Identificación, caracterización histológica y disección de ratón próstata lóbulos para modelos In Vitro esferoide 3D cultura

Este método puede ayudar en el inicio de modelos de ratón genéticamente diseñados de cáncer de próstata y la investigación del mecanismo de cáncer de próstata a través de análisis in vivo e in vitro. La principal ventaja de esta técnica es que permite un análisis completo del modelo de ratón de cáncer de próstata, desde la disección de tejido hasta el aislamiento celular y el cultivo. Después de exponer el sistema urogenital, o UGS, agarre firmemente la vejiga urinaria con fórceps contundentes medios y levante todo el sistema desde el abdomen del ratón.

Deslice un par de tijeras debajo de la vejiga y la próstata hasta la columna vertebral para hacer una incisión a través de la médula espinal, y corte a través de las conexiones restantes a la cavidad abdominal para permitir la extracción de todo el UGS. Transfiera el UGS a un plato Petri de seis centímetros que contenga de dos a seis mililitros de PBS bajo un microscopio diseccionante. Y usa un par de fórceps finos y tijeras de microdisección para eliminar cuidadosamente toda la grasa de los lados dorsal y ventral del sistema tisular sin cortar ningún tejido prostático.

Cuando se haya extraído toda la grasa, tire de la vejiga con los fórceps e insu situes la vejiga en su base. Coloque el lado ventral del tejido restante hacia arriba y sosteniendo un conducto termina con los fórceps, siga el recipiente hasta su base con tijeras e excime el vaso en su base. Retire el mismo vaso en el otro lado e inserte los fórceps entre las vesículas seminales y la próstata para permitir el recorte de cualquier tejido conectivo adyacente según sea necesario.

A continuación, trace las vesículas seminales hasta su base en la uretra y retire los vasos sin perforarlos. Cuando ambas vesículas hayan sido removidas, coloque el lado dorsal del tejido hacia arriba para que los lóbulos dorsales que se asemejan a las alas de una mariposa sean visibles. Sosteniendo cada lóbulo dorsal con fórceps, corte el tejido en su base con tijeras para recoger los lóbulos dorsales y gire el tejido hacia el lado ventral.

Recoger los lóbulos laterales, que son pequeños y generalmente envuelven la uretra en el lado y se atatan entre los lóbulos anterior, ventral y dorsal de la misma manera. Recoger los lóbulos ventrales, que son más grandes que los lóbulos laterales y se encuentran en la uretra ventralmente. Luego corta y desecha la uretra para cosechar los lóbulos anteriores.

Para procesar el tejido prostático para el cultivo 3D, transfiera los lóbulos a un plato de 10 centímetros que contenga de dos a tres mililitros de DMEM, y use un bisturí para picar los túbulos de próstata de la forma más fina y uniforme posible. Transfiera los fragmentos de tejido a una capucha de cultivo de tejido estéril y agregue la solución de tejido a un nuevo tubo de 15 mililitros. Lleve el volumen en el tubo hasta nueve mililitros con medio fresco, y agregue un mililitro de solución de stock de colagenasa TenX a la mezcla de tejido.

Después del vórtice, incubar el tubo con agitación durante dos horas a 37 grados Celsius para degradar la matriz extracelular. Al final de la incubación, recoger el tejido por centrifugación y volver a suspender el pellet en dos mililitros de tiras cálidas del 05% en EDTA. Después de cinco minutos de 37 grados Celsius para facilitar el corte de las adherencias de celda a célula y de celda a matriz, utilice un cabezal P1000 con una punta de tablero ancha para triturar el tejido de ocho a 10 veces para romper cualquier grumos.

Repita la disociación con una punta de cabezal P200. A continuación, neutralizar la trippsina con tres mililitros de medio completo. Mezclar 500 unidades de DNASE1 en la suspensión de tejido y pasar la solución de cinco a 10 veces a través de una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 18, seguida de cinco veces a través de una aguja de calibre 20.

Cuando no se visiblen más piezas de tejido grandes, filtre la suspensión a través de un filtro de 40 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros, y recoja las células por centrifugación. Para el enchapado celular y el cultivo, vuelva a suspender el pellet en 0,5 mililitros de medio de crecimiento de células epiteliales de próstata completa, y alude las células a cinco veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración media de crecimiento de células epiteliales de próstata. Mezclar las células con matriz extracelular de membrana del sótano en un volumen de dos a tres de relación de solución, y placar la suspensión celular en el recipiente de cultivo celular experimental apropiado.

Luego coloque las células en una incubadora de cultivo celular durante 30 minutos. Cuando la matriz extracelular se haya solidificado, cubra el cultivo con medio de crecimiento de células epiteliales de próstata completo precalecido, teniendo cuidado de no perturbar el tapón de matriz extracelular de membrana del sótano. Luego devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante cinco a 10 días, actualizando la mitad del medio cada dos o tres días.

Para cosechar esferas, aspirar el medio cuidadosamente sin alterar el tapón de gel de matriz extracelular de membrana del sótano, y añadir un mililitro de solución Disbase para 100 microlitros de matriz extracelular de membrana sótano. Usando un rascador de células, raspe a lo largo de la parte inferior de la placa para levantar los geles extracelulares de membrana del sótano desde la parte inferior de la placa en el sobrenadante, y pipetee toda la solución una vez para romper el tapón en trozos más pequeños. Incubar las piezas de matriz celular adicionales en la incubadora de cultivo celular durante una o dos horas hasta que la matriz extracelular de la membrana del sótano se haya disuelto por completo.

A continuación, transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Y recoger las células por centrifugación para una mayor manipulación aguas abajo. La próstata de ratón se compone de cuatro pares de lóbulos situados dorsal y ventralmente a las vesículas seminales y la uretra.

Los lóbulos prostáticos se componen de múltiples perfiles de la glándula, cada uno compuesto de un lumen, rodeados de células epiteliales secretores. Las formas de los lóbulos, la organización de las células y la naturaleza de la secreción varían de lóbulo a lóbulo. Las células de próstata aisladas comienzan a crecer en organoides tan pronto como cuatro días después del cultivo de matriz extracelular de la membrana del sótano.

Durante los siguientes uno a seis días, la mayoría de las células crecen en esferas sólidas con una fracción de las esferas que exhiben un lumen parcial o completo. Los esferoides también demuestran una fuerte tinción de catenina beta en las uniones de célula a célula que se co-localizan con la tinción de F-actina. Al intentar este procedimiento, es muy importante seguir meticulosamente los pasos de microdisección.

Por ejemplo, aísle los lóbulos prostáticos mientras todavía están unidos a la uretra, para que sepas qué lóbulo es el que se basa en dónde están con respecto a la uretra. Después del procedimiento de disección, los lóbulos aislados se pueden utilizar para el análisis posterior, como la secuenciación de RMA, la hinchazón occidental o la inmunosumanencia. La técnica de cultivo 3D primario le permite obtener más información sobre el mecanismo de cáncer de próstata, ya que puede monitorear la vida con esferoides para cambios de morfología y comportamiento e identificar cualquier cambio neoplásico en el mismo.

En resumen, esta disección de próstata y métodos de cultivo pueden ser incorporados a varias aplicaciones posteriores para proporcionar información valiosa para investigar el mecanismo del cáncer de próstata utilizando modelos de ratón genéticamente diseñados.