Name: Purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa Diethylaminoethyl columnas) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Aprende a purificar tripanosomas africanos de sangre usando columnas de intercambiador de aniones DEAE-celulosa. Este método mejora el diagnóstico de la enfermedad del sueño y proporciona parásitos viables para investigaciones inmunológicas y moleculares.

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Agradecemos a todos los miembros de la UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Esta investigación fue apoyada por el financiamiento interno de la Universidad de Burdeos y el apoyo de la ANR, la empresa LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 y de la Asociación pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale y el servicio de Service de Coopération et d ' action culturelle de l ' Ambassade de France à Bangui (Centroafricana).

Las investigaciones conforman a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NIH Publication no. 85±23, revisado 1996). Protocolos fueron aprobados por el Comité de ética local.
1. los animales
<ol><li>Mantener los ratones femeninos de Suiza (de-1) de edad de ocho a diez semanas, 20-25 g, en un animal vivienda instalaciones quince días antes de cada experimento. Casa en cajas ventiladas que se mantienen en una protegida, temperatura (22 ° C) y humedad (50%) control de habitación, con 12 horas ciclo de luz de encendido/apagado.</li>
	<li>Dar animales libre acceso a alimentos y agua. Minimizar el dolor, el sufrimiento y el malestar y proporcionar enriquecimiento del medio ambiente.</li>
	<li>Para la cubierta, use jaulas paredes claro, enriquecimiento con palillos de madera y cartón túneles. Suavemente dibuja un animal en un túnel para transferir de la jaula a la palma de la mano.</li>
	<li>Realizar seguimiento diario para evaluar signos de postración, aislamiento social, lesión del cuerpo, cabello rizado o falta de aseo personal.</li>
	<li>Pesar cada animal una vez por semana. Realizar inspecciones regulares por un veterinario.</li>
	<li>Para los parásitos naturales, recoja la sangre en el pico de parasitemia y de parásitos, causando la muerte de animales, recolección de sangre el día antes de la muerte presunta. Nota: Todos los experimentos con agentes infecciosos se realizan en salas dedicadas, según las directrices de la Universidad aprobada.</li>
</ol>2. tampones, preparación de medios de comunicación
<ol><li>Pesar cada sustancia y añadir agua destilada para los siguientes topes:<ol>
<li>Preparación concentrada solución salina tamponada con fosfato (2 x): Na2HPO4 (anhidro) (MW 141,96 g) 10,14 g NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,62 g NaCl (MW 58,44 g) 2,55 g Agua destilada H2O a 1 L</li>
		<li>Preparar el tampón fosfato salino-glucosa: Na2HPO4 (anhidro) (MW 141,96 g) g 5,39 NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,31 g NaCl (MW 58,44 g) 1,70 g Glucosa (MW 180 g) 10 g Agua destilada H2O a 1 L</li>
		<li>Preparar 1 M KH2PO4.</li>
		<li>Preparar el tampón de elución: Suplemento con tampón fosfato salino-glucosa con Penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL) y rojo de fenol (5 μg/mL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparación de la DEAE-celulosa
<ol><li>Plan de unas 5 horas para la preparación de DEAE-celulosa.</li>
	<li>Lavar 100 g de DEAE-celulosa con agua destilada en un matraz con un cuello estrecho y dejar asentarse y partículas finas. Repita los lavados hasta que el sobrenadante esté claro.</li>
	<li>Añada 3 L de concentrado 2 x Phosphate-Buffered salina y mezclar.</li>
	<li>Ajustar el pH a 8.0 con 1 M de KH2PO4 y descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Lavar dos veces con agua destilada y dejar de instalarse.</li>
	<li>Lave y deje que doble con 3 litros Phosphate-Buffered solución salina y glucosa y descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Medir el volumen de la celulosa y añadir un volumen igual de solución salina de Phosphate-Buffered-glucosa, distribuir en botellas de plástico y almacenar a-20 ° C.</li>
</ol>4. parásitos
<ol><li>Recoger las cepas de Trypanosoma en áreas endémicas para la tripanosomiasis humana y animal. Mantener parásitos congelados en nitrógeno líquido. Nota: Trypanosoma musculi no patógeno a los seres humanos y es un Tripanosoma extracelular utilizado para reemplazar con seguridad tripanosomas patógenos en varios experimentos de laboratorio.</li>
	<li>En el caso de las investigaciones del laboratorio que requieren los patógenos humanos, manejar experimentos con cuidado en las condiciones de riesgo biológico apropiado dedicado seguridad nivel (BSL) y precauciones; BSL2 para T. b. gambiense y BSL3 de T. b. rhodesiense. En condiciones de campo, prácticas microbiológicas estándar se establecieron: garantizar muestreo, pipeteado mecánico, frecuentes descontaminación de superficies y esterilización de los residuos.</li>
</ol>5. infección de ratón
<ol><li>Descongelar rápidamente parásitos en un baño de agua a 37 ° C.</li>
	<li>Observar una gota de sangre infectada descongelada con un microscopio. Midiendo el porcentaje de formas móviles17evaluar la viabilidad del parásito.</li>
	<li>Inyectar parásitos por vía intraperitoneal en ratones (0,5 mL por ratón). Cada día post-infección, recoger 20 μl de sangre de la cola por punción de la aguja y observar bajo un microscopio. Evaluar parasitemia según Herbert y Lumsden18 conteo de parásitos en varios campos de microscopio, o usando un hemocitómetro.</li>
	<li>Cuando la parasitemia alcanza un umbral que se define para cada cepa, recoger la sangre (1 mL/ratón) en el tampón de elución (5 mL/ratón) que contiene heparina (10 U/mL). Nota: El trabajo original y novedoso de Lanham y Godfrey divulgado que la fuerza óptima iónica de fosfato tampón salina glucosa para varias especies de huésped/parásito de una solución madre a pH 8.0.</li>
</ol>6. separación parásito
Nota: Todos los experimentos de aquí en adelante deben realizarse en una campana de cultivo de tejidos con guantes. La temperatura y la humedad en los laboratorios utilizados fueron de 22 ° C y 45% respectivamente. En condiciones de campo, separación del parásito se ha realizado con éxito en 34 ° C.
<ol><li>Colocar una jeringa de 10 mL en un soporte vertical y añadir una circular previamente cortada, pedazo de papel de filtro, lana de vidrio o esponja de celulosa.</li>
	<li>Vierta el DEAE celulosa en la jeringa hasta que el nivel de 8 mL es alcanzado y luego lavar con 25 mL de tampón de elución.</li>
	<li>Cuidadosamente añadir 2 mL de sangre diluida en la parte superior de la columna y añadir medio de elución. Regularmente añadir tampón de elución según el tránsito de los tripanosomas.</li>
	<li>Recoge gotas de efluentes de las columnas en un tubo de centrífuga y comprobar regularmente la presencia de parásitos con un microscopio.</li>
	<li>Cuando ya no se detectan parásitos en el efluente de la columna, centrifugar el tubo (1.800 x g, 10 minutos, a 4 ° C en el laboratorio y en la temperatura ambiente en condiciones de campo).</li>
	<li>Quite el sobrenadante y suspender los parásitos en 1 mL del medio relevante necesario para el siguiente paso de la investigación.</li>
	<li>Contar los parásitos con un hemocitómetro y les diluya en medio apropiado si es necesario.</li>
</ol>

<ol><li>Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).</li>
<li>Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).</li>
<li>Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+animal+trypanosomiases+and+their+chemotherapy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review.</a> Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).</li>
<li>Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis+control%3A+Achievements+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454(2017).</li>
<li>Büscher, P., Deborggraeve, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+molecular+diagnostics+contribute+to+the+elimination+of+human+African+trypanosomiasis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).</li>
<li>Truc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+human+infections+by+animal+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Atypical human infections by animal trypanosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256(2013).</li>
<li>Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei%3A+miniature+anion-exchange+centrifugation+technique+for+detection+of+low+parasitaemias%3A+adaptation+for+field+use%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).</li>
<li>Büscher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Models+of+Mini+Anion+Exchange+Centrifugation+Technique+%28mAECT%29+and+Modified+Single+Centrifugation+%28MSC%29+for+sleeping+sickness+diagnosis+and+staging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471(2009).</li>
<li>Lanham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+trypanosomes+from+the+blood+of+infected+rats+and+mice+by+anion-exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers.</a> Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).</li>
<li>Lanham, S. M., Godfrey, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+salivarian+trypanosomes+from+man+and+other+mammals+using+DEAE-cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose.</a> Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).</li>
<li>Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+trypanosomes+in+vivo%2C+host+body+weight+gains%2C+and+food+consumption+in+zinc-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice.</a> Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).</li>
<li>Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+C57BL%2F6+mice+by+Trypanosoma+musculi+modulates+host+immune+responses+during+Brucella+abortus+cocolonization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization.</a> Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).</li>
<li>Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antibody+classes+and+Fc+receptors+responsible+for+phagocytosis+of+Trypanosoma+musculi+by+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages.</a> Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).</li>
<li>Vincendeau, P., Daëron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+musculi+co-express+several+receptors+binding+rodent+IgM%2C+IgE%2C+and+IgG+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses.</a> Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).</li>
<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+pathogenicity+patterns+of+Trypanosoma+bruceigambiense+field+isolates+in+experimentally+infected+mouse%3A+differences+in+host+immune+response+modulation+by+secretome+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infections%22%5BJournal%5D)">Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics.</a> Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).</li>
<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+parasites+and+their+excreted-secreted+factors+modulate+the+inducible+metabolism+of+L-arginine+in+macrophages%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?</a> Frontiers in Immunology. 9, 778(2018).</li>
<li>Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+cytotoxicity+against+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi.</a> Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).</li>
<li>Herbert, W. J., Lumsden, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei%3A+a+rapid+%26%2334%3Bmatching%26%2334%3B+method+for+estimating+the+host%27s+parasitemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei: a rapid &#34;matching&#34; method for estimating the host's parasitemia.</a> Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).</li>
<li>Dauchy, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+CYP51%3A+Essentiality+and+Targeting+Therapy+in+an+Experimental+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125(2016).</li>
<li>Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Alamar+Blue+assay+to+determine+drug+sensitivity+of+African+trypanosomes+%28T.+b.+rhodesiense+and+T.+b.+gambiense%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro.</a> Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).</li>
<li>Albright, J. W., Albright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+of+Trypanosoma+musculi+in+cell-free+medium+conditioned+by+rodent+macrophages+and+mercaptoethanol%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol.</a> International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).</li>
<li>Gobert, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Arginine+availability+modulates+local+nitric+oxide+production+and+parasite+killing+in+experimental+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis.</a> Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).</li>
<li>De Muylder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Trypanosoma+brucei+kinesin+heavy+chain+promotes+parasite+growth+by+triggering+host+arginase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731(2013).</li>
<li>Nzoumbou-Boko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+musculi+Infection+in+Mice+Critically+Relies+on+Mannose+Receptor-Mediated+Arginase+Induction+by+a+TbKHC1+Kinesin+H+Chain+Homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).</li>
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<li>Albisetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+flagellar+pocket+collar+and+the+hook+complex+via+a+novel+microtubule-binding+protein+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei.</a> PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710(2017).</li>
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<li>Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+methods+of+preparation+on+the+infectivity%2C+agglutination%2C+activity%2C+and+ultrastructure+of+bloodstream+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes.</a> Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).</li>
<li>Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+blood+and+intracellular+forms+of+Trypanosoma+cruzi+from+rats+and+other+rodents+and+preliminary+studies+of+their+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism.</a> Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).</li>
<li>Cruz-Saavedra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Trypanosoma+cruzi+metacyclic+trypomastigotes+by+ion+exchange+chromatography+in+sepharose-DEAE%2C+a+novel+methodology+for+host-pathogen+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies.</a> Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).</li>
<li>Lemesre, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+protection+against+canine+visceral+leishmaniasis+using+the+LiESAp-MDP+vaccine+in+endemic+areas+of+France%3A+double-blind+randomised+efficacy+field+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial.</a> Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Tripanosomas purificadas representan un medio poderoso para estudiar Inmunología, bioquímica, biología celular y molecular. Grandes extensiones de datos y resultados se han obtenido de tripanosomas, que luego ha ayudado a obtener información de otras células eucariotas30. Tripanosomas son también el tema de investigación importante e interesante porque han ideado numerosos mecanismos que les permiten sobrevivir y crecer en dos ambientes muy diferentes: el vector de la mosca tsetsé y el del huésped...

El método se describe aquí permite la separación de tripanosomas, parásitos responsables de tripanosomiasis africana humana y animal (HAT), de la sangre. Este es el mejor método para el diagnóstico de la primera etapa sombrero y además este método de purificación del parásito permite sólida investigación serológica y la investigación.
SOMBRERO es causado por la mosca tsetsé transmitidos Trypanosoma brucei gambiense y T. b. rhodesiense1. Estos parásitos protozoarios se multiplican extracelularmente en el torrente sanguíneo, linfa y líquidos intersticiales durante la primera etapa de la enfermedad (etapa hemolinfáticos). La segunda etapa (etapa meningoencephalitic) comienza cuando parásitos cruzan la barrera hematoencefálica; signos neurológicos, incluyendo un trastorno del sueño, que ha dado su nombre "enfermedad del sueño" a esta enfermedad, son típicas de esta segunda etapa2. Relacionados con tripanosomas (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) son los agentes causativos de animal Tripanosomosis Africana (AAT)3.
La Organización Mundial de la salud (OMS) tiene como objetivo eliminar el sombrero como un problema de salud pública de aquí a 2020 y detener la transmisión por 20304. La reciente introducción de pruebas de diagnóstico rápido tiene mejor diagnóstico serológico1,4,5. Se han desarrollado varias pruebas diagnóstico moleculares, pero su papel en el diagnóstico de campo aún no ha sido establecido5. Se utilizan para identificar las sub-especies del grupo brucei y tripanosomiasis anormal causada por parásitos responsables de la Tripanosomosis animal6.
La detección del parásito es esencial para el diagnóstico, tratamiento y seguimiento, como la serología puede dar resultados falsos positivos y por desgracia falsos negativos1. La observación microscópica directa de estos protistas hemoflagelados es difícil en los casos de sombrero que son causados por T. b. gambiense, (más de 95% de los casos) como bajas parasitemias son la regla, considerando que para sombrero causada por T. b. rhodesiense, una gran número de parásitos está con frecuencia presente en la sangre. Se han utilizado varias técnicas de concentración, como la gota gruesa y centrifugación del tubo capilar (CTC), pero la separación de los parásitos de la sangre por una columna de Intercambiador aniónico (DEAE celulosa) seguido por centrifugación y observación microscópica de la pellet, es el método más sensible (alrededor de 50 parásitos/mL de sangre puede detectarse)1,7. En consecuencia, la purificación de tripanosomas por este método de intercambiadores de aniones (DEAE celulosa) es el mejor y hasta la fecha, el método de referencia para visualizar y aislar parásitos de la sangre para el diagnóstico de sombrero. En condiciones de campo, una pequeña columna de DEAE celulosa se ha utilizado con éxito y varias mejoras han facilitado la observación microscópica7,8.
El método de separación de tripanosoma de sangre, que se describe a continuación, depende de la carga superficial del parásito, que es menos negativo que el mamífero células de sangre9. Curiosamente, este método fue desarrollado hace 50 años, en 1968 por el Dr. Sheila Lanham y sigue siendo el estándar de oro para la detección y preparación de tripanosomas de la sangre. Es rápido y reproducible para tripanosomas salivarian de una amplia gama de mamíferos, permitiendo el diagnóstico de ambos de tripanosomiasis animal y humana10.
Para obtener vida, purificados de parásitos, sangre infectada se agrega en una columna de intercambiador de aniones. Condiciones de cromatografía (principalmente pH, fuerza iónica de tampones y medios) tienen que adaptarse a cada especie de Tripanosoma y más generalmente, para cada mezcla de mamíferas células de sangre y tripanosomas10. Tampón de elución es precisamente ajustado a pH 8 por tripanosomas africanos más10. Este método favorece la concentración de parásitos que se encuentran en la sangre de los pacientes, porque parasitemias pueden ser demasiado bajos para ser detectados por observación microscópica solamente, y también permite que las investigaciones del laboratorio. Trabajar con tripanosomas recién aislados y en la sangre de animales infectados, usando esta técnica, es más pertinente para las diversas investigaciones que estudios con parásitos que han sido cultivadas en condiciones axénicos en el laboratorio durante un período indefinido.
Las relaciones huésped-parásito se estudian mejor con un parásito que infecta a su huésped natural, por lo tanto, T. musculi, un parásito murino natural, que es representante de tripanosomas extracelulares, tiene muchas ventajas como infección murine consiste en un animal de laboratorio pequeño y no requiere condiciones de nivel (BSL) de seguridad de sustancias biopeligrosas. T. musculi no mata a los ratones inmunocompetentes, a diferencia de muchas otras especies de Trypanosoma , incluyendo patógenos humanos. T. musculi no se eliminan en los ratones desprovistos de la célula de T y parasitemias puede ser aumentada en los ratones infectados mediante la modificación de la ingesta de alimentos y nutrientes11. Este parásito modula la respuesta inmune en coinfección con otros patógenos12. T. musculi de ratones infectados exhiben diferencias de cultivo T. musculi, por ejemplo, la expresión de receptores de Fc de la membrana se pierde en cultivos axénicos T. musculi , comparados con parásitos purificados de ratones infectados13 , 14. factores Excreted secretada (FSE) son también cualitativamente y cuantitativamente menos expresada en cultivos axénicos Tripanosoma y difieren entre las cepas aisladas en áreas endémicas15. FSE son los antígenos primera muestra al sistema inmune anfitrión y así juegan un papel importante en la acogida inicial de la respuesta inmune16.
En animales infectados experimentalmente para las investigaciones del laboratorio, este protocolo facilita la experimentación con un mayor número de parásitos, reduciendo al mínimo el número de ratones requerida especialmente cuando se utilizan animales inmunosuprimidos. Las glicoproteínas de superficie variables (VSGs) que se utilizan en la prueba de aglutinación de tarjeta para tripanosomiasis (CATT) en la detección de masas todavía son purificadas de tripanosomas que se propagan en ratas. Las dos pruebas de diagnóstico rápido (cassettes individualmente) que ahora están disponibles para su uso en el campo, siguen utilizando una fuente infecciosa modelo nativa VSGs y no en vitro cultivados tripanosomas1,4, 5. el avance en el estudio de tripanosoma Inmunología y la biología se ha facilitado ya que estos parásitos DEAE celulosa purificada pueden obtenerse fácilmente en grandes cantidades de hosts infectados natural o experimentalmente y en particulares, roedores.

<table><tbody><tr><td>Pipetas de 10 mL&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>357.551</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de 2 mL&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352,507</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrifugación 50 mL</td><td>Centrífuga Falcon</td><td>352,070</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>4K15</td><td></td></tr><tr><td>DEAE celulosa</td><td>Santa Cruz</td><td>s/c- 211213</td><td>100 G</td></tr><tr><td>papel de filtro&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>1,001,125</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de fondo plano cuello estrecho</td><td>Duran</td><td>21 711 76</td><td>6000 mL</td></tr><tr><td>Glucosa&nbsp;</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td>5 000 U</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>120 26936.260</td> Microscopio de <td>500 g</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CH-20</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio</td><td>Thermofisher scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de</td> <td>microscopioThermofisher scientific</td><td>AGAA000001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>100 28026; 260</td><td>500 g</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td>1 KG</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>110 33616; 262</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de medios de plástico Nalgene de 500 g tamaño 125 mL</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0125</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de medios de plástico Nalgene tamaño 500 mL</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0500</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>VWR</td><td>BRND125400</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina 10,000 UI/Estreptomicina 10,000 y micro; g</td><td>EUROBIO</td><td>CABPES01 OU</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Rojo fenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Syringue&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>SS+10S21381</td><td></td></tr><tr><td>Campana de cultivo de tejidos</td><td>Thermoelectro Corporation</td><td>MSC-12</td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei brucei</td><td>Instituto de Medicina Tropical (Amberes, Bélgica).</td><td></td><td>ANTAT 1.1</td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei gambiense</td><td>Instituto de Medicina Tropical (Amberes, Bélgica).</td><td></td><td>ITMAP 1893</td></tr><tr><td>Trypanosoma musculi</td><td>Escuela de Higiene y Medicina Tropical de Londres (Reino Unido)</td><td></td><td>Partinico II</td></tr></tbody></table>

purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa diethylaminoethyl columnas)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Este método permite la separación de tripanosomas, parásitos responsables de tripanosomiasis africana humana y animal (sombrero) de sangre infectada. Este es el mejor método para el diagnóstico de la primera etapa sombrero y además este método de purificación del parásito permite serológica e investigación las investigaciones.
SOMBRERO es causado por la mosca tsetsé transmitidos Trypanosoma brucei gambiense y T. b. rhodesiense. Relacionados con tripanosomas son los agentes causativos de tripanosomiasis animal. Detección de tripanosoma es esencial para el diagnóstico, tratamiento y seguimiento de sombrero. La técnica descrita aquí es la técnica de detección de parásito más sensible, adaptada a condiciones de campo para el diagnóstico de T. b. gambiense sombrero y puede ser completada dentro de una hora. Es capas de sangre sobre una columna de Intercambiador aniónico (DEAE celulosa) previamente ajustada a pH 8, y se añade tampón de elución. Cargadas altamente negativa de las células sanguíneas son adsorbidas en la columna mientras que los tripanosomas menos negativamente cargadas pasan a través. Tripanosomas recogidos son peleteados por centrifugación y observados por microscopia. Por otra parte, parásitos están preparados sin daño celular manteniendo su infectividad.
Tripanosomas purificadas se requiere para las pruebas inmunológicas; se utilizan en el análisis de trypanolysis, el estándar de oro para serología de sombrero. Tinción de parásitos se utilizan en la prueba de aglutinación de la tarjeta (CATT) para serología de campo. Antígenos de tripanosomas purificados, como la glicoproteína variante de superficie, exoantígenos, también se utilizan en diferentes inmunoensayos. El procedimiento descrito aquí está diseñado para tripanosomas africanos; en consecuencia, tienen condiciones de cromatografía para adaptarse a cada cepa de Tripanosoma y más generalmente, a la sangre de cada especie de mamífero anfitrión.
Estos fascinantes patógenos son fácilmente purificada y disponible para usar en Bioquímica, molecular y estudios de la biología incluyendo co-cultivo con células hospedadoras para investigar las relaciones huésped-parásito en el nivel de receptores de membrana, la señalización y el gen de la célula expresión; la droga de prueba in vitro; investigación de canceladura del gene, mutación o sobreexpresión de procesos metabólicos, biogénesis del citoesqueleto y supervivencia del parásito.

Purificada tripanosomas se han utilizado en pruebas farmacéuticas. Parásitos se transfieren en pocillos de cultivo que contiene diluciones seriadas de fármacos específicos, ya sea solo o mezclado19. Observaciones microscópicas, evaluar la motilidad es un marcador de viabilidad, puede realizarse con sólo unas pocas drogas están siendo analizadas, mientras que AlamarBlue análisis de viabilidad de la célula es un excelente método para ensayos de gran motilidad durante...

Este método de separación de tripanosoma de sangre depende de su carga superficial ser menos negativa que mamífero las células de la sangre. Sangre infectada es colocada y tratada en una columna de intercambiador de aniones. Este método, más apropiado diagnóstico de la tripanosomiasis africana, proporciona parásitos purificados para las investigaciones inmunológicas, biológicas, bioquímicas, farmacéutica y biología molecular.

Purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa Diethylaminoethyl columnas)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Los tripanosomos africanos son responsables de la tripanosomiasis africana humana, o la enfermedad del sueño y la tripanosomiasis africana animal. Los tripanosomas que causan la enfermedad del sueño son los parásitos protistas transmitidos por mosca tsetsé presentes en muchos focos geográficos en el Africa subsahariana. La detección del parásito es esencial para el diagnóstico, el tratamiento y el seguimiento.Una serología puede dar resultados falsos positivos y, por desgracia, falsos negativos. Para ayudar a la detección en la sangre, los tripanosomas tienen que ser concentrados. Se han utilizado varias técnicas de concentración de parásitos.El método más sensible es la separación de parásitos de la sangre por una columna de intercambiador de aniones, celulosa DEAE seguida de centrifugación y observación microscópica. En consecuencia, el método de celulosa DEAE es el mejor y sigue siendo hasta la fecha, el método de referencia para visualizar y aislar parásitos de la sangre para el diagnóstico de tripanosomiasis africana humana, especialmente en condiciones de campo. Este método, el diagnóstico más adecuado para la tripanosomiasis africana también proporciona parásitos purificados para investigaciones biológicas inmunológicas, biológicas, bioquímicas, farmacéuticas y moleculares.Todas las investigaciones conformes a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y el acuerdo se han obtenido de las autoridades francesas y todos los protocolos utilizados han sido aprobados por nuestro comité de ética local. Pesar cada sustancia de acuerdo con el protocolo escrito. Añadir agua destilada y ajustar con precisión al pH 8 con fosfato de dihidrógeno potásico para realizar las siguientes soluciones amortiguadas, tampón concentrado de fosfato solución salina 2X.Agregue agua destilada y glucosa para glucosa salina tamponada de fosfato. Para 100 mililitros de tampón de elución, agregue 100 unidades por mililitro de penicilina, 100 microgramos por mililitro de estreptomicina y cinco microgramos mililitro de fenol rojo a fosfato tamponado glucosa salina. 100 gramos de celulosa DEAE primero se lava con tres litros de agua destilada y luego se deja asentar.Las partículas finas se descartan. Los lavados se repiten hasta que el sobrenadante esté despejado. Se añade solución salina tamponada de fosfato concentrado 2X y se agita la celulosa DEAE.El pH se ajusta a ocho con un fosfato de potasio molar. La celulosa se lava dos veces con agua destilada y dos veces con glucosa salina tamponada con fosfato. La glucosa salina tamponada de celulosa y fosfato DEAE se mezcla en volúmenes iguales.Aleación descuartada y almacenada a temperatura ambiente o cuatro grados centígrados o a menos 20 grados centígrados para un almacenamiento prolongado. La sangre infectada por el tripanosoma se almacena en nitrógeno líquido. Un cuarto de aleación de un mililitro se descongela a temperatura ambiente.Los parásitos se recogen cuidadosamente del criotubo con una aguja y una jeringa de un mililitro. La viabilidad de los parásitos descongelados se evalúa mediante la motilidad visualizada por la observación de la microscopía ligera antes de la infección. Los parásitos se inyectan en las cavidades peritoneales de dos ratones, 500 microlitros por ratón.Cada día después de la infección, la parasitemia se evalúa mediante la recolección de una gota de sangre de la cola con una aguja y se comprueba mediante microscopía. Cuando la parasitemia está en un nivel adecuado, se recoge sangre infectada. Una jeringa de 10 mililitros se apoya en una abrazadera o soporte y se añade un pedazo de papel de filtro precortado.La celulosa DEAE preparada se vierte en la jeringa hasta el nivel de ocho o nueve mililitros. La columna se lava con el búfer de elución. Dos mililitros de sangre infectada se colocan cuidadosamente en la parte superior de la columna y los tripanosomas se recogen en la columna eluido en un tubo de centrifugación de 50 mililitros.El búfer de elución se agrega regularmente de acuerdo con el tránsito de los tripanosomas. El tránsito de los tripanosomas a través de la columna se comprueba tomando una gota de columna eluido a intervalos regulares y observando los tripanosomas usando microscopía de luz. Cuando los tripanosomas ya no se observan en el eluido, el tubo cónico se centrifuga a 1.800 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.El sobrenadante se desecha y los tripanosomas en el palet se cuentan con un hemociclomekil. Los tripanosomas recogidos se diluyen posteriormente en el medio requerido para la investigación planificada. Este método, el diagnóstico más adecuado para la tripanosomiasis africana proporciona parásitos purificados para investigaciones biológicas inmunológicas, biológicas, bioquímicas, farmacéuticas y moleculares.Estos estudios se han desarrollado porque los parásitos purificados con celulosa DEAE se pueden obtener fácilmente en grandes cantidades de huéspedes infectados de forma natural o experimental y, en particular, roedores. La viabilidad del tripanosoma en presencia de agentes farmacéuticos se evalúa mediante observación microscópica. La viabilidad del parásito se asocia con la motilidad y, por lo tanto, se puede comprobar a simple vista bajo un microscopio de luz a 40 veces o un aumento mayor.La viabilidad del parásito se evalúa midiendo el porcentaje de formas móviles. Las diluciones de los compuestos de prueba se añaden en cada pocódi de una placa de cultivo de tejido de 96 pozos, mientras que los pozos de control son simulados tratados. Cada concentración se evalúa por triplicado.El número de parásitos viables para cada dilución se compara con el número de parásitos en los pozos de control. Los efectos de Pentamidine, un fármaco de referencia, utilizado en la terapia africana humana de tripanosomiasis se muestra en esta figura. Los co-cultivos de macrófagos de tripanoso permiten la investigación de la interacción del parásito huésped a nivel celular.En los cultivos de parásitos macrófagos, los tripanosomas celulares adicionales inducen la producción de arginasa macrófago que hidroliza la arginina a la ornitina. La ornitina es el precursor de las poliaminas y el tripanothiona, esenciales para la supervivencia y el crecimiento de los parásitos. Además, el agotamiento de la arginina disminuye la producción de óxido nítrico tripanocida.Posteriormente, adición de un inhibidor de la arginasa, S-L-cisteína a los co-cultivos reduce dramáticamente el crecimiento del parásito inducido macrófago. La inducción de la arginasa está mediada por factores excretados o secretados por el tripanosoma. Este factor inductor de arginasa se ha identificado como una quinesina de ortina.La kinesina se une a los receptores de unión a la manosa de lectina de tipo C. La arginasa es inducida y produce ornitina que favorece el crecimiento del parásito. La arginasa no es inducida por la kinesina en macrófagos cultivados con 12,5 manosa milimétrica o en macrófagos de ratones donde se han eliminado los receptores de la manosa macrófago.Otros ejemplos de biología celular y experimentación bioquímica utilizando tripanosomas purificados de celulosa DAEA se muestran en estudios en los que se han identificado nuevas proteínas citoesqueléticas como BILBO1. BILBO1 es necesario para la biogénesis de estructuras citoesqueléticas importantes y la supervivencia de los parásitos. Por lo tanto, BILBO1 representa un objetivo importante para la intervención en los tripanosomas patógenos.En esta figura se muestra una imagen que muestra el etiquetado de inmunoflourescencia de una forma de cultivo del torrente sanguíneo, la célula trypanosoma brucei sondeada con un anticuerpo anti-BILBO1. Además, se han descrito el metabolismo de la glucosa y la troonina utilizando tripanosomas purificados de celulosa DEAE y las enzimas implicadas en estos procesos han sido validadas experimentalmente. Una representación esquemática del metabolismo de la glucosa y la troonina en los tripanosomas formados por el torrente sanguíneo se muestra en esta figura.La purificación de los tripanosomas africanos de la sangre por anión intercambia columnas de celulosa DEAE con mejoras recientes sigue siendo el estándar de oro para la detección de tripanosomas, no sólo en huéspedes naturales con parasitemias bajas en áreas endémicas, sino también para el requisito de parásitos en grandes cantidades para investigaciones experimentales. Las investigaciones han permitido la identificación de moléculas de tripanosoma que desempeñan un papel esencial en la supervivencia y el crecimiento de los parásitos. Los objetivos identificados podrían representar la base de una vacuna futura con antígenos potenciales tanto para humanos como para animales en un único enfoque de salud.

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Purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa Diethylaminoethyl columnas) (Video) | JoVE Journal

Purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa Diethylaminoethyl columnas)

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