Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

La secuenciación de ARN de una sola célula es una poderosa herramienta para estudiar los perfiles transcripcionales de las células, particularmente en el tejido heterogéneo, como el sistema nervioso central. Este protocolo proporciona un método para aislar núcleos para la secuenciación de ARN de un solo núcleo. Mediante el uso de núcleos en lugar de células, este método se puede aplicar a los tejidos difíciles de disociar, así como al tejido congelado.

Además, este método se puede aplicar para estudiar los cambios específicos del tipo de células en las células después de la enfermedad o lesión. Comience este procedimiento con la eutanasia del ratón, como se describe en el protocolo de texto. A continuación, haga una incisión a lo largo de la longitud del cuerpo para exponer los órganos internos.

Eviscerar al ratón tirando de los órganos internos de la cavidad del cuerpo usando fórceps. No utilice toallas de papel para limpiar la zona o para eliminar órganos, ya que esto puede introducir contaminantes. Usando tijeras, corte la columna vertebral entre las vértebras espinales L2 y L3.

Para expulsar la médula espinal, coloque una jeringa de tres mililitros que contenga PBS helado con una aguja de 25 calibres de 1/4 de pulgada. Coloque la punta de la aguja en el extremo sacro de la columna vertebral. Use dos dedos para pellizcar las vértebras para crear un sello hermético alrededor de la punta de la aguja, y presione hacia abajo en el émbolo para expulsar la médula espinal rostralmente.

Coloque la médula espinal en una placa de Petri con PBS helada. Si solo se requiere la parte lumbar de la médula, recorte las porciones sacra y torácica de la médula espinal. En este punto, congelar el tejido y almacenar a menos 80 grados Celsius, o utilizar inmediatamente para la lisis de células mecánicas detergentes como se describe aquí, o la lisis mecánica hipotónica como se describe en el protocolo de texto.

Para determinar la lelisis de células mecánicas detergentes, coloque la médula espinal lumbar en un homogeneizador Dounce preenfriado y agregue 500 microlitros de tampón de lelisis detergente preenfriado. Dounce con cinco golpes del peste suelto, A, y luego cinco a 10 golpes del peste apretado, B.Evitar levantar el homogeneizador fuera de la solución de lisis entre golpes, y evitar la introducción de burbujas. Ahora, coloque un colador de 40 micras sobre un tubo cónico pre-enfriado de 50 mililitros y pre-mojado con un mililitro de tampón de sacarosa baja.

Agregue un mililitro de tampón de sacarosa baja al homogeneizador Dounce que contiene los núcleos crudos en el tampón de lelisis, y mezcle suavemente pipeteando de dos a tres veces. Pasar la preparación de núcleos crudos sobre el colador de 40 micras, en el tubo cónico pre-enfriado de 50 mililitros. Pase un búfer de sacarosa baja adicional de un mililitro sobre el colador de 40 micras, con lo que el volumen final a tres mililitros del búfer de sacarosa baja y 500 microlitros del búfer de lisis.

Repita estos pasos si combina varios cables, enfriando en el mismo tubo cónico. Luego, centrifuga la muestra a 3200 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez completada la centrifugación, decantar el sobrenadante.

Suspendemos la paleta usando tres mililitros de tampón de sacarosa baja. Revuelva suavemente para retirar el pellet de la pared para facilitar la resuspensión. Después de dejar que la muestra se siente en hielo durante dos minutos, transfiera la suspensión a un tubo Oak Ridge.

Usando el homogeneizador en el ajuste uno, homogeneizar los núcleos en tampón de sacarosa baja durante 15 a 30 segundos, manteniendo la muestra sobre hielo. A continuación, utilice una pipeta serológica para poner en capas 12,5 mililitros de tampón de sacarosa de densidad, debajo del búfer de sacarosa baja homogeneizar, teniendo cuidado de no crear una burbuja que interrumpa las capas de densidad. Centrifugar los tubos a 3200 veces G, durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

Una vez completada la centrifugación, decanta inmediatamente el sobrenadante en un movimiento de parpadeo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar retirar inmediatamente el tubo Oak Ridge de la centrífuga, y decantar rápidamente el sobrenadante. Usando 100 microlitros a un mililitro de solución de resuspensión, suspendemos los núcleos restantes en la pared.

Evite el ceño fruncido de mielina que queda con la preparación a base de detergente. Si no se realizan estos pasos rápidamente, se puede producir una preparación de núcleos con exceso de residuos celulares, o mielina, que puede impedir la secuenciación de ARN de un solo núcleo aguas abajo. Filtrar los núcleos a través de un colador de 30 a 35 micras tamaño de poro y recoger en un tubo pre-refrigerado.

Determinar el rendimiento de los núcleos, utilizando un hemocitoómetro para contar núcleos bajo un objetivo de 10 x, antes de proceder a la secuenciación de ARN de un solo núcleo, como se describe en el protocolo de texto. El campo brillante y las imágenes epifluorescentes de núcleos, aislados mediante el protocolo de lisis mecánica detergente, se muestran a 10 x. Estos núcleos están aislados de manera imparcial, lo que permite el estudio de perfiles de expresión génica endógenos a nivel de una sola célula.

Aquí se muestra una gráfica tSNE representativa de la secuenciación de ARN de un solo núcleo, a partir de una médula espinal lumbar de ratón, utilizando una plataforma de encapsulación de gotas masivamente paralela. Los núcleos aislados de tejido fresco o congelado se pueden utilizar para la secuenciación en plataformas comerciales y académicas. Esta técnica permite a los investigadores explorar perfiles transcripcionales a nivel de una sola célula, utilizando tejidos difíciles de disociar, como la médula espinal, o incluso tejido congelado, como el material biobanco.

Al intentar este procedimiento, es importante reducir la cantidad de tiempo entre la eutanasia y la lelisis celular. Además, es importante minimizar las burbujas introducidas en las soluciones desde la lelisis celular hasta la resuspensión, y comprar núcleos de mascotas con cuidado. Siguiendo este procedimiento, los núcleos se pueden utilizar para aplicaciones alternativas, como la clasificación de facs, con el fin de aislar tipos de celdas específicos.