Name: Panel de inmunofluorescencia Multiplex automatizado para estudios de inmuno-Oncología en los especímenes del tejido formalina-fijo Carcinoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprende un panel de inmunofluorescencia multiplex automatizado de seis marcadores para estudios de inmuno-oncología en tejido fijado en formalina. Este protocolo optimizado permite evaluar múltiples tipos de células inmunes en tumores con resultados consistentes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Apoyo editorial fue proporcionada por Deborah Shuman de MedImmune.

<ol><li>Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprofiling+as+a+predictor+of+patient%27s+response+to+cancer+therapy-promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges.</a> Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).</li>
<li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+tumor+immune+microenvironment+for+staging+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics.</a> Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).</li>
<li>Idikio, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+in+diagnostic+surgical+pathology%3A+contributions+of+protein+life-cycle%2C+use+of+evidence-based+methods+and+data+normalization+on+interpretation+of+immunohistochemical+stains%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).</li>
<li>Rebelatto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+programmed+cell+death+ligand-1+immunohistochemical+assay+validated+for+analysis+of+non-small+cell+lung+cancer+and+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma.</a> Diagnostic Pathology. 11 (1), 95(2016).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+image+analysis-based+study+shows+that+several+immune+checkpoints+are+co-expressed+in+non-small+cell+lung+carcinoma+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).</li>
<li>Rehman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+pathologist-read+comparison+of+the+heterogeneity+of+programmed+death-ligand+1+%28PD-L1%29+expression+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer.</a> Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).</li>
<li>Dixon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+multiplexing+techniques+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+immune+profiling+in+HPV-+oral+squamous+cell+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer.</a> JCI Insight. 2 (14), (2017).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47(2015).</li>
<li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunofluorescence+analysis+and+quantification+of+intratumoral+PD-1%2B+Tim-3%2B+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Ribas, A., Wolchok, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+using+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy using checkpoint blockade.</a> Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+neoadjuvant+chemotherapy+on+the+immune+microenvironment+in+non-small+cell+lung+carcinomas+as+determined+by+multiplex+immunofluorescence+and+image+analysis+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48(2018).</li>
<li>Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unvalidated+antibodies+and+misleading+results%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Unvalidated antibodies and misleading results.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).</li>
<li>Baskin, D. G., Hewitt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+state+of+the+science+of+immunohistochemistry%3A+the+Histochemical+Society%27s+standards+of+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).</li>
<li>Freedman, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+improved+education+and+training+in+research+antibody+usage+and+validation+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices.</a> Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).</li>
<li>Hewitt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility%3A+it+is+just+good+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Reproducibility: it is just good science.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223(2016).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
</ol>

Este trabajo fue apoyado por MedImmune, el biologics global R & D arm de AstraZeneca. C.W., K.R. y C.C.H. son empleados de Perkin Elmer, que produce los reactivos (kit de la TSA) y escáneres multiespectrales que se utilizaron en este trabajo. M.S., K.D., A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Brown, J.C., A.L., K.S., M.R. y J.R.C. son empleados de MedImmune con participación o intereses comunes o las opciones en AstraZeneca.

La revolución de la inmunoterapia de cáncer curso es apertura nuevas y prometedoras opciones terapéuticas para pacientes de cáncer13. Avances en el campo de la inmuno-Oncología requiere mayor conocimiento del microambiente del tumor inflamatorio, no sólo para entender la biología de los mecanismos inmunológicos involucrados en la carcinogénesis pero también para encontrar biomarcadores predictivos para el nuevo tratamientos basados en inmunoterapia1,<sup class="x...

Immunoprofiling análisis de muestras de tejido FFPE tumor se ha convertido en un componente esencial de los estudios de inmuno-Oncología, particularmente para el descubrimiento y validación de nuevos biomarcadores predictivos para la inmunoterapia del cáncer en el contexto de ensayos clínicos1 ,2. IHC cromogénica, utilizando químicos cromógenos como diaminobenzidina, sigue siendo la técnica estándar en patología diagnóstica de la inmunomarcación de biopsia del tejido3. IHC estándar puede usarse también para immunoprofiling de tejido de cáncer, incluyendo la cuantificación de subpoblaciones de linfocitos tumorales asociadas y la evaluación de los niveles de expresión de checkpoints inmunes como ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1)4 ,5. IHC estándar es limitada, sin embargo, en sólo un antígeno puede ser etiquetado según la sección de tejido. Porque immunoprofiling estudios requieren típicamente el análisis de la expresión combinada de varios marcadores, el uso de IHC estándar requiere la tinción de múltiples secciones de tejido, cada uno manchado con un marcador único y por lo tanto, sería sustancialmente limitado para el análisis de muestras de tejido pequeñas tales como las biopsias de aguja de núcleo. Estándar métodos IHC también son limitados para la evaluación de marcadores que son coexpressed por poblaciones de diversas células, como sucede con los marcadores de control inmune como PD-L1, que es expresada por macrófagos asociados a tumor y las células cancerosas. Esta limitación se ha divulgado en, por ejemplo, el uso del estándar monoplex IHC por los patólogos para el análisis cuantitativo de un marcador IHC expresado por células diversos tipos6. El desarrollo de técnicas de IHQ cromogénicos múltiplexes empleando diversos cromógenos coloreados en el mismo tejido sección representa un adelanto sobre el método estándar de monoplex IHC,7 aunque siguen siendo limitados por la inmunomarcación de unos pocos marcadores y también presenta un importante desafío técnico para la adecuada evaluación de marcadores expresados en el mismo compartimientos subcelulares de las mismas poblaciones de células.
Las salvedades mencionadas en cuanto a la disponibilidad de tejido de las muestras clínicas, así como las limitaciones de las técnicas de IHQ cromogénicos multiplexores, han dado lugar a la necesidad de desarrollar mejores métodos multiplexores para estudios de inmuno-Oncología etiquetado fluorescente combinado con sistemas que efectivamente pueden separar las señales de múltiples fluoróforos de la misma diapositiva de imágenes. Una tal técnica se basa en la amplificación de la señal de la tyramide (TSA) combinada con la proyección de imagen multiespectral de la microscopia de color eficiente separación8. Un kit disponible comercialmente basados en TSA emplea fluoróforos optimizado para imágenes multiespectrales8 (véase Tabla de materiales). Una ventaja fundamental de este sistema es su compatibilidad con los mismos anticuerpos primarios sin etiqueta que ya validadas y optimizadas para el estándar cromogénico IHC9,10,11. Esto permite no sólo la optimización más rápida sino también la flexibilidad en las optimización y el panel de modificaciones incorporando nuevos objetivos. Además, el método TSA multiplex inmunofluorescencia (mIF) puede ser optimizado para comercios IHC stainer sistemas automatizados, lo que permite una transferencia sencilla de monoplex IHC cromogénico a FOMIN.
Aquí presentamos un protocolo para un panel de FOMIN para estudios de inmuno-Oncología basada en automatizado FOMIN TSA tinción y utiliza un escáner multiespectral para la proyección de imagen. Este protocolo puede ser adaptado y modificado por cualquier usuario con acceso a la instrumentación descrita y reactivos de laboratorio. El protocolo incluye un panel de seis anticuerpos primarios para la immunoprofiling de los carcinomas: PD-L1, PD-1, CD68 (como un marcador de pan-macrófago), CD8 (células T-citotóxicas), Ki-67 y AE1/AE3 (cacerola-cytokeratin, utilizado como marcador epitelial para la identificación de células del carcinoma). Un estudio reciente describe la optimización de un protocolo de FOMIN TSA manual utilizando IHC cromogénico como referencia estándar para validar el múltiplex tinción12. El método actualizado presentado aquí ha sido desarrollado por con el equipo de TSA comercialmente disponible, siete colores optimizado en un teñidor automático, drásticamente acortando el tiempo de tinción de 3 – 5 días a 14 h, mejorando también la consistencia de la tinción. Además del protocolo principal detallado presentado aquí, una sección de Materiales complementarios incluye el método de "control de la gota", un proceso de control de calidad adicional para evaluar un nuevo panel de FOMIN, así como notas técnicas para la optimización, solución de problemas y desarrollo de nuevos paneles múltiplexes para ayudar al usuario del laboratorio para configurar y optimizar el método TSA de mIF FOMIN personalizados paneles.

<table><tbody><tr><td>Software "InForm 2.4.2" para la desmezcla espectral y el análisis de imágenes</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS151066</td><td>llamado "software de desmezcla espectral" en el texto</td></tr><tr><td>"Phenochart 1.0.9" Software QPTIFF para la selección de MSI y la visualización general del escaneo de diapositivas</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS151067</td><td>llamado "software QPTIFF" en el texto</td></tr><tr><td>#1.5 Cubreobjetos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2975246</td><td></td></tr><tr><td>Etanol de 200 pruebas</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>20x solución salina tamponada Tris</td><td>VWR</td><td>J640-4L</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente de anticuerpos</td><td>DAKO</td><td>S2203</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD68 Monoclonal</td><td>de ratón DAKO</td><td>M087601-2</td><td>Clon PG-M1</td></tr><tr><td>Anti-CD8 Conejo Monoclonal</td><td>Ventana</td><td>M5392</td><td>Clon SP239</td></tr><tr><td>Anti-CK Monoclonal</td> <td>de ratónDAKO</td><td>M351501-2</td><td>Clon AE1/AE3</td></tr><tr><td>Anti-ki67 Ratón Monoclonal</td><td>DAKO</td><td>M724001-2</td><td>Clon MIB-1</td></tr><tr><td>Anti-PD-1 Conejo Señalización de células monoclonales</td><td></td><td>#86163</td><td>Clon D4W2J</td></tr><tr><td>Anti-PD-L1 Conejo Monoclonal</td><td>Ventana</td><td>790-4905</td><td>Clon SP263</td></tr><tr><td>Bond Dewax Solution</td><td>Leica</td><td>AR9222</td><td>Llamado "solución de desparafinado" en texto</td></tr><tr><td>Solución de recuperación de epítopos de enlace 1</td><td>Leica</td><td>AR9961</td><td>llamada "ER1" en texto</td></tr><tr><td>Solución de recuperación de epítopos de enlace 2</td><td>Leica</td><td>AR9640</td><td>llamada "ER2" en texto</td></tr><tr><td>Contenedores abiertos de enlace, 30 mL</td><td>OP309700 Leica</td><td></td><td>llamados "Contenedores abiertos de 30 mL" en texto</td></tr><tr><td>Contenedores abiertos de bond, 7 mL</td><td>OP79193 Leica</td><td></td><td>llamados "Contenedores abiertos de 7 mL" en el texto</td></tr><tr><td>Bond Polymer Refine Detection</td><td>Leica</td><td>DS9800</td><td>Llamado "kit de detección cromogénica" en el texto</td></tr><tr><td>Bond Kit</td> de detección <td>de investigación Leica</td><td>DS9455</td><td>Llamado "kit de detección de investigación" en el texto</td></tr><tr><td>Kit de valoración de unión</td><td>Leica OPT9049</td><td></td><td>Llamado "kit de valoración" en el texto</td></tr><tr><td>Bond Universal Covertile Novocastra</td><td>Leica</td><td>S21.2001</td><td>Llamado "covertiles" en texto</td></tr><tr><td>Bond Wash Solution 10X Concentrado</td><td>Leica</td><td>AR9590</td><td>Llamado "10x wash solution" en texto</td></tr><tr><td>BondRX Autostainer</td><td>Leica</td><td></td><td>Llamado "tinción automatizado" en texto</td></tr><tr><td>Software BondRX Versión 5.2.1.204</td><td>Leica</td><td></td><td>Llamado "software de tinción automatizado" en texto</td></tr><tr><td>Opal 7-Color Automation IHC Kit</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL801001KT</td><td>Llamado "kit de tinción multiespectral" en el texto</td></tr><tr><td>Bloque de peroxidasa</td><td>Leica</td><td>RE7101</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>Mountant Thermo</td><td>P36965</td><td>Llamado "montaje de diapositivas" en el texto</td></tr><tr><td>Starfrost</td><td>Slides Fisher</td><td>15-183-51</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio multiespectral Vectra Polaris con software "Vectra 3.0.5" para el control de microscopio multiespectral</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS143455</td><td>Llamado "software de control de microscopio" en el texto</td></tr></tbody></table>

panel de inmunofluorescencia multiplex automatizado para estudios de inmuno-oncología en los especímenes del tejido formalina-fijo carcinoma

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

Continua evolución de inmuno-Oncología requiere una mayor comprensión de los mecanismos de la inmunología del cáncer. El análisis immunoprofiling de muestras de tejido de biopsias de formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) se ha convertido en una herramienta clave para entender la complejidad de la inmunología tumoral y descubrimiento de nuevos biomarcadores predictivos para la inmunoterapia del cáncer. Immunoprofiling análisis de los tejidos requiere la evaluación de marcadores combinados, incluyendo las subpoblaciones de células inflamatorias y los puestos de control inmunes en el microambiente del tumor. El advenimiento de métodos inmunohistoquímicos multiplex novela permite un más eficiente Análisis multiparamétrico de secciones del tejido fino solo que hace estándar monoplex immunohistochemistry (IHC). Una inmunofluorescencia múltiplex disponible comercialmente (si) método se basa en la amplificación de la señal tyramide y, combinado con el análisis microscópico multiespectral, permite una mejor separación de señal de diversos marcadores en el tejido. Esta metodología es compatible con el uso de anticuerpos primarios no conjugados que se han optimizado para IHC estándar en las muestras de tejido FFPE. Adjunto describimos detalladamente un protocolo automatizado que permite multiplex si el etiquetado de las muestras de tejido de carcinoma con un panel de anticuerpos multiplex marcador seis compuesto por PD-L1, 1 PD, CD68, CD8, Ki-67 y citoqueratinas AE1/AE3 con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole como una contratinción nuclear de la célula. El protocolo multiplex panel está optimizado en un teñidor automático de IHC para un tiempo de tinción es más corto que el del protocolo manual y directamente aplicado y adaptado por cualquier investigador de laboratorio para estudios de inmuno-Oncología en muestras humanas de tejido FFPE. También se describe son varios controles y herramientas, incluyendo un método de control de gota fina control de calidad de un nuevo panel multiplex de IF, que son útiles para la optimización y validación de la técnica.

El protocolo descrito aquí proporcionará resultados como los mostrados en la figura 2. Comenzar con una evaluación de la tinción en el control de la amígdala, comenzando con el epitelio escamoso superficial. La histología de la muestra de la amígdala puede ser revisada con un patólogo, haciendo referencia a la diapositiva de H &amp; E. Si secciones IHC cromogénicos se realizan con los mismos marcadores en el mismo bloque de tejido, entonces estos pueden utili...

Un protocolo detallado para un panel de inmunofluorescencia multiplex marcador seis es optimizado y realizado, utiliza un teñidor automático para resultados más consistentes y un menor tiempo de procedimiento. Este enfoque puede adaptarse directamente por cualquier laboratorio para estudios de inmuno-Oncología.

Panel de inmunofluorescencia Multiplex automatizado para estudios de inmuno-Oncología en los especímenes del tejido formalina-fijo Carcinoma

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Este protocolo es significativo porque la optimización del desarrollo y la transferencia de protocolos de inmunofluorescencia multiplex es compleja y desafiante. Para muchos laboratorios, la retención de un protocolo optimizado es invaluable. La inmunofluorescencia multiespectral nos permite evaluar tanto la ubicación como la identidad de múltiples tipos celulares dentro y alrededor del tumor.Esta es una poderosa combinación de información en estudios de oncología inmune. El uso más convincente para la inmunofluorescencia multiplex es la oncología inmune. Pero la capacidad de examinar múltiples tipos de células inmunitarias en setu se puede aprovechar en todas las terapias autoinmunes e inflamatorias.Conocer la ubicación y el fenotipo de las células inmunoitarias dentro y alrededor de las células sólidas es a la vez respuestas pronosticas y predecibles a la inmunoterapia específica del tumor. La optimización y validación del protocolo son pasos clave que no se deben apresurar. Los nuevos desarrolladores deben familiarizarse con los nuevos tipos de artefactos asociados con las imágenes multiespectrales.Para localizar el protocolo multiplojo base, precarguelo en la mancha automatizada. Filtrar para all'instead de preferred'en la pantalla de protocolo. Antes de realizar cambios, guarde el protocolo original y haga clic en la pestaña de protocolos y haga clic con el botón derecho en Opal 6 Multiplex para seleccionar la copia.Cambie el nombre a 7 Multiplex Protocol 1'in the new window y seleccione la pestaña asociada con el dispositivo correcto. Coincide con el protocolo en la tabla suplementaria S1'y haga clic en añadir reactivo para agregar un paso de inhibición de paroxidies de diez minutos, seleccionando el inhibidor de la peroxidasa como reactivo. Confirme que los pasos de bloqueo utilizan un tampón de bloqueo del inhibidor de la proteína quinasa, que cada anticuo primario se refiere al reactivo adecuado, que los pasos secundarios del cuerpo anticuaria utilizan un polímero de peroxidasa de rábano picante y que se utiliza el dapi espectral proporcionado con el kit de automatización multiespectral.Asegúrese de que el protocolo contiene el inhibidor de la peroxidasa, seguido de seis manchas secuenciales que contienen cada una un paso de bloqueo de proteínas, un anticuerro primario, un anticuerro secundario, un suelo de tyramida y, a continuación, la recuperación de antígenos para eliminar los anticuos. Para agregar los controles de colocación, copie el 7 Multiplex Protocol 1'name y cámbielo a 7 Multiplex Protocol 1 CD68 Drop. Cambie el reactivo anticuto CD68 a Mouse IgG y guarde el protocolo.A continuación, cree seis protocolos nuevos más, uno para cada control de colocación y otro para el control de tipo iso completo de la misma manera. Haga un protocolo de control de caídas para cada objetivo de la misma manera que le he mostrado aquí. Para preparar un kit de detección de investigación, llene el recipiente abierto de 30 mililitros marcado para solución salina 1X tris-buffered con 1X de solución salina tamponada 1X, y coloque el recipiente en la posición más alejada del mango en el Kit de investigación Multiplex 1.Etiquete dos recipientes abiertos de 30 mililitros de bloque muli-espectral' y secundario multiespectral, y llene el contenedor de bloques mutli-espectrales con 30 mililitros de diluyente de anticuerpos tampón de bloqueo del kit de tinción multiespectral. Llene el recipiente secundario multiespectral con 30 mililitros de polímero de anticuerpos secundarios anti-rabiosos anti-ratón del kit de tinción multiespectral y agregue 600 microlitros de diluyente de anticuerpos a cada uno de los diez contenedores abiertos de 7 mililitros. A continuación, añada el anticuerpo primario concentrado a los tubos apropiados en los volúmenes indicados en la tabla, y mezcle mediante un pipeteo suave.Añadir 3 mililitros de agua doble destilada, más 12 gotas de dapi espectral en un recipiente abierto de 7 mililitros, y 3 mililitros de bloque de peroxidasa en un segundo recipiente abierto de 7 mililitros. Vuelva a suspender cada suelo con talatalizado con 75 microlitros de sulfóxido de dimetil y mezcle por pipeteo. A continuación, guarde las existencias de suelo de amplificación de señal de Tyramida a 4 grados centígrados hasta que estén listas.Mientras se preparan las diluciones individuales del suelo de la TSA. Registre todos los reactivos en la mancha automática, luego coloque cada recipiente en un bastidor de reactivos y cargue todos los reactivos en la trituradora automatizada. El manchador detectará la presencia y confirmará el volumen de cada reactivo.Una vez cargados todos los reactivos, active el protocolo para que se ejecute durante la noche. Al final del procedimiento de tinción, monte las muestras con resbalones de cubierta y cargue las muestras en el escáner de plataforma de imágenes multiespectral para escanear. Una vez escaneadas todas las muestras, las imágenes se formatearán como archivos qptiff.Abra un programa de software de análisis qptiff adecuado y haga clic en load slide'to open a five filter whole slide scan of the slide of interest. Inicie sesión y utilice la herramienta de sello para seleccionar cinco regiones para imágenes multiespectrales. En Seleccionar para:seleccione Adquisición'en Tamaño en campos:seleccione 1x1 y, en Resolución de campo, seleccione 0,5 micrómetros 20x.Basándose en esta tinción de citoqueracina, seleccione varias regiones con tejido tumoral positivo de citoqueracina y tejido estromal negativo de citoqueracina que se debe tomar imágenes de la exploración general. Cuando se hayan seleccionado todas las imágenes espectrales múltiples, cambie al software Vectra y cambie la tarea de scan'a multiespectral imaging'para cada diapositiva. A continuación, haga clic en escanear para realizar la colección de imágenes multiespectral.Cuando se complete la adquisición de imágenes multiespectrales, utilice el software de desmezcla espectral para abrir archivos dentro de la carpeta de imágenes multiespectral. En el formato de imagen'seleccionar multiespectral'Bajo formato de muestra'seleccionar fluorescencia'Y en Origen de la biblioteca espectral'Seleccionar inForm'Para seleccionar los pisos, seleccionar y cargar los seis pisos, y dapi de las diapositivas de la biblioteca de muestra, y haga clic en preparar todo. El software de desmezcla espectral realizará la desmezcla espectral en todas las imágenes abiertas utilizando los perfiles espectrales proporcionados.Identifique y anote el perfil espectral auto fluorescente. Asegúrese de comprobar la función de auto fluorescente para asegurarse de que se captura completamente en el canal auto fluorescente después de la desmezcla y para probar diferentes muestras hasta que se elimina de forma aceptable. A continuación, evalúe el patrón de tinción contra las manchas únicas cromogénicas del mismo objetivo en diapositivas secuenciales del mismo tejido con un patólogo.Para evaluar la intensidad de fluorescencia de cada canal, utilice la herramienta recuentos para examinar las imágenes abiertas. A continuación, vuelva al protocolo de tinción y ajuste la concentración de TSA para abordar los recuentos normalizados que excedan o no alcancen el rango aceptable. En este análisis representativo, el tejido de la amígdala demostró una tinción de citoqueracina claramente definida dentro de la superficie de la amígdala, epitelio escamoso sin fondo en el tejido linfoide con citoqueracina y tinción PDL-1 aparente en el epitelio reticulado de las criptas.Los centros germinales foliculares eran fácilmente reconocibles y ricos en linfocitos positivos Ki-67. Los macrófagos presentes dentro de los centros germinales fueron identificados por su expresión CD-68 con algunos macrófagos también observados fuera del centro germinal. Los linfocitos manchados de CD-8 con una distribución de células T y la expresión PD-1 teñiron fuertemente pequeños linfocitos agrupados en la periferia del centro germinal, así como dispersos por toda la región interfolicular.Después de que se confirmó el patrón de tinción esperado en el control del tejido de las amígdalas, la misma tinción podría evaluarse en una muestra de cáncer de pulmón. También se deben evaluar los controles negativos de isotipo y los controles de caída;no sólo para la detección de fondo y autofluorescencia, sino también para efectos de paraguas y sangrado espectral. Los controles de caída son importantes para evaluar posibles artefactos en la tinción debido al método de inmunofluorescencia multipplex durante la optimización de un nuevo panel multi-plex.Cada control de caída debe mostrar el mismo patrón de tinción que el panel multiplexo completo, excepto para el único anticuerpo primario que debe eliminarse en cada control específico. El perfilado de inmuno con inmunofluorescencia multiespectral permite la estratificación de tumores y regiones por criterios inmunológicos que luego pueden ser investigados por estudios genómicos, transcriptómicos y proteómicos de multiplexor masivo. He utilizado la inmunofluorescencia multiplojo para investigar mecanismos de acción en oncología y trastornos autoinmunes que permite la identificación y caracterización de células inmunitarias y patógenas en una sola sección en setu.Se deben tomar precauciones generales cuando se trabaja con anti-cuerpos contra proteínas humanas, Tyramida y dapi, pero no se sabe que ningún reactivo o material en este protocolo es particularmente peligroso.

automated-multiplex-immunofluorescence-panel-for-immuno-oncology

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Estudio de microambiente tumoral puede identificar biomarcadores pronósticos o predictivos de la respuesta clínica a la inmunoterapia. Presentado aquí, es un método innovador basado en situ de la fluorescencia multiespectral de imágenes para analizar y contar automáticamente varias subpoblaciones de CD8+ T las células. Esta técnica reproducible y confiable es adecuada para análisis de grandes cohortes.

Multiplexado de análisis de la inmunofluorescencia y la cuantificación de Intratumoral PD-1+ + de Tim-3 CD8 células+ T

Aquí se describe un protocolo de immunohistochemical fluorescente multiplex la coloración y la proyección de imagen para la localización simultánea de múltiples antígenos asociados a cáncer de linfoma. Este protocolo puede ampliarse para el análisis de colocalización de marcadores biológicos en todas las secciones de tejido.

La coloración de Immunohistochemical fluorescente multiplexado, por imágenes y análisis en muestras histológicas de linfoma

La inmunohistoquímica fluorescente multiplex es una tecnología emergente que permite la visualización de múltiples tipos de células dentro del tejido integrado en parafina (FFPE) fijo en formalina. Se presentan pautas para asegurar un multiplex de 7 colores exitoso con instrucciones para optimizar anticuerpos y reactivos, preparar diapositivas, diseño y consejos para evitar problemas comunes.

Optimización, diseño y evitamiento de trampas en la inmunohistoquímica fluorescente multiplexación manual

En este artículo, se describe un protocolo para la inmunofluorescencia múltiple (mIF) de amplificación manual de señal de tiramida (TSA) combinada con análisis de imágenes y análisis espacial. Este protocolo se puede utilizar con secciones fijadas en parafina con formalina (FFPE) para la tinción de dos a seis antígenos por portaobjetos, dependiendo del escáner de portaobjetos disponible en el laboratorio.

Inmunofluorescencia múltiple combinada con análisis de imágenes espaciales para la evaluación clínica y biológica del microambiente tumoral

Este protocolo describe en detalle cómo se lleva a cabo la caracterización de las células inmunitarias del microambiente tumoral mediante inmunohistoquímica multiplex.

Análisis inmunohistoquímico multiplex del paisaje espacial de células inmunitarias del microambiente tumoral

Este protocolo experimental describe y optimiza un método de tinción de inmunohistoquímica múltiple (IHQ), principalmente mediante la optimización de las condiciones de incubación de anticuerpos de un solo canal y el ajuste de la configuración de anticuerpos y canales para resolver los problemas de autofluorescencia y diafonía de canales en tejidos de cáncer de pulmón de origen clínico.

Tinción inmunohistoquímica multiplex para tejido de cáncer de pulmón incluido en parafina

La inmunohistoquímica cíclica múltiple permite la detección in situ de múltiples marcadores simultáneamente mediante la incubación repetida antígeno-anticuerpo, el escaneo de imágenes y la alineación e integración de imágenes. En este trabajo se presenta el protocolo operativo para la identificación de sustratos de células inmunitarias con esta tecnología en muestras de cáncer de pulmón y metástasis cerebrales pareadas.

Inmunohistoquímica fluorescente cíclica multiplex

Este informe describe un protocolo automatizado para ensayos de inmunofluorescencia múltiple (mIF) en un tintor de portaobjetos automatizado. Demuestra la alta reproducibilidad de la proteómica espacial en autotinciones tisulares estándar de alto rendimiento y generadores de imágenes de fluorescencia de portaobjetos completos, lo que es ideal para ensayos mIF personalizados en un gran número de portaobjetos de tejido en investigación traslacional.

Ensayos de inmunofluorescencia multiplex automatizados de alto rendimiento para la investigación traslacional

Este protocolo proporciona una guía paso a paso para diseñar un panel de anticuerpos de inmunofluorescencia multiplex para la obtención de imágenes basadas en códigos de barras de ADN de tejidos murinos de melanoma FFPE. También describimos una línea de análisis de imágenes que utiliza herramientas de código abierto para generar información proteómica espacial sobre el microambiente inmunológico del tumor de melanoma murino.

Imágenes de inmunofluorescencia múltiple basadas en códigos de barras de ADN para analizar muestras de FFPE de melanoma murino reprogramado genéticamente

La inmunofluorescencia multiplexada permite el marcado secuencial de múltiples marcadores de anticuerpos dentro de una sola sección tisular para apoyar el análisis espacial de la arquitectura tisular y las poblaciones celulares. Aquí se presenta un flujo de trabajo para la detección multiplex de marcadores estructurales, estructural e inmunitarios asociados a la senescencia, que incluye preparación manual y automatizada de portaobjetos, imágenes iterativas y análisis de células individuales...

Ensayo de inmunofluorescencia multiplexado para la evaluación espacial de marcadores de senescencia in vivo

Aprende un panel de inmunofluorescencia multiplex automatizado de seis marcadores para estudios de inmuno-oncología en tejido fijado en formalina. Este protocolo optimizado permite evaluar múltiples tipos de células inmunes en tumores con resultados consistentes.

Panel de inmunofluorescencia Multiplex automatizado para estudios de inmuno-Oncología en los especímenes del tejido formalina-fijo Carcinoma (Video) | JoVE Journal

Panel de inmunofluorescencia Multiplex automatizado para estudios de inmuno-Oncología en los especímenes del tejido formalina-fijo Carcinoma

Explorar más videos