Name: Medir consumo de oxígeno mitocondrial hepática y la cinética de pérdida de protón para estimar la respiración mitocondrial en el ganado de lechero Holstein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a medir el consumo de oxígeno mitocondrial hepático y la cinética de pérdida de protón para estimar la respiración mitocondrial en ganado lechero Holstein. Este método permite evaluar la eficiencia energética celular.

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Esta investigación fue apoyada por Alltech y la USDA Portilla fondos a través del centro para alimento Animal Health en UC Davis escuela de medicina veterinaria.

Todos los métodos, protocolo y estudios descritos aquí fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de California, Davis.
1. obtención de una biopsia del hígado de una vaca lechera Holstein
Nota: Debe realizarse una biopsia del hígado por un veterinario con licencia. Las biopsias del hígado se pueden realizar en el sitio de lácteo donde se encuentran las vacas. Las vacas lecheras lactantes pueden continuar normalmente ordeñar y leche no necesita ser retirado de la fuente de alimentación antes o después del procedimiento. Se recomienda que al menos 4 personas se necesitan para realizar la biopsia del hígado en una vaca lechera: un veterinario para realizar la biopsia, un controlador de animales en la cadera de la vaca para proteger el área de la biopsia y veterinario, técnico de laboratorio en el exterior de la pluma para transf ER herramientas, materiales de biopsia muestra desde el veterinario y y mantener el área limpia, que puede ser en la parte trasera de un vehículo (figura 1) y un técnico para recuperar la muestra de hígado y comenzar Aislamiento mitocondrial.
<ol><li>Un mes antes de las biopsias del hígado, dan las vacas una vacunación de clostridia. Crear paquetes quirúrgicos por toallas quirúrgicas de esterilización en autoclave, instrumento de biopsia, titulares de bisturí y material quirúrgico.</li>
	<li>Un día antes de la biopsia del hígado, inyectar a la vaca con clorhidrato de Ceftiofur 0,044 mL/kg peso corporal por vía subcutánea en el cuello. Controle la temperatura de la vaca de admisión y puntajes fecales para usar como base para la función normal.</li>
	<li>Crear las mitocondrias aislamiento media (MIM) containining 220 mM el manitol, sacarosa de 70 mM, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA y 0,1% (p/v) BSA libre de ácidos grasos, pH 7,4 a 4 ° C. Se necesitarán aproximadamente 30 mL por muestra.</li>
	<li>Contener la vaca físicamente utilizando un headlock con un halter según sea necesario (figura 2). Uso del cabestro, lazo la cabeza al lado izquierdo de la barra. Si es necesario, una restricción química (IV de 100 mg/mL de clorhidrato de xilacina en 0.010-0.015 mg/kg de peso) puede ser utilizado.</li>
	<li>El área de la biopsia se encuentra en el espacio intercostal derecho 10 - 11 (figura 3). Trazar una línea recta desde las caderas del tubérculo derecho hasta el punto del hombro derecho. El sitio de la biopsia es donde esta recta corta con el espacio intercostal 10 y 11. Esterilizar el área de la vaca para tomar la biopsia por afeitado un área cuadrada de 10 cm (figura 4). Lave el área con 10% providone matorrales (figura 5) con un movimiento circular. Rocíe el área con solución de etanol 70% (figura 6). Repetir los lavados providone y etanol. Nota: El hígado está en una posición ligeramente diferente en el ganado de lechero Holstein en comparación con el ganado de carne.</li>
	<li>Se inyectan 2% lidocaína HCl (10-15 mL) localmente la zona para proporcionar anestesia de la piel y subyacente tejido muscular y conjuntivo (figura 7). Repita providone y lavados de etanol 70%. Nota: Las terminaciones nerviosas están en la piel y músculo, pero no vísceras, por lo que sólo un local anesthestic es necesaria. En la mayoría, la vaca debe sólo sentir algo de presión y sin dolor durante el procedimiento de biopsia.</li>
	<li>Hacer una incisión de stab 1-2 cm a través de la piel del espacio intercostal 10 y 11 (figura 8). Pasar un instrumento de biopsia del hígado bovino Schackelford Courtney a través de la piel y dirigir el instrumento para biopsia en una dirección craneal leve mientras continúa a través del diafragma y en el hígado (figura 9, figura 10). Obtener una muestra de 1 g del hígado y retire el instrumento (figura 11). Cierre la piel con la colocación de sutura (figura 12).</li>
	<li>Colocar hígado muestra en un tubo cónico con suficiente MIM para cubrir la muestra, en el hielo para el aislamiento de las mitocondrias inmediata</li>
	<li>Incisión de verificación para cualquier enrojecimiento, hinchazón, calor, o dolor dentro de las 24 horas de la biopsia e inyectar a la vaca con clorhidrato de Ceftiofur 0,044 mL/kg peso corporal por vía subcutánea en el cuello una vez al día durante los próximos 3 días (figura 13). Monitorear temperatura de admisión y partituras fecales de la vaca diariamente durante 1 semana después de la biopsia del hígado. Si desarrolla fiebre, continuar antibióticos a criterio del veterinario. Nota: Si una vaca exhibe signos de dolor, como patadas en el sitio de la incisión, recumbancy, enrojecimiento, calor o reacción al tacto dentro de 1 h después de la biopsia del hígado, una inyección de IV de 1 mg/kg peso corporal de meglumina de Flunixina se puede utilizar para aliviar el dolor y la inflamación. Si es necesario se puede administrar una segunda inyección.</li>
	<li>Retire las suturas 7 días después de la biopsia.</li>
</ol>2. aislamiento de mitocondrias de hígado de vaca lechera
<ol><li>Tan pronto como sea posible luego de la muestra de hígado de la vaca, lavar la muestra de hígado en MIM (paso 1.3) para eliminar las células de sangre rojas y picar finamente la muestra con tijeras. El hígado debe ser picado en un vaso frío con suficiente medios de aislamiento para mantener el tejido húmedo.</li>
	<li>Coloque el hígado picado en un frasco de vidrio de 30 mL con un pistilo de teflón de 0,16 mm de espacio se incubó en hielo y que contiene MIM (1:4 p/v).</li>
	<li>Homogeneizar la muestra de hígado en Maja de teflon en 500 rpm por un minuto con 4 golpes/min. Nota: El hígado homogeneizado se conserva en un vaso lleno de hielo en el MIM durante todo el proceso, y todos los siguientes pasos de centrifugación se completan a 4 ° C</li>
	<li>Centrifugar el homogeneizado a 500 x g por 10 min, descartar de la pelotilla, transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga refrigerada y luego centrifugar el sobrenadante resultante a 10.000 x g por 10 min obtener el pellet mitocondrial.</li>
	<li>Suspender y lavar el precipitado en 10 mL de MIM con BSA libre de ácidos grasos y centrifugue a 8100 x g durante 10 min descartar sobrenadante.</li>
	<li>Suspender y lavar el precipitado en 10 mL de MIM sin BSA libre de ácidos grasos y centrifugue a 8100 x g durante 10 min descartar sobrenadante.</li>
	<li>Suspender el pellet en 200 μL de medio de aislamiento y coloque en hielo hasta su uso para el consumo de oxígeno y protones fuga ensayos cinéticos.</li>
	<li>Determinar la concentración de la proteína, de la suspensión de la pelotilla (dilución 1/100), con kit de (BCA) ácido Bicinchoninic según el protocolo del fabricante BSA como estándar. Toda proteína se considera proteína mitocondrial.</li>
</ol>3. medir el consumo de oxígeno mitocondrial (estado 3 y estado 4)
<ol><li>Crear medios de consumo de oxígeno (OCM) de 120 mM KCl, 5 m m KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes y 1 mM EGTA, pH 7.4 a 30 ° C con 0.3% desengrasada BSA. Se necesitarán aproximadamente 3 mL por muestra. También prepare una solución de 8 oligomycin μg/mL en etanol.</li>
	<li>OCM de incubar a 30 ° C. Configurar electrodo cámara, bomba y oxígeno de la respiración según las instrucciones del fabricante (sistema oxygraph). El software oxygraph ya debería estar instalado en el equipo.</li>
	<li>Coloque 1 mL de la OCM en la cámara de respiración y agitar vigorosamente. Esto ayudará a asegurar que la solución se satura con el aire.</li>
	<li>Añadir 0,35 mg de proteína de proteína mitocondrial a la cámara de respiración y mantener la temperatura a 30 ° C.</li>
	<li>Registrar el consumo de oxígeno durante aproximadamente 5 minutos. La concentración de oxígeno de los registros de sistema de oxygraph, así como aumentos de la respiración, la concentración de oxígeno disminuye. Cuando el consumo de oxígeno se vuelve constante (una línea recta decreciente), consumo de oxígeno registro (pendiente de línea = concentración de oxígeno/hora). Se trata de consumo de oxígeno basal.</li>
	<li>Añadir 1.25 μl de solución de rotenona de 4 mM para inhibir el complejo I y luego añadir 5 μl de solución de succinato de 1 M para alcanzar una concentración final en la cámara respiratoria del succinato de 5 mM. Esto es estado 4 respiración.</li>
	<li>Añadir 1 μl de solución de ADP 100 mM para alcanzar una concentración final en la cámara de respiración de 100 μM. Disminuirá la concentración de oxígeno (respiración aumentada) y luego después de unos 5 min se convierte en una línea recta. Registrar el consumo de oxígeno (pendiente de línea = concentración de oxígeno/hora). Esto es la respiración de estado 3.</li>
	<li>Opcional: Al final de la carrera, añadir FCCP (volumen total de 0,2 μM) para inducir la respiración máxima. Registrar la respiración durante unos 5 minutos (aproximadamente). Cuando el consumo de oxígeno se convierte en consumo de oxígeno constantes, de registro. Se trata de consumo de oxígeno máximo.</li>
	<li>Calcular el Ratio de Control respiratorio (RCR) usando la ecuación de consumo de oxígeno del estado 3 / 4 consumo de oxígeno del estado.</li>
	<li>Aspirar todas las soluciones de la cámara de respiración. Enjuague la cámara varias veces con agua desionizada.</li>
</ol>4. medición de potencial de membrana mitocondrial (MMP) y la fuerza motriz protónica (FMP)
<ol><li>Preparar solución de 80 nigericin ng/mL en etanol. Nota: Estos productos químicos se disuelven en etanol, y debe hacer todo lo posible para limitar la cantidad de etanol que se agrega a menos de 1 μL, ya que el etanol puede desacoplar el sistema de transporte de electrones y causar la disfunción mitchondrial.</li>
	<li>Después de enjuagar bien la cámara con agua desionizada, coloque 1 mL de la OCM en la cámara de respiración y agite vigorosamente con una barra de agitación magnética. Esto ayudará a asegurar que la solución se satura con el aire. Añadir el electrodo metil-trifenil fosfonio (TPMP +) sensible para configuración de cámara. TPMP + electrodos deben ser conectados a un medidor de pH y valores se leen desde el medidor de pH.</li>
	<li>Añadir 0,35 mg de proteína mitocondrial a la cámara de respiración.</li>
	<li>Añadir 1.25 μl de solución de rotenona de 4 mM para inhibir la respiración complejo registro de I. 2-5 minutos (aproximadamente). Cuando el consumo de oxígeno se convierte en consumo de oxígeno constantes, de registro.</li>
	<li>Agregar 0.56 μL de solución de oligomycin de 8 μg/mL a una concentración final de 2,8 μg oligomycin 0,35 mg de proteína mitocondrial para inhibir la utilización de ADP. Registrar la respiración 2-5 minutos (aproximadamente). Cuando el consumo de oxígeno se convierte en consumo de oxígeno constantes, de registro.</li>
	<li>Añadir 0.112 μL solución de nigericin de 80 ng/mL para abolir el gradiente de pH a través de la membrana interna mitocondrial. Registrar la respiración 2-5 minutos (aproximadamente). Cuando el consumo de oxígeno se convierte en consumo de oxígeno constantes, de registro. Nota: Rotenona y oligomycin se utilizan para bloquear el transporte de electrones de la cadena en el complejo I y ATP sintasa, respectivamente. Nigericin se añade para convertir el gradiente de H + transmembrana a un gradiente de K + que puede ser medido con un electrodo.</li>
	<li>Preparar una curva estándar para TPMP + añadir 5 μl de solución TPMP + 10 mM para la incubación mitocondrial. Repita este paso cuatro veces más hasta una concentración total de 2,5 μM TPMP + se ha añadido.</li>
	<li>Añadir 5 μL de succinato de 1M a la cámara para iniciar la respiración.</li>
	<li>Registrar la respiración hasta que haya obtenido una traza estable, y luego valorar el sistema mediante la adición de malonato. Adiciones de malonato deben ser 0,5 μl, 1 μl, 1,5 μl, 3.0 μL, μl 6.0, 9.0 μL, luego 12.5 μl de 0,1 mM solución malonato para lograr sucesivas adiciones de malonato de concentraciones en la cámara de incubación de 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1.2, 1.8 y 2.5 mM.</li>
	<li>Recopilar datos de los dos electrodos (oxígeno y TPMP+). Software de adquisición de datos desde el sistema de oxygraph puede utilizarse para recoger mediciones simultáneas de consumo de oxígeno mitocondrial y potencial de membrana mitocondrial y observar los cambios en el consumo de oxígeno en tiempo real. Figura 14 muestra cómo el sistema de oxygraph registra el consumo de oxígeno medida que avanza el experimento.</li>
	<li>Calcular MMP en mV basado en la ecuación de Nernst: MMP = 61.5 log ([TPMP +] añadido – externo [TPMP +]) corrección de enlace x TPMP+ / (x 0.001 mg de proteína/mL x [TPMP +]) Se utiliza una corrección TPMP + enlace de 0.4 μl/mg de proteína mitocondrial-1 . Ejemplo cálculo basado en las concentraciones en el protocolo: MMP = 61.5 x log (5 μm-μm 2) x 0.4 / (0,001 x 0.35 mg proteína/mL mitocondrial x 2 μm) MMP = 198,9 mV</li>
	<li>PMF de estimación mediante el trazado de un gráfico de MMP vs el consumo de oxígeno (figura 15). PMF se divulga como consumo de oxígeno en un potencial de membrana de 165 mV. Nota: Valorar la cadena de transporte de electrones con malonato (0.1 a 2.5 mM) muestra la respuesta cinética de pérdida de protón a MMP. Entonces, conspirar MMP contra el consumo de oxígeno determina la cinética de pérdida de protón. PMF se determina calculando el consumo de oxígeno en un potencial de membrana comun (165 mV).</li>
	<li>Al final de la última serie de la muestra, añadir FCCP (volumen total de 0,2 μM) para inducir la respiración máxima y liberar TPMP + corrección de línea base.</li>
	<li>Aspirar todas las soluciones de la cámara de respiración. Enjuague la cámara varias veces con agua desionizada. Al final del día, la cámara debería también ser enjuagada varias veces con etanol.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El punto más crítico en el protocolo es obtener una muestra representativa de tejido hepático y empezando el aislamiento de las mitocondrias tan pronto como sea posible después de la biopsia. Variación en las mediciones de la respiración es baja (tabla 1) debido a un tiempo de transporte corto de la vaca a laboratorio. Para reducir el tiempo de transporte, se estableció un pequeño laboratorio en la oficina de la lechería, y las muestras de hígado fueron conducidas al laboratorio de la oficina como cada u...

Las mitocondrias son muy sensibles al estrés y su entorno celular puede contribuir a una amplia variedad de enfermedades metabólicas. Consumo de oxígeno y escape de protones en la mitocondria son indicadores de la salud de las mitocondrias. Los métodos descritos en este documento estimación mitocondrial eficiencia usando RCR basan en el consumo de oxígeno con y sin fuga de protones. Estos resultados pueden representan 30% de la energía perdida en la utilización de nutrientes1. Cambios en la fuga de oxígeno consumo y protón pueden identificar la disfunción mitocondrial que contribuye a la enfermedad metabólica y resultados en eficiencia energética disminuida. Estos métodos pueden utilizarse también para examinar el efecto de diferentes tratamientos sobre la respiración mitocondrial. El objetivo de medir consumo de oxígeno mitocondrial y la cinética de pérdida de protón es evaluar la función mitocondrial y la eficiencia energética.
Disfunción mitocondrial hepática se ha asociado con varias enfermedades en el ganado lechero. La capacidad de metabolismo celular para cambiar entre los combustibles hidratos de carbono y lípidos frente a un déficit de energía en la lactancia temprana está influenciada por el número y función de mitocondrias en la célula2. Defectos en la capacidad de adaptarse a una mayor demanda de energía y aumento de la β-oxidación de las mitocondrias pueden conducir a la acumulación de lípidos intracelulares asociados con resistencia a la insulina y pueden conducir a la formación de hígado graso en vacas primera lactancia. Las mitocondrias, como el sitio de producción del cuerpo de la cetona y el uso, pueden jugar un papel clave en cetosis en vacas lecheras3. La falta de mitocondrias o disfunción mitocondrial afectará la disponibilidad de combustible a la periferia y se refleja en cambios en el consumo de oxígeno o RCR.
Cambios de consumo de oxígeno mitocondrial en respuesta a la inflamación. Pollos de siete días de edad fueron asignados aleatoriamente a un grupo de infectados con Eimeria maxima y un grupo de control4. Pollos que no se someten a desafío de coccidiosis tenían menor consumo de oxígeno debido a la pérdida de protón y RCR superior indicando que las mitocondrias hepáticas responden a un reto inmunológico por creciente fuga de protones. Escape de protones y reactiva producción de especies de oxígeno una vez era considerado un signo de disfunción de la membrana mitocondrial y perjudicial para la eficiencia energética, ahora se sabe que es importante para la importación de proteínas y calcio en la mitocondria5 y para la generación de calor1.
Escape de electrones de la cadena respiratoria hace mitocondrias susceptibles a la producción de especies reactivas del oxígeno y el daño oxidativo a las proteínas de la membrana mitocondrial, lípidos y ADN mitocondrial. Medida que envejecen las mitocondrias, se puede acumular daño especialmente a mtDNA causando más disfunción en el metabolismo mitocondrial6 y una mayor susceptibilidad de la vaca a la enfermedad. En la práctica, muchos animales de ganado son alimentados con altos niveles de suplementos tales como Cu, Zn y Mn para impulsar la función antioxidante. Sin embargo, alimentando altos niveles de Cu, Zn y Mn disminuyeron la producción de leche y mayor consumo de oxígeno debido a la fuga (estado 4 respiración) de protones7.
Investigación previa sobre el papel de la función mitocondrial en la eficiencia energética en el ganado bovino se ha centrado en cambios en el consumo de oxígeno mitocondrial y la fuga de protones. Muy pocos estudios han sido publicados en ganado lechero y mayoría de los papeles compara la eficacia de la producción en la forma de consumo de alimento residual (RFI) para la función mitocondrial en ganado de carne. Variabilidad en la respiración mitocondrial, las tasas fueron examinadas mediante la medición de estado 3 Estado 4 y RCR en hígados de vacas Holstein y de carne lactantes vacas (Angus, Brangus y Hereford)8. Los investigadores no encontraron ninguna correlación en la respiración mitocondrial con crecimiento o rasgos para ganado de ordeño pero presentaron una correlación entre la respiración mitocondrial y ordeño rasgos para vacas Holstein. En dos estudios, RFI se comparó en bovinos para carne (estado 3 Estado 4 y RCR) de las tasas de respiración mitocondrial en músculo mitocondrias9,10. Cambiaron las tasas de respiración mitocondrial en respuesta a DMI y tarifas fueron asociados con novillos de carne de res menos eficientes. En otro estudio, RFI de novillos de toros altas o bajas RFI se compararon con las tasas de respiración mitocondrial y cinética de pérdida de protones entre los dos grupos de progenie11. Las diferencias fueron por aumento confirmando la conclusión de que ganar hace respiración mitocondrial de no impacto en bovinos para carne.
En este papel, un experimento examinar hígado RCR en respuesta a la alimentación de vacas lecheras lactantes 3 minerales antioxidantes ilustra el uso de métodos para medir el consumo de oxígeno durante 4 y estado 3 la respiración y la fuerza motriz protónica.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Biopsia hepática</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schackelford-Courtney instrumento de biopsia hepática bovina</td><td>Sontec Instruments Englewood CO</td><td>1103-904</td><td></td></tr><tr><td>Sutura</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de sutura</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Incluidas con bisturí de sutura</td></tr><tr><td></td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S2896 / S2646</td><td># para mango y cuchillas Toallas</td></tr><tr><td>de cirugía</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-6667</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z168750</td><td></td></tr><tr><td>jeringas de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-314387</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de inyección (22, 2 1/2)</td><td>VWR</td><td>MJ8881-200342</td><td></td></tr><tr><td>Cabestro de vaca</td><td>Tractor Supply Co.</td><td></td><td></td>101966599</tr><tr><td>Hisopo de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-102</td><td></td></tr><tr><td>cuadrados de gasa de algodón (4x4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras médicas</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coccidiosis Vacuna 0.75 botella/vaca</td><td></td><td></td><td>Proporcionado por Vacuna</td></tr><tr><td></td><td></td> Veterinaria<td>Clostridia</td><td>Proporcionada por el Veterinario</td></tr><tr><td>Biopsia de Hígado antibióticos excenel 2 cc/100 lbs durante 3 días</td><td></td><td></td><td>Proporcionada por el Veterinario</td></tr><tr><td>Providone Scrub</td><td>Aspen Veteterinary Resources</td><td>21260221</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>793213</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de xilacina 100 mg/mL IV a 0,010-0,015 mg/kg peso corporal</td><td>Proporcionado por el veterinario</td>2% lidocaína HCl (10-15 mL)Proporcionado por el veterinario 1 mg/kg inyección intravenosa de flunixina meglumina Proporcionado por el veterinario<fuerte>Aislamiento de mitocondrias (hígado)</fuerte><fuerte>Equipo</fuerte><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frasco Wheaton de 30 mL con un mortero de teflón de 0,16 mm de holgura</td><td>Motor Fisher Scientific</td><td>02-911-527</td><td></td></tr><tr><td>Cole</td><td>Parmer</td><td>EW-04369-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonda Homogeneizadora</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04468-22</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta automática (10 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-74</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados (500 mL) con hielo</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuga refrigerada</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-002-441EW3</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>ChemicalsKit de ensayo de</td> proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (microplacas para lector de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>placas)</td><td>abcam</td><td>ab102536</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>BSA (libre de ácidos grasos)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Agua desionizada</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>38796</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Úselo para crear medios de aislamiento de mitocondrias: 220 mM de manitol, 70 mM de sacarosa, 20 mM de HEPES, 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA y 0,1% (p/v) de BSA libre de ácidos grasos,&nbsp; pH 7,4 a 4 & grados; C, durará 2 días en refrigerador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Consumo de oxígeno mitocondrial</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte>Configuración de</td> oxígrafo + electrodo de oxígeno tipo Clark Hansatech (PP Systems)OXY1 Bomba de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agua termorregulada</td><td>ADInstrumentos</td><td>MLE2001</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de oxígeno tipo Clark</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Autopipeta (1 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-70</td><td>Incluido con Oxy1</td></tr><tr><td>Pequeña barra de agitación magnética</td><td>Micropipeta Fisher Scientific</td><td>14-513-95</td><td></td></tr><tr><td>(10 &mu; L)</td> <td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-60</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E3889-100G</td><td></td></tr><tr><td>Úselo para hacer que los medios de consumo de oxígeno mitocondrial: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes y 1 mM EGTA, &nbsp; pH 7.4 a 30 &deg; C con</td> rotanona BSA <td></td><td></td><td></td>desgrasada al 0,3%</tr><tr><td>(solución de 4 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R8875-5G</td><td></td></tr><tr><td>Succinato (solución de 1 M)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S3674-250G</td><td></td></tr><tr><td>ADP (solución de 100 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina (solución de 8 &mu; g/mL en etanol)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Potencial de membrana mitocondrial y fuerza motriz de protón</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPMP electrodo</td> World <td>Precision Instruments.</td><td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Las soluciones químicas no necesitan ser frescas, pero sí deben mantenerse en un congelador entre tiradas</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>malonato (solución de 0,1 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina (8 &mu; g/mL en etanol), mantener en congelador</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Nigericina (80 ng/mL en etanol), mantener en congelador</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C3920</td><td></td></tr><tr><td>TPMP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T200</td><td></td></tr><tr><td>TPMP solución: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes y 1 mM EGTA,&nbsp; pH 7,4 a 30 &ng; C con 0,3% de BSA</td><td></td><td></td><td></td> desgrasado</tr></tbody></table>

medir consumo de oxígeno mitocondrial hepática y la cinética de pérdida de protón para estimar la respiración mitocondrial en el ganado de lechero holstein

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Consumo de oxígeno, fuerza de motivo del protón (PMF) y fuga de protones son las medidas de la respiración mitocondrial, o bien las mitocondrias son capaces de convertir los NADH y FADH en ATP. Puesto que las mitocondrias son el sitio primario para el uso de oxígeno y nutrientes oxidación a dióxido de carbono y agua, sobre la eficacia que utilizan oxígeno y producen ATP directamente se relaciona con la eficiencia del metabolismo de nutrientes, necesidades de nutrientes del animal, y salud del animal. El propósito de este método es examinar la respiración mitocondrial, que puede utilizarse para examinar los efectos de diferentes fármacos, dietas y efectos ambientales sobre el metabolismo mitocondrial. Los resultados incluyen el consumo de oxígeno medido como respiración dependiente de protones (estado 3) y respiración dependiente de fuga de protones (estado 4). La relación de la respiración del estado 3 / Estado 4 se define como el cociente del control respiratorio (RCR) y puede representar eficiencia energética mitocondrial. Escape de protones mitocondrial es un proceso que permite la disipación del potencial de membrana mitocondrial (MMP) por desacoplar la fosforilación oxidativa de ADP disminuye la eficiencia de síntesis de ATP. Oxígeno y TRMP + electrodos sensibles con sustratos mitocondriales e inhibidores de la cadena de transporte de electrones se utilizan para medir el estado 3 y estado 4 respiración, membrana mitocondrial PMF (o el potencial para producir ATP) y fuga de protones. Limitaciones a este método son que el tejido del hígado debe ser tan fresco como sea posible y todas las biopsias y los análisis deben realizarse en menos de 10 h. Esto limita el número de muestras que pueden ser recogidos y procesados por una sola persona en un día a unos 5. Sin embargo, es necesario sólo 1 g de tejido hepático, por lo que en grandes animales, como vacas lecheras, la cantidad de muestra necesaria es pequeña en relación con el tamaño del hígado y hay poco tiempo de recuperación necesario.

Resultados positivos que muestran cinética de escape RCR y protón se muestran en la tabla 1 y la figura 15, respectivamente. En este estudio7, RCR y proteína fuga cinética se midieron en vacas lecheras Holstein en 70 días en leche después de que las vacas habían sido alimentadas con 1 de 5 diferentes niveles de Cu, Zn y Mn durante 28 días. Estado 4, respiración dependiente de la fuga de protones máximo, tenía una tende...

Aquí, compartimos los métodos para medir el consumo de oxígeno mitocondrial, un concepto definitorio de nutrición energética y escape de protones, la principal causa de ineficiencia en generación mitocondrial de ATP. 30% de la energía perdida en la utilización de nutrientes para ayudar a evaluar la función mitocondrial pueden explicar estos resultados.

Medir consumo de oxígeno mitocondrial hepática y la cinética de pérdida de protón para estimar la respiración mitocondrial en el ganado de lechero Holstein

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la energía, como la salud mitocondrial, la eficiencia energética y el uso de energía. La principal ventaja de esta técnica es que el consumo de oxígeno de las mitocondrias aisladas se mide directamente. No es necesario corregir los resultados para otros procesos metabólicos intracelulares.Primero decidimos seguir este método en el ganado lechero cuando queríamos examinar cómo la eficiencia mitocondrial afecta la eficiencia de los piensos. La demostración en vídeo de este método es fundamental, ya que los pasos en el aislamiento mitocondrial son difíciles de aprender porque necesitan ser consistentes y precisos. Tan pronto como sea posible después de que se extraiga la muestra de hígado de la vaca lave la muestra en medios de aislamiento de las mitocondrias para eliminar los glóbulos rojos.Usando tijeras picar finamente el tejido en un vaso de precipitados refrigerado que contiene suficientes medios de aislamiento para mantener el tejido húmedo. Transfiera el hígado picado a un vial de vidrio de 30 mililitros que contenga medios de aislamiento de mitocondrias. Añadir un pestle de teflón que tenga un aclaramiento de 0,16 milímetros y que haya sido incubado en hielo y homogeneice la muestra de hígado a 500 RPM durante un minuto con cuatro golpes por minuto.Después de esto, transfiera el homogeneato a un tubo que contenga medios de aislamiento de las mitocondrias y colóquelo en un vaso de precipitados lleno de hielo. Centrifugar homogeneizar a 500 veces G y cuatro grados celsius durante 10 minutos. Deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga refrigerada.Centrifugar el sobrenadante resultante a 10.000 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para obtener el pellet mitocondrial. Resuspender y lavar el pellet en 10 mililitros de medios de aislamiento de mitocondrias con BSA libre de ácidos grasos. Luego centrifugar a 8, 100 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos.Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 microlitros de medios de aislamiento. Coloque esto sobre hielo hasta que esté listo para usar para el consumo de oxígeno y los ensayos cinéticos con fugas de protones. Determinar la concentración proteica de la suspensión de pellets utilizando un kit de ácido bicinchoninic según las instrucciones del fabricante utilizando BSA como estándar.En primer lugar, cree medios de consumo de oxígeno como se describe en el protocolo de texto. Incubar los medios de consumo de oxígeno a 30 grados centígrados. A continuación, configure la cámara de respiración, la bomba y el electrodo de oxígeno para el sistema de oxigrafía de acuerdo con las instrucciones del fabricante.A continuación, coloque un mililitro de medios de consumo de oxígeno en la cámara de respiración. Luego agregue 0,35 miligramos de proteína mitocondrial a la cámara. Revuelva vigorosamente para asegurarse de que la solución se satura con aire y mantenga una temperatura de 30 grados centígrados.Registre el consumo de oxígeno durante aproximadamente cinco minutos. Cuando el consumo de oxígeno se convierte en constante representado por una línea recta decreciente, registre esto como el consumo de oxígeno basal. Añadir 1,25 microlitros de una solución de rotenona de cuatro mililitrolares para inhibir la solución compleja, y luego añadir cinco microlitros de una solución de succinato molar para alcanzar una concentración final de cinco succinatos mililolares en la cámara respiratoria.Este es el consumo de oxígeno del estado IV. Después de esto, añadir un microlitro de una solución ADP de 100 mililitros para alcanzar una concentración final de 100 micromolares en la cámara de respiración. El consumo de oxígeno disminuirá durante aproximadamente cinco minutos y luego se convertirá en una línea recta.Registre este consumo de oxígeno como la respiración del estado III. Calcular la relación de control respiratorio como se describe en el protocolo de texto. A continuación, aspirar todas las soluciones fuera de la cámara de respiración.Enjuague la cámara varias veces con agua desionizada doble. En primer lugar, preparar una solución de 80 nanogramos por mililitro de nigericin en etanol limitando la cantidad de etanol añadido a menos de un microlitro. Además, preparar una solución de ocho microgramos por mililitro de oligomicina en etanol.Después de enjuagar a fondo la cámara con agua desionizada doble, coloque un mililitro de los medios de consumo de oxígeno en la cámara de respiración y revuelva vigorosamente con una barra de agitación magnética. Añadir 0,35 miligramos de proteína mitocondrial a la cámara de respiración. Agregue un electrodo sensible al triphenylphosphonium metilo a la configuración de la cámara asegurándose de que el otro extremo esté conectado correctamente a un medidor de pH.Añadir 1,25 microlitros de una solución de rotenona de cuatro mililitrolares para inhibir el Complejo I.Grabar la respiración durante dos a cinco minutos. Registre el valor de consumo de oxígeno cuando se vuelva constante. A continuación, agregue 0,56 microlitros de una solución de oligomicina para inhibir la utilización de ADP.Registre la respiración durante unos dos a cinco minutos. Registre el valor de consumo de oxígeno cuando se vuelva constante. A continuación, agregue 0,112 microlitros de una solución de 80 nanogramos por mililitro de nigericiina para abolir el gradiente de pH a través de la membrana interna mitocondrial.Registre la respiración durante dos a cinco minutos y observe el valor de consumo de oxígeno cuando se vuelve constante. Añadir cinco microlitros de 10 mililitros de solución de metil triphenylphosphonium a la incubación mitocondrial para comenzar a preparar una curva estándar. Repita esta adición cuatro veces adicionales hasta una concentración total de 2,5.micromolar ha sido añadido. Después de esto, agregue cinco microlitros de una solución de succinato molar a la cámara para iniciar la respiración. Registre la respiración hasta que se logre un rastro estable.A continuación, agregue malonato para valorar el sistema como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, la cinética de fugas de protón y RCR se mide en la leche de vacas lecheras Holstein 70 días después de que las vacas lecheras se hubieran alimentado con diferentes niveles de cobre, zinc y manganeso durante 28 días. La respiración del Estado IV se considera la más alta en las vacas dados bajos niveles de manganeso, sin embargo, es más baja en las vacas de control, lo que indica que el manganeso juega un papel importante en la minimización de la respiración dependiente de la fuga de protones.El análisis de la respiración dependiente de la fuga de protones hepáticos revela que esta respiración es mayor en vacas tratadas con manganeso bajo, y la más baja en vacas de control. Estos resultados confirman que el grupo de manganeso bajo tiene la mayor respiración de estado IV mientras que el grupo de control tiene la más baja. Si bien la eficiencia de alimentación es mayor en los novillos Angus nacidos de toros RFI bajos que los toros RFI altos, esto no se refleció en el RCR mitocondrial o en la cinética de fugas de protones.Durante la realización de este procedimiento es importante mantener todos los viales y vasos en el hielo mientras se procesa la mitocondria. Después de su desarrollo esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la nutrición láctea exploraran el papel de la eficiencia de las mitocondrias en la eficiencia de los piensos y la función mitocondrial en el hígado. No olvide que trabajar con rotenona puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar guantes, protección para los ojos y EPP adecuada durante la realización de este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Fuente:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumentos OroborosEste video explica cómo se utiliza el flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células de mamíferos vivas y permeabilizadas. Demuestra el uso secuencial de digitonina, sustratos metabólicos, ADP, un desacoplador y un inhibidor para caracterizar diferentes estados respiratorios. El perfil de flujo de oxígeno resultante revela la función mitocondrial y la eficiencia de acoplamiento...

Mediciones de flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células vivas y permeabilizadas

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Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

De alta resolución de respirometría se utiliza para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Se trata de una técnica sencilla para determinar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial '(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima, y ​​la integridad de la membrana mitocondrial externa.

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Medición de consumo de oxígeno mitocondrial en las fibras Permeabilized de Drosophila utilizando cantidades mínimas de tejido

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Medir consumo de oxígeno mitocondrial hepática y la cinética de pérdida de protón para estimar la respiración mitocondrial en el ganado de lechero Holstein (Video) | JoVE Journal

Medir consumo de oxígeno mitocondrial hepática y la cinética de pérdida de protón para estimar la respiración mitocondrial en el ganado de lechero Holstein

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