Name: Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprende a aislar núcleos de médula espinal de ratón para secuenciación de ARN masivamente paralela. Este método permite analizar perfiles de expresión génica en tejidos difíciles de disociar y muestras congeladas.

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Este trabajo fue financiado por el programa intramuros de NINDS (1 ZIA NS003153 02) y NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Agradecemos a L. Li y C.I. Dobrott por su apoyo técnico y discusiones útiles y C. Kathe para revisar el manuscrito.

Todos los trabajos de animales se realizan según un protocolo aprobado por el Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y movimiento Animal cuidado y uso. Equilibrado de las muestras de hombres y mujeres ICR/CD-1 tipo salvaje ratones, entre 8 y 12 semanas viejo, fueron utilizados para todos los experimentos. Ratones deben ser manejados con arreglo a directrices institucionales Animal Care y Comité de uso locales.
1. preparación de materiales y Buffers
<ol><li>Preparar todos los búferes del día de uso y enfriado previamente en hielo (ver tabla 1).<ol>
<li>Si utiliza detergente industrial lisis, preparar el tampón de lisis detergente (> 500 μL por muestra), buffer de sacarosa bajo (> 6 mL por muestra), buffer de densidad de sacarosa (> 12,5 mL por muestra) y la solución de resuspensión (> 1 mL).</li>
		<li>Si utiliza lisis hipotónica-mecánica, preparar el tampón de lisis hipotónica (> 5 mL por muestra), medio HEB (> 5 mL por muestra), buffer sucrosa bajo (> 3 mL por muestra), buffer de densidad de sacarosa (> 12,5 mL por muestra) y la solución de resuspensión (> 1 mL).</li>
		<li>Añadir 25 μL de Ditiotreitol (DTT) otro 25 μL de la TDT a 25 mL de la solución de gradiente de densidad de sacarosa y 25 mL de la solución de sacarosa baja justo antes de iniciar el protocolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cubrir la superficie de disección con papel de aluminio para minimizar la contaminación de la muestra con las fibras de papel toallas o protectores de banco, que pueden obstruir microfluídicos canales utilizados para la captura de núcleos individuales.</li>
	<li>Rocíe la herramientas de disección y espacio del Banco con una solución de descontaminación de Rnasa. Además, rocíe el interior del tubo de Homogeneizadores Dounce (si está usando la lisis celular de detergente-mecánica) y Oak Ridge tubo con una solución de descontaminación de Rnasa. Enjuague el tubo con agua ultrapura, libre de ARNasa Dounce y Oak Ridge.</li>
	<li>Enfriar previamente todos los tubos (50 mL cónico, roble Ridge) y tubos de Homogeneizadores Dounce en hielo.</li>
	<li>Fuego polaco una serie de Pipetas Pasteur (si está usando lisis hipotónica mecánica celular).</li>
</ol>2. preparación de la médula espinal
<ol><li>Si se utiliza tejido fresco, eutanasia el ratón por la inhalación de CO2 . Después de eutanasia, rocíe la capa del ratón con etanol al 70% para minimizar la contaminación del cabello en la muestra.</li>
	<li>Decapitar el ratón con tijeras quirúrgicas agudos, libre de ARNasa. A continuación, levantando suavemente los abdominales la piel con pinzas y hacer una incisión a lo largo de la longitud del cuerpo para exponer los órganos internos.</li>
	<li>Desentrañan el ratón tirando de los órganos internos de la cavidad del cuerpo con unas pinzas. No use toallas de papel para limpiar el área o a quitar órganos, esto puede introducir contaminantes. Con unas tijeras, cortar la columna vertebral entre las vértebras L2 y L3 de la columna. Nota: Con la práctica, este paso se logra en menos de 30 segundos.<ol>
<li>Para expulsar la médula espinal, colocar una jeringa de 3 mL con PBS helado con una aguja de 25 G 1/4 pulgada. Coloque la punta de la aguja en el extremo sacro de la columna vertebral. Use dos dedos para pellizcar las vértebras para crear un sello hermético alrededor de la punta de la aguja y presione el émbolo para expulsar la médula rostral. Lugar la médula espinal en una placa de Petri con PBS helado.</li>
		<li>En este punto, congelar el tejido y conservarlo a-80 ° C o utilizar inmediatamente para detergente-mecánica (paso 3) o lisis de hipotónica-mecánica (paso 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si usando tejido congelado, mantener el tejido en hielo seco, proceder a detergente-mecánica (paso 3) o lisis de hipotónica-mecánica (paso 4).</li>
</ol>3. lisis de la célula detergente industrial
<ol><li>Lugar de la médula espinal lumbar en un homogeneizador de Dounce previamente enfriado y añadir 500 mL previamente enfriada tampón de lisis detergente. Nota: Una médula espinal lumbar de ratón es 325,5 mg ± mg 63,9 error estándar de la media (SEM, N = 4). 50 mg-1.5 g de tejido se puede utilizar con éxito.</li>
	<li>Dounce con 5 golpes de mortero de una (Maja 'flojo'), luego 5 a 10 golpes de mortero B ('tight' Maja). Evite levantar el homogenizador de la solución de lisis entre trazos y evitar la introducción de burbujas.</li>
	<li>Coloque un filtro de 40 mm sobre un tubo cónico de 50 mL previamente enfriada y prewet con 1 mL de tampón de sacarosa bajo.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tampón baja sacarosa al Dounce homogeneizador que contiene los núcleos crudos en el buffer de lisis y suavemente mezclar mediante pipeteo de 2 – 3 veces.</li>
	<li>Pasar la preparación de núcleos crudo sobre el tamiz de 40 mm en el tubo cónico de 50 mL previamente enfriada.</li>
	<li>Traspasar un adicional 1 mL de tampón de sacarosa bajo el tamiz de 40 mm, que el volumen final de 3 mL de la solución de sacarosa baja y 500 mL de la solución de lisis.</li>
	<li>Repita los pasos 3.1-3.6 Si la combinación de múltiples cables, puesta en común en el mismo tubo cónico.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 3.200 x g por 10 min a 4 ° C. Una vez finalizada la centrifugación, decantar el sobrenadante. Proceda al paso 5.</li>
</ol>4 lisis celular hipotónica-mecánico
<ol><li>Lugar de la médula espinal lumbar en 5 mL de la solución de lisis hipotónica en un plato de cultivo de tejidos. Usar el extremo despuntado de tijeras primavera atraviesan la médula espinal, luego usar primavera tijeras para cortar el cable en trozos de 3 – 4 mm, pero no pique. Nota: 50 mg a 1,5 g de tejido puede ser utilizado con éxito.</li>
	<li>Incubar en hielo por 15 min, Remolino 2 – 3 veces.</li>
	<li>Añadir 5 mL de medio HEB para diluir el buffer de lisis hipotónica.</li>
	<li>Triturate el tejido 10 veces con una pipeta serológica de 5 mL o hasta que todas las piezas del tejido mover suavemente a través de la abertura de la pipeta.</li>
	<li>Triturate con una serie de tres pipetas de Pasteur fuego pulido con diámetros progresivamente más estrechos (~ 900-600 mm).<ol>
<li>Para cada pipeta triturate 5 - 15 veces, permite el tejido colocar, quitar 1 – 2 mL del sobrenadante que contiene núcleos disociados y pasar por un tamiz de 40 mm en un tubo cónico de 50 mL previamente enfriada.</li>
		<li>Después de trituración con la pipeta Pasteur más pequeño tamaño, asegúrese de que el homogeneizado fluye suavemente a través de la punta de la pipeta. Pase la solución restante sobre el tamiz de 40 mm en el tubo cónico de 50 mL. Nota: El número total de trituraciones se puede ajustar como desee. Las meninges de la médula espinal de ratón serán siendo, pero es importante triturate cualquier trozos visibles de médula espinal. Pase el homogeneizado quedan sobre el tamiz de 40 m. Evitar la introducción de burbujas durante la trituración.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugue la muestra filtrada a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C. Una vez finalizada la centrifugación, decante y descarte el sobrenadante. Proceda al paso 5.</li>
</ol>5. homogeneización y gradiente de densidad de sacarosa
<ol><li>Después de paso 3 o 4, Resuspender el precipitado con 3 mL de solución de sacarosa bajo. Agitar suavemente para eliminar el sedimento de la pared para facilitar la resuspensión. Deje que la muestra se sientan en hielo durante 2 minutos y transferir la suspensión a un tubo de Oak Ridge.</li>
	<li>Con el homogeneizador en posición 1, homogeneizar los núcleos en tampón baja sacarosa durante 15 – 30 s., manteniendo la muestra en hielo. Nota: Utilice 15 s si usa uno medular lumbar o 30 s si agruparon muestras o una médula espinal entera.</li>
	<li>Utilizando una pipeta serológica, capa 12,5 mL de solución de sacarosa de densidad debajo el homogeneizado de buffer sucrosa bajo, teniendo cuidado de no para crear una burbuja que altera las capas de densidad.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 3.200 x g por 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Una vez finalizada la centrifugación, inmediatamente decante el sobrenadante en un movimiento de cajón. Nota: Un volumen residual (menos de 400 mL) de tampón de sacarosa se puede desechar si se desea producir un volumen más bajo y el limpiador de la muestra final, pero este volumen residual contienen núcleos y puede ser conservado para maximizar el rendimiento de los núcleos.</li>
	<li>Utilizando 100 mL - 1 mL de solución de resuspensión, resuspender los núcleos restantes en la pared. Evitar la mielina 'entrecejo' que sigue con la preparación base de detergente.</li>
	<li>Los núcleos del filtro a través de un filtro de tamaño de poro de 30 – 35 mm y recoger en un tubo previamente enfriado.</li>
	<li>Determinar los núcleos rendimiento utilizando un hemocitómetro para contar núcleos bajo un objetivo de X 10. Nota: Puede añadirse azul de tripano para visualizar núcleos, que deben aparecer en azul. Tenga en cuenta la cantidad de detritos celulares.</li>
	<li>Proceda al paso 6 o 7.</li>
</ol>6. masivamente paralelo secuenciación del snRNA: plataforma académica7
<ol><li>Realizar la secuenciación masivamente paralela snRNA (p. ej., gota-Seq) método como se ha descrito7 con las siguientes modificaciones:4<ol>
<li>Ajustar los núcleos a una concentración final de 225 núcleos por mL.</li>
		<li>Preparar cuentas con código de barras en una concentración de 250 granos por mL.</li>
		<li>Preparar el tampón de lisis con sarkosyl de 0,7%.</li>
		<li>Ajustar las tasas de flujo a 35 mL / min para granos, 35 mL por minuto por núcleos y 200 mL por minuto de aceite.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. masivamente paralelo secuenciación del snRNA: plataforma comercial26
<ol><li>SnRNA-secuenciación masivamente paralela utilizando la plataforma comercial (p. ej., cromo única célula Gene expresión solución) de realizar productos de acuerdo de las instrucciones del fabricante de la26 con la siguiente modificación:<ol>
<li>Tras reverso-transcripción, añadir un ciclo PCR adicionales a la cantidad calculada de ciclos para la amplificación del cDNA basado en la recuperación de la célula objetivo para compensar la disminución del cDNA de los núcleos en comparación con las células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
<li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
<li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li>
<li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967(2016).</li>
<li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li>
<li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells%2C+monocytes%2C+and+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li>
<li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022(2016).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/110/49/19802.short">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li>
<li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
<li>10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018).</li>
<li>10X Genomics. <a target="_blank" href="https://www.salk.edu/wp-content/uploads/2017/11/10XUserGuide.pdf">Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide</a>. , (2018).</li>
<li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/12/25/239749">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Div-Seq%3A+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li>
</ol>

No tenemos conflictos de interés que revelar.

El objetivo final de este protocolo es aislar a los núcleos que contienen RNA de alta calidad para posteriores análisis transcripcional. Adaptamos métodos snRNA-Seq para Perfil de todos los tipos de células en la médula espinal. Inicialmente, se encontró que célula típica disociación métodos eran ineficaces para secuenciación unicelular RNA, como las neuronas de la médula espinal son especialmente vulnerables a la muerte celular. Además, métodos de disociación celular inducen la expresión de varios genes de la respuesta ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 &#956;L pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 &#956;L of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 &#956;L) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 &#956;L - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were&#160;updated from:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.</li>
</ol>
to:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per &#956;L.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per &#956;L.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 &#956;L per min for beads, 35 &#956;L per min for nuclei, and 200 &#956;L per min for oil.</li>
</ol>

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Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

El sistema nervioso se compone de grupos heterogéneos de células que muestran una gran variedad de propiedades morfológicas, bioquímicas y electrofisiológicas. Mientras que la secuencia de RNA a granel ha sido útil para determinar cambios de todo el tejido en la expresión de genes en diferentes condiciones, excluye la detección de cambios transcripcionales a nivel unicelular. Los avances recientes en el análisis transcripcional unicelulares han permitido la clasificación de las células heterogéneas en grupos funcionales basados en su repertorio molecular e incluso se pueden aprovechar para detectar grupos de neuronas que habían sido recientemente activas. 1 , 2 , 3 , 4 en los últimos diez años, el desarrollo de RNA de la célula única secuenciación (scRNA-Seq) ha permitido el estudio de la expresión génica en células individuales, proporcionando una visión en la diversidad de tipo de la célula. 5
La aparición de métodos escalables como tratamiento masivo en paralelo scRNA-Seq, ha proporcionado plataformas para tejidos heterogéneos de la secuencia, incluyendo muchas regiones del sistema nervioso central. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 sin embargo, métodos de disociación celular solo pueden llevar a la muerte celular así como los cambios experimentales en la expresión génica. 16 trabajo reciente ha adaptado métodos de secuenciación de unicelular para preservación de perfiles transcripcionales endógenos. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 estas estrategias han sido particularmente convenientes para la detección inmediata temprana expresión del gen (IEG) después de estímulo sensorial o comportamiento. 3 , 4 en el futuro, esta estrategia podría también ser utilizada para estudiar los cambios dinámicos en los tejidos en Estados de enfermedad o en respuesta al estrés. De estos métodos, la secuencia solo núcleo RNA (snRNA-Seq) es un enfoque prometedor que implican estrés induce la disociación celular y puede ser utilizado en difícil de disociar del tejido (por ejemplo, la médula espinal), así como congelado tejido. 4 , 17 , 18 , 19 adaptado de los métodos de aislamiento de los núcleos anteriores,20,21,22,23,25 snRNA-Seq típicamente utiliza el celular y la interrupción de tejido rápido lisis en condiciones de frío, centrifugación y separación de los núcleos de la ruina celular. 4 núcleos pueden ser aislados para la secuenciación de próxima generación descendente en múltiples plataformas de encapsulación de gotita de microfluidos. 4 , 7 , 24 , 25 este método permite una instantánea de la actividad transcripcional de miles de células en un momento en el tiempo.
Existen múltiples estrategias para la liberación de los núcleos de las células antes de aislamiento y secuencia, cada uno con sus ventajas y desventajas. Aquí, describimos y comparar dos protocolos para permitir el aislamiento de los núcleos de la médula espinal adulta para el tratamiento masivo en paralelo abajo snRNA-Seq: lisis mecánica detergente y lisis hipotónica-mecánica. Lisis de detergente-mecánica proporciona la interrupción completa del tejido y un mayor rendimiento final de los núcleos. Mecánica-lisis hipotónica incluyen un grado controlable de disrupción del tejido, proporcionando una oportunidad para la selección de un equilibrio entre la cantidad y la pureza de la producción nuclear final. Estos enfoques proporcionan rendimiento comparable de RNA detectado un número de genes por núcleo y mediante perfiles tipo de la célula y también pueden tanto ser utilizados con éxito para snRNA-SS.

<table><tbody><tr><td></td><td>Sacarosa Invitrogen</td><td>15503-022</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgAc</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td><td>Corning</td><td>MT-46034CI</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td>Añadir DTT justo antes</td></tr><tr><td>de usar Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>Crystalgen</td><td>221-238-10</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7,4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Crystalgen</td><td>221-133-10</td><td></td></tr><tr><td>0.04% BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>0.2 U/ &mu; L Inhibidor de ARNasa</td><td>Lucigen</td><td>30281-1</td><td></td></tr><tr><td>Oak Ridge Tubo de centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>Desechable Algodón Tapón de Borosilicato-Vidrio Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>Glass Tissue Dounce (2 mL)</td><td>Kimble</td><td>885303-002</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio gran espacio libre</td><td>Majble</td><td>Kimble 885301-0002</td><td></td></tr><tr><td>Mortero de vidrio Kimble</td><td></td><td>885302-002</td><td></td></tr><tr><td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogeneizador</td><td>IKA</td><td>3737001</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de dispersión (S 10 N &ndash; 5G)</td><td>IKA</td><td>3304000</td><td></td></tr><tr><td>Tinte azul de tripán (0.4%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m colador de celdas</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers, 30 &mu; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos</td><td>Denville Scientific</td><td>1000799</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004505</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F15-6 x 100y Rotor de ángulo fijo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas estereológicas: 5 mL, 10 mL</td><td>Denville Scientific</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Daigger Scientific EF16034F</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemgenes Barcoding Beads</td><td>Chemgenes</td><td>Macosko-2011-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Solución de descontaminación de RNasa</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubo de ensayo con tapa de filtro de células (35 &mu; m)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>120262</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3' Kit de bolas de biblioteca y gel v2, 4 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>120267</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td><td>10X Genomics Plato de</td> cultivo de <td></td><td></td></tr><tr><td>tejidos (60 mm x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo arn

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Sondeo de genes de una célula individual permite la identificación del tipo celular y el estado de la célula. La secuencia de RNA unicelular ha surgido como una poderosa herramienta para el estudio de perfiles transcripcionales de las células, particularmente en tejidos heterogéneos tales como el sistema nervioso central. Sin embargo, métodos de disociación para la secuencia de la célula pueden conducir a cambios experimentales en la gene expresión y muerte celular. Además, estos métodos están generalmente restringidos a tejido fresco, limitando así los estudios sobre archivos y material bio-Banco. Solo núcleo RNA secuencia (snRNA-Seq) es una alternativa atractiva para estudios transcripcionales, dado que precisamente identifica tipos de la célula, permite el estudio de los tejidos congelados o difícil de disociar, y reduce la disociación inducida transcripción. Aquí, presentamos un protocolo de alto rendimiento para el aislamiento rápido de núcleos para abajo snRNA-SS. Este método permite el aislamiento de los núcleos de las muestras frescas o congeladas de la médula espinal y puede combinarse con dos plataformas de encapsulación de gota masiva y en paralelo.

Aquí, realizamos aislamiento de núcleos de la médula espinal lumbar ratón adulto para la descendente secuencia de RNA masivamente paralela. El protocolo participan tres componentes principales: tejido celular e interrupción lisis, homogeneización y sacarosa densidad centrifugación (figura 1). En cuestión de segundos la lisis mecánica de detergente rindió una preparación cruda de núcleos con un gran número de núcleos, así como desechos celulares y del tejido (...

Aquí, presentamos un protocolo para aislar rápidamente a núcleos de alta calidad del tejido fresco o congelado para la descendente secuencia de RNA masivamente paralelo. Nos incluyen tejido detergente-mecánica y de mecánica hipotónica interrupción y célula opciones de lisis, que pueden utilizarse para el aislamiento de los núcleos.

Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

La secuenciación de ARN de una sola célula es una poderosa herramienta para estudiar los perfiles transcripcionales de las células, particularmente en el tejido heterogéneo, como el sistema nervioso central. Este protocolo proporciona un método para aislar núcleos para la secuenciación de ARN de un solo núcleo. Mediante el uso de núcleos en lugar de células, este método se puede aplicar a los tejidos difíciles de disociar, así como al tejido congelado.Además, este método se puede aplicar para estudiar los cambios específicos del tipo de células en las células después de la enfermedad o lesión. Comience este procedimiento con la eutanasia del ratón, como se describe en el protocolo de texto. A continuación, haga una incisión a lo largo de la longitud del cuerpo para exponer los órganos internos.Eviscerar al ratón tirando de los órganos internos de la cavidad del cuerpo usando fórceps. No utilice toallas de papel para limpiar la zona o para eliminar órganos, ya que esto puede introducir contaminantes. Usando tijeras, corte la columna vertebral entre las vértebras espinales L2 y L3.Para expulsar la médula espinal, coloque una jeringa de tres mililitros que contenga PBS helado con una aguja de 25 calibres de 1/4 de pulgada. Coloque la punta de la aguja en el extremo sacro de la columna vertebral. Use dos dedos para pellizcar las vértebras para crear un sello hermético alrededor de la punta de la aguja, y presione hacia abajo en el émbolo para expulsar la médula espinal rostralmente.Coloque la médula espinal en una placa de Petri con PBS helada. Si solo se requiere la parte lumbar de la médula, recorte las porciones sacra y torácica de la médula espinal. En este punto, congelar el tejido y almacenar a menos 80 grados Celsius, o utilizar inmediatamente para la lisis de células mecánicas detergentes como se describe aquí, o la lisis mecánica hipotónica como se describe en el protocolo de texto.Para determinar la lelisis de células mecánicas detergentes, coloque la médula espinal lumbar en un homogeneizador Dounce preenfriado y agregue 500 microlitros de tampón de lelisis detergente preenfriado. Dounce con cinco golpes del peste suelto, A, y luego cinco a 10 golpes del peste apretado, B.Evitar levantar el homogeneizador fuera de la solución de lisis entre golpes, y evitar la introducción de burbujas. Ahora, coloque un colador de 40 micras sobre un tubo cónico pre-enfriado de 50 mililitros y pre-mojado con un mililitro de tampón de sacarosa baja.Agregue un mililitro de tampón de sacarosa baja al homogeneizador Dounce que contiene los núcleos crudos en el tampón de lelisis, y mezcle suavemente pipeteando de dos a tres veces. Pasar la preparación de núcleos crudos sobre el colador de 40 micras, en el tubo cónico pre-enfriado de 50 mililitros. Pase un búfer de sacarosa baja adicional de un mililitro sobre el colador de 40 micras, con lo que el volumen final a tres mililitros del búfer de sacarosa baja y 500 microlitros del búfer de lisis.Repita estos pasos si combina varios cables, enfriando en el mismo tubo cónico. Luego, centrifuga la muestra a 3200 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez completada la centrifugación, decantar el sobrenadante.Suspendemos la paleta usando tres mililitros de tampón de sacarosa baja. Revuelva suavemente para retirar el pellet de la pared para facilitar la resuspensión. Después de dejar que la muestra se siente en hielo durante dos minutos, transfiera la suspensión a un tubo Oak Ridge.Usando el homogeneizador en el ajuste uno, homogeneizar los núcleos en tampón de sacarosa baja durante 15 a 30 segundos, manteniendo la muestra sobre hielo. A continuación, utilice una pipeta serológica para poner en capas 12,5 mililitros de tampón de sacarosa de densidad, debajo del búfer de sacarosa baja homogeneizar, teniendo cuidado de no crear una burbuja que interrumpa las capas de densidad. Centrifugar los tubos a 3200 veces G, durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.Una vez completada la centrifugación, decanta inmediatamente el sobrenadante en un movimiento de parpadeo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar retirar inmediatamente el tubo Oak Ridge de la centrífuga, y decantar rápidamente el sobrenadante. Usando 100 microlitros a un mililitro de solución de resuspensión, suspendemos los núcleos restantes en la pared.Evite el ceño fruncido de mielina que queda con la preparación a base de detergente. Si no se realizan estos pasos rápidamente, se puede producir una preparación de núcleos con exceso de residuos celulares, o mielina, que puede impedir la secuenciación de ARN de un solo núcleo aguas abajo. Filtrar los núcleos a través de un colador de 30 a 35 micras tamaño de poro y recoger en un tubo pre-refrigerado.Determinar el rendimiento de los núcleos, utilizando un hemocitoómetro para contar núcleos bajo un objetivo de 10 x, antes de proceder a la secuenciación de ARN de un solo núcleo, como se describe en el protocolo de texto. El campo brillante y las imágenes epifluorescentes de núcleos, aislados mediante el protocolo de lisis mecánica detergente, se muestran a 10 x. Estos núcleos están aislados de manera imparcial, lo que permite el estudio de perfiles de expresión génica endógenos a nivel de una sola célula.Aquí se muestra una gráfica tSNE representativa de la secuenciación de ARN de un solo núcleo, a partir de una médula espinal lumbar de ratón, utilizando una plataforma de encapsulación de gotas masivamente paralela. Los núcleos aislados de tejido fresco o congelado se pueden utilizar para la secuenciación en plataformas comerciales y académicas. Esta técnica permite a los investigadores explorar perfiles transcripcionales a nivel de una sola célula, utilizando tejidos difíciles de disociar, como la médula espinal, o incluso tejido congelado, como el material biobanco.Al intentar este procedimiento, es importante reducir la cantidad de tiempo entre la eutanasia y la lelisis celular. Además, es importante minimizar las burbujas introducidas en las soluciones desde la lelisis celular hasta la resuspensión, y comprar núcleos de mascotas con cuidado. Siguiendo este procedimiento, los núcleos se pueden utilizar para aplicaciones alternativas, como la clasificación de facs, con el fin de aislar tipos de celdas específicos.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

Esta publicación describe un protocolo para el aislamiento de núcleos de adipocitos maduros, purificación por clasificación activada por fluorescencia y transcriptómica a nivel de una sola célula.

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo para aplicaciones genómicas de una sola célula

El aislamiento de núcleos individuales se basa en la disociación y la permeabilización basada en detergente de la membrana celular, pasos que necesitan optimización y son propensos a introducir artefactos técnicos. Demostramos un protocolo libre de detergente y enzimas para el aislamiento rápido de núcleos intactos directamente de todo el tejido, produciendo núcleos adecuados para ARN-seq de un solo núcleo (snRNA-Seq) o ATAC-seq.

Aislamiento de núcleos de tejido entero utilizando un método de detergente y libre de enzimas

La heterogeneidad intramoral es una característica inherente de los tumores, incluidos los gliomas. Desarrollamos un protocolo simple y eficiente que utiliza una combinación de tampones y centrifugación por gradiente para aislar núcleos individuales de tejidos de glioma frescos congelados para estudios de secuenciación de ARN de núcleo único y ATAC.

Aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para RNA-seq de un solo núcleo y ATAC-seq

Aquí, presentamos un protocolo para aislar núcleos de alta calidad de riñones de ratones congelados que mejoran la representación de los tipos de células renales medulares y evitan los artefactos de expresión génica de la disociación enzimática del tejido.

Aislamiento de núcleos de riñón de ratón adulto para secuenciación de ARN de un solo núcleo

Este protocolo describe la preparación detallada de muestras de bajo aporte para la secuenciación de un solo núcleo, incluida la disección de ganglios cervicales y estrellados superiores de ratón, disociación celular, criopreservación, aislamiento de núcleos y código de barras hashtag.

Aislamiento y multiplexación de núcleos de baja entrada con anticuerpos con códigos de barras de ganglios simpáticos de ratón para la secuenciación de ARN de un solo núcleo

Aquí, presentamos un protocolo para aislar núcleos de tejidos hepáticos archivados congelados por flash para RNA-seq de núcleo único, ATAC-seq y multiómica articular (RNA-seq y ATAC-seq).

Aislamiento de núcleos de tejido hepático congelado rápidamente para multiómica unicelular

Aquí, presentamos un protocolo que describe la preparación de los núcleos celulares. Después de la microdisección y la disociación enzimática del tejido cardíaco en células individuales, las células progenitoras se congelaron, seguidas del aislamiento de células viables puras, que se utilizaron para la secuenciación de ARN de un solo núcleo y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con análisis de secuenciación de alto rendimiento.

Aislamiento de núcleos de células progenitoras cardíacas de ratón para epigenoma y perfil de expresión génica a resolución de una sola célula

El estudio describe un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para aislar núcleos de alta calidad de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación posterior de ARN de núcleos individuales.

Un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para el aislamiento de núcleos individuales de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación de núcleos únicos

El protocolo proporciona un enfoque fiable y optimizado para el aislamiento de núcleos de muestras de tumores sólidos para la secuenciación multioma utilizando la plataforma 10x Genomics, que incluye recomendaciones para las condiciones de disociación de tejidos, la criopreservación de suspensiones unicelulares y la evaluación de núcleos aislados.

Aislamiento optimizado de núcleos a partir de muestras de tumores sólidos frescos y congelados para la secuenciación multioma

La biología del tejido adiposo intermuscular (IMAT) está en gran parte inexplorada debido a la limitada accesibilidad del tejido humano. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de núcleos y la preparación de bibliotecas de IMAT humano congelado para la secuenciación de ARN de núcleos individuales para identificar la composición celular de este depósito adiposo único.

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo intermuscular humano y secuenciación de ARN de núcleos individuales posteriores

Aprende a aislar núcleos de médula espinal de ratón para secuenciación de ARN masivamente paralela. Este método permite analizar perfiles de expresión génica en tejidos difíciles de disociar y muestras congeladas.

Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

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