deseo era primer propuesto por Li et al. 17. sus resultados17 mostraron que los puntajes CPP de dosis bajas de morfina (1 mg/kg y 3 mg/kg) pero no una alta dosis (10 mg/kg) aumentados progresivamente durante los primeros 14 días de abstinencia. Asimismo, ratones inyectan con una dosis baja de cocaína mostraron mayores puntuaciones CPP sobre el tiempo18. Las puntuaciones CPP aumento de las dosis bajas de morfina fueron utilizadas para reflejar deseo incubado17. Duración pasó en tanto número de entradas en el ambiente asociado de drogas se sugiere reflexionar el refuerza condicionado respuestas en el CPP paradigma19. La mayoría de los estudios recientes utiliza puntuaciones CPP para directa o indirectamente reflejan el tiempo de permanencia en cámaras junto a drogas mientras que el número de entradas a cámaras laterales como un parámetro a menudo se descuida. Por estas razones, se utilizó una dosis de morfina de 10 mg/kg y se midió el número de entradas en nuestro estudio11. Los resultados muestran que las entradas de las ratas a las cámaras del lado aumentaron significativamente durante el período de abstinencia11. Esto indica que puntuaciones CPP y número de entradas son parámetros útiles para evaluar el deseo creciente de drogas y el paradigma de la CPP es aplicable para la incubación de fenómeno de craving. Sin embargo, para reducir el número de animales requeridos, un grupo de animales experimentados de morfina se prueba repetidas veces; así, el efecto de la extinción no se podría excluir con la corriente en el diseño de la asignatura. A entre el diseño del tema con el mismo protocolo puede superar esta limitación.
A continuación describe el protocolo CPP que estableció la memoria a largo plazo de la recompensa y modelado mayor antojo. Brevemente, después de tres días de acondicionamiento previo, las ratas pasan seis días acondicionado con dos ensayos de acondicionado por día y luego se prueban en diferentes momentos después del último ensayo de condicionamiento. En este paradigma CPP, se construye una caja de tres cámaras cloruro de polivinilo (PVC) usada como el aparato de la CPP y el piso del aparato es equilibrado. El aparato consiste en dos compartimientos laterales negros grandes (30 cm x 25 cm × 30 cm, L × W × H) y una media blanca cámara (11 cm x 25 cm × 30 cm, L × W × H) con piso de PVC liso blanco. Las cámaras laterales tienen texturas de piso como señales somatosensoriales: una con suelo de rejilla del plexiglás y la otra con un áspero piso de PVC.

<table><tbody><tr><td>Morfina</td><td>Shenyang Primera fábrica farmacéutica CPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aparato/cámara</td><td>Anlai empresa</td><td></td><td></td>de tecnología</tr><tr><td>SPSS</td><td>IBM Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo de preferencia de lugar condicionada para medir la incubación de antojo en ratas

A Conditioned Place Preference Protocol for Measuring Incubation of Craving in Rats

Una de las principales causas de recaídas repetidas son un deseo de la droga. Drogas antojo aumenta progresivamente durante el período de abstinencia, un fenómeno llamado incubación de anhelar de la droga. Aquí, describimos un protocolo de preferencia (CPP) de morfina acondicionado lugar para medir la incubación de antojo en ratas. En este protocolo, un paradigma CPP principalmente empleando señales somatosensoriales se utiliza para establecer una memoria a largo plazo de la recompensa de la morfina. Se construye un cuadro CPP de tres cámaras que se diferencia en la textura del piso de cámara. En primer lugar, los animales se prueban para su preferencia de línea de base para las cámaras de dos laterales por tres días consecutivos. Luego, se inyecta por vía intraperitoneal con morfina/solución salina y ponga en su cámara no-preferido/preferred por 45 min. Después de 6 días de condicionamiento, se prueba su preferencia a las cámaras de lado durante 15 minutos en diferentes puntos temporales tras la última sesión de acondicionamiento. Con este paradigma, la memoria de la recompensa de la morfina podría durar por lo menos 18 días. Para comprobar que el protocolo antes mencionado puede modelar ansia creciente, el número de entradas en las salas laterales se cuenta durante el período de abstinencia. Los resultados muestran que las entradas aumentaron, lo que sugiere que el paradigma CPP podría imitar la incubación de deseo. Los estudios futuros pueden emplear este modelo para estudiar los mecanismos neuronales subyacentes incubación de deseo y memoria a largo plazo.

Los siguientes resultados representativos demuestran que se puede mantener una morfina que CPP puede establecerse con éxito mediante el protocolo descrito y memoria a largo plazo de recompensa de morfina (figura 2). El número de entradas a cámaras laterales, análogos al número de respuestas activas en el paradigma de autoadministración, refleja la propiedad refuerza de la morfina. El aumento del número de entradas (figura 3), indicando que la incubación de deseo, se observó utilizando este paradigma CPP de morfina.
Memoria CPP podría durar por lo menos 18 días después de la última sesión de acondicionamiento.
21 ratas en el grupo de morfina y 10 ratas en el grupo de solución salina se utilizaron para probar la expresión de la memoria a largo plazo gratificante. Un ANOVA mixto reveló diferencias significativas en la interacción entre grupo y prueba (F (3.87) = 4.973, p = 0.003), prueba de (F (3.87) = 18.237, p &lt; 0.001) y grupo (F (1,29) = 11.413, p = 0.002). Diferencias significativas entre las pruebas (F (3.60) = 46.628, p &lt; 0.001) en el grupo de la morfina pero no salina group(F(3,27) = 1.576, p = 0.218) fueron detectados por un ANOVA unidireccional repetida. El análisis de comparación múltiple con ajuste de Bonferroni mostraron diferencias significativas entre las tres pruebas y T0 en el grupo de la morfina. Como se muestra en la figura 2, la memoria de la recompensa de morfina duró por lo menos 18 días y disminuyó en una tendencia dependiente del tiempo. Los datos se obtienen de un anterior estudio publicado11.
Entradas a los compartimientos en el grupo de morfina aumentado progresivamente
Grupo de la morfina Para comprobar la tendencia de las entradas, grupo (emparejado de solución salina y emparejado de la morfina) como factor entre sujetos y prueba (T0, T1, T2 y T3) como factor dentro de temas fueron fijados para un ANOVA mixto. No hubo diferencias significativas en la interacción entre grupo y prueba (F (2.311,92.449) = 1.915, p = 0.147) y grupo (F(1,40) = 0.898, p = 0.349), pero la significación de la prueba (F(2.311,92.499) = 24.243, p &lt; 0.001), fueron detectados. El análisis de comparación múltiple con menos significativa prueba de diferencia (LSD) mostraron diferencias significativas entre T1 y T0 (p &lt; 0,001), T2 y T0 (p &lt; 0,001) y T3 y T0 (p &lt; 0.001) en el grupo de la morfina en entradas emparejado de morfina. En cuanto a compartimentos emparejado de solución salina, significados estadísticos existieron entre T2 y T0 (p = 0.002) y T3 y T0 (p = 0.003) pero no T1 y T0 (p = 0.246), que es similar al patrón de incubación de la heroína anhela24. En general, las entradas a cámaras laterales en la morfina grupo aumento tiempo-dependiente.
Las ratas entradas con más frecuencia en el compartimiento de emparejado de morfina que compartimiento emparejado de solución salina en T1 (t(1,21) =-2.833, p = 0.010) y T2 (t(1,21) =-4.458, p = 0.0002) pero no T3 (t(1,21) =-0.471, p = 0.642) (dos colas emparejados pruebas t).
Grupo salina Similar con el grupo de la morfina, un ANOVA mixto se aplicó y no se reveló ninguna diferencia significativa en la interacción entre grupo y prueba (F(3,54) = 0.345, p = 0.793), test (F(3,54) = 1.793, p = 0.159) y grupo (F(1,18) = 0,151, p = 0,702). Por lo tanto, entradas a cámaras laterales en el grupo de solución salino fueron estables en el tiempo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58384/58384fig2.jpg"> Figura 2: memoria de la CPP puede durar por lo menos 18 días pero disminuye con el tiempo. Retención de la memoria de CPP en el grupo de morfina (n = 21) y el grupo de solución salino (n = 10) se evaluó mediante la medición de la puntuación de CPP para varios puntos del tiempo después de pasado acondicionado (T1, 2 días; T2, 10 días y T3, 18 días). Todos los valores de los puntajes CPP son media ± SEM. ### indica p &lt; 0.001 y ## significa p &lt; 0.01 comparado con grupo salina; indica p &lt; 0.001 comparado con T0 en el grupo de la morfina. Esta figura ha sido modificada desde Sun et al., 201711. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58384/58384fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58384/58384fig3.jpg"> Figura 3: entradas a cámaras laterales en morfina y solución salina grupos. Las entradas a dos cámaras laterales en el grupo de morfina (n = 21) y el grupo de solución salino (n = 10) se evaluaron en varios puntos del tiempo después de la última acondicionado (T1, 2 días; T2, 10 días y T3, 18 días) y en comparación con T0. Todos los valores de las entradas son media ± SEM. En el grupo de morfina (A), entradas al lado emparejado de morfina aumentaron muy significativamente de T1 a T3 mientras las entradas de cámara salina emparejado sólo aumentado significativamente de T2. T pareada pruebas con morfina emparejado compartimiento y el compartimiento emparejado de solución salina mostraron incrementos muy significativos tanto en T1 como en T2. En el grupo salino (B), hay no hay cambios significativos en las entradas a ambos lados. Esta figura ha sido modificada desde Sun et al., 201711. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58384/58384fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, un protocolo de morfina acondicionado lugar preferencia (CPP) se describe a medida incubación de antojo en ratas.

Un protocolo de preferencia de lugar condicionada para medir la incubación de antojo en ratas

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed ...

Este método puede ayudar a abordar algunas preguntas clave en el campo de la adicción a las drogas sobre los antojos de consumo de drogas y la incubación de la respuesta al antojo. Con sólo seis días de acondicionamiento de morfina, la respuesta de memoria de preferencia de lugar condicionado se puede extender a 18 días para la observación de los fenómenos de antojo en el modelo de rata. Las implicaciones de este modelo de acondicionamiento de morfina de rata se extienden hacia el desarrollo de nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes de la incubación de antojos.Antes de comenzar el procedimiento, construya un aparato de preferencia de tres cámaras condicionadas que consta de dos grandes cámaras laterales negras de 30 por 25 por 30 centímetros. Y una cámara media blanca de 11 por 25 por 30 centímetros, con un suelo de PVC liso y blanco. A continuación, agregue diferentes señales táctiles a las cámaras laterales para probar las preferencias iniciales de la rata.Para el pre-acondicionamiento de los animales, retire las puertas de guillotina para permitir el libre acceso a todo el aparato. Y coloca una rata en la cámara media. Registre la actividad del animal durante 15 minutos, calculando el tiempo pasado en las dos cámaras laterales el tercer día como línea de base.Para el acondicionamiento de los animales, inyecte el grupo de ratas condicionadas con morfina con un mililitro por kilogramo de 10 miligramos por mililitro de morfina clorhidrato IP por la mañana. Y con un mililitro por kilogramo de solución salina 10 horas más tarde, todos los días durante seis días. Colocar cada rata en su medicamento apropiado emparejado, no preferido o solución salina emparejado, cámara preferida durante 45 minutos inmediatamente después de cada inyección.Para la prueba de los animales condicionados con morfina, los días dos, 10 y 18 después de la última sesión de acondicionamiento, retire las puertas de guillotina para permitir el libre acceso a todo el aparato. Y registrar la actividad de cada animal durante 15 minutos después de la colocación en la cámara media para la exploración gratuita de todo el aparato en un estado libre de morfina. La retención de memoria de la preferencia de lugar condicionado en los grupos de morfina y solución salina se evalúa midiendo la puntuación de preferencia de lugar condicionado en varios puntos de tiempo después de la última sesión de acondicionamiento.El número de entradas a las cámaras laterales es análogo al número de respuestas activas en el paradigma de autogestión, reflejando la propiedad de refuerzo de la morfina y con un mayor número de entradas que indican la incubación del antojo. Como se ilustra, se puede establecer correctamente una preferencia de lugar condicionado con morfina mediante este protocolo. Inducir una memoria de recompensa de morfina a largo plazo hasta 18 días después de la última sesión de acondicionamiento.Al intentar este procedimiento, es importante recordar elegir equilibrar las señales táctiles. Después de este procedimiento, se pueden realizar otras medidas como la reincorporación después de cada acondicionamiento. Responder preguntas adicionales sobre si el restablecimiento bajo la incubación del antojo tiene mecanismos subyacentes similares.Después de la reincorporación, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la adición de fármacos exploraran la incubación del antojo en los paradigmas de preferencia de lugar condicionados de ratas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

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La microinyección estereotáxica de vectores virales que expresan Cre recombinasa para estudiar el papel de los genes diana de cocaína acondicionado Place Preferencia

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Aprenda a medir la incubación de antojo en ratas mediante el protocolo de preferencia de lugar condicionada con morfina. Este método permite estudiar los mecanismos de la adicción y la memoria de recompensa a largo plazo en modelos animales.

Un protocolo de preferencia de lugar condicionada para medir la incubación de antojo en ratas

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