Name: Microhemorragias cerebrales aguda inducida por la inyección de lipopolisacáridos en ratas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprende a inducir microhemorragias cerebrales agudas mediante inyección de lipopolisacáridos en ratas Sprague-Dawley. Este protocolo permite estudiar la patogénesis inflamatoria y la integridad de la barrera hematoencefálica.

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Agradecemos a maestro Jian Feng Lei y sus colegas de Universidad médica de Capital para la orientación durante el MRI. También agradecemos a Jing Zeng desde el Departamento de Neurología, Hospital de Yichang la segunda gente para apoyo técnico.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso Comité (ACUC) del Hospital General del ejército del PLA.
1. materiales
<ol><li>Preparación de la inyección de LPS<ol>
<li>Añadir 25 mL de agua destilada a 25 mg de polvo de LPS derivado de S. typhimurium a una concentración final de 1 mg/mL. Guarde la inyección en un tubo estéril a 4 º C. PRECAUCIÓN: LPS es tóxico.</li>
		<li>Preparar una solución EB de 2% en solución salina 0.9% normal para mantener la inyección de EB en la concentración de trabajo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. los animales
<ol><li>Administrar LPS a ratas Sprague-Dawley (SD) macho, de 10 semanas de edad (peso promedio: 280 ± 20 g) por inyección intraperitoneal. PRECAUCIÓN: Si se compran las ratas de otra organización, entonces la fase de adaptación no debe ser menos de 7 días.</li>
</ol>3. LPS inyecciones
<ol><li>Inyectar por vía intraperitoneal LPS en cada rata a dosis de 1 mg/kg y retomar las ratas de su hogar jaula. Nota: La anestesia no es necesaria.</li>
	<li>Seis horas más tarde, inyectar la misma dosis de la inyección de LPS en las ratas.</li>
	<li>Dieciséis horas después inyectar la misma dosis de LPS en las ratas. PRECAUCIÓN: Inyectar ratas SD con LPS en una dosis de 1 mg/kg puede resultar en una tasa de mortalidad de 5%. La tasa de mortalidad podría aumentar aún más en las ratas más jóvenes o mayores o en ratas hembras embarazadas.</li>
	<li>Volver a las ratas a sus jaulas después de la inyección de LPS y proporcionar acceso ad libitum a comida y bebida. Nota: Las ratas exhiben una respuesta inflamatoria sistémica de distinta, y por lo tanto es fundamental que las jaulas permanecen limpias durante todo el experimento. Las ratas debe ser con frecuencia (2 x día) supervisando peso, apariencia general y actitud después de la primera inyección de LPS. Si las ratas comienzan a exhibir una postura jorobada, renuencia a moverse, pérdida de peso significativa (> 20%), porfirina manchas que sean humanamente sacrificados antes del día 7 EB punto de final de estudio.</li>
</ol>4. muestras
<ol><li>Inyección de EB<ol>
<li>Siete días después de la primera inyección, anestesiar la rata por intraperitoneal según su Protocolo aprobado del IACUC.</li>
		<li>Espere 1-2 min hasta que las ratas no muestran respuestas reflejas corneales. Realizar un 5-8 mm-puntura profunda cardiaca en cada rata; el punto de pinchar debe ser 5 mm a la margen izquierda del esternón en el espacio intercostales 3 º y 4 º.</li>
		<li>Espere hasta que se observa la recuperación de sangre y luego inyectar EB en una dosis de 0,2 mL/100 g de peso corporal en el ventrículo izquierdo del corazón. PRECAUCIÓN: Punción cardiaca e inyección de EB deben ser cuidadosamente realizados. EB puede ser inyectada en la cavidad torácica o pericardio en lugar del ventrículo izquierdo del corazón.<ol>
<li>Aspirar con un tubo vacío y reemplazar este volumen con un tubo EB antes de la inyección para ayudar a reducir la tasa de fracaso (por ej., inyección de costillas por error).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mantener la rata en una posición supina durante 10 minutos. Nota: Si la muestra no se utiliza para detectar fugas EB en proyección de imagen de inmunofluorescencia, entonces este paso puede omitirse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observación bruto<ol>
<li>Realizar perfusiones cardiacas usando solución salina helada de 1 M buffer fosfato (PBS) para borrar la vasculatura cerebral y cerebro.<ol>
<li>Usando un bisturí, haga una incisión abdominal a través de toda la longitud del diafragma.</li>
			<li>Corte a través de las costillas justo a la izquierda de la línea media de la caja torácica.</li>
			<li>Abrir la cavidad torácica. Utilice abrazaderas para exponer el corazón y para facilitar el drenaje de la sangre y otros fluidos.</li>
			<li>Manteniendo constantemente el corazón con unas pinzas (el corazón debe aún ser latiendo), directamente insertar una aguja en el saliente del ventrículo izquierdo para extender esto a unos 5 mm. para asegurar la aguja en esa posición de sujeción cerca del punto de entrada. PRECAUCIÓN: No extender excesivamente la aguja, ya que puede perforar la pared interior y comprometer la circulación de soluciones.</li>
			<li>Suelte la válvula para permitir el flujo helado PBS solución de 200 – 300 mL a un ritmo lento y constante en alrededor de 20 mL/min mediante una bomba de perfusión. Si los animales requieren fijación en vez de observación bruto, utiliza la misma dosis de helada solución salina al 0.9%.</li>
			<li>Usando unas tijeras afiladas, haga una incisión en el atrio, asegurando que la solución fluye continuamente. Si el líquido no fluye libremente o proviene de las fosas nasales o la boca del animal, vuelva a colocar la aguja.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pantalla de CMHs por observación bruto. Nota: Si la muestra no se utiliza para calcular el número de CMHs por observación bruto, entonces este paso puede omitirse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fijación<ol>
<li>Realizar perfusiones cardiacas usando helada 0,9% solución salina (200-300 mL) para borrar la vasculatura cerebral y cerebro.</li>
		<li>Realizar perfusiones cardiacas usando helada paraformaldehído al 4% para la fijación.</li>
		<li>Decapitar a la rata, aislar el cerebro y sumergir el cerebro en solución sacarosa al 20% durante al menos 6 h.</li>
		<li>Cambiar la solución en 30% de sacarosa y la solución para otro 6 h.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 10 secciones de tejidos de cerebro mm de espesor con un criostato.</li>
</ol>5. coloración
Nota: Este procedimiento se realiza utilizando un él manchas Kit.
<ol><li>Lave los portaobjetos en agua destilada.</li>
	<li>Mancha en la solución de hematoxilina durante 8 min lavado en agua corriente durante 5 minutos.</li>
	<li>Diferenciar en alcohol ácido 1% para 30 s. lavado en agua corriente durante 1 minuto.</li>
	<li>Mancha en 0.2% en agua y amoníaco (azulado) o carbonato de litio saturado solución para 30 s a 1 min lavado en agua corriente durante 5 minutos.</li>
	<li>Enjuague en alcohol al 95% (10 inmersiones).</li>
	<li>Contratinción con solución de eosina para 30 s a 1 min.</li>
	<li>Deshidratar con alcohol al 95%, dos cambios de alcohol absoluto, durante 5 minutos.</li>
	<li>Claro en el xileno para 30 s.</li>
	<li>Monte con Liu método9.</li>
	<li>Analizar utilizando un microscopio de fluorescencia de campo luminoso. Nota: eritrocitos de los vasos sanguíneos, que son los componentes de CMHs, aparecen en rojo-naranja en él manchas.</li>
</ol>6. azul de Prusia de Perl tinción
Nota: Este procedimiento se realiza utilizando un Kit de tinción de Perls.
<ol><li>Lave el portaobjetos con agua destilada.</li>
	<li>Mancha en la solución de reacción con la mezcla de partes iguales de ferrocianuro y ácido clorhídrico durante 10 minutos.</li>
	<li>Deshidratar, claro, montar y analizar las diapositivas como se describe en pasos 5.7, 5.10.</li>
</ol>7. EB doble coloración
Nota: Este procedimiento sigue paso 4.1.3.
<ol><li>Lave el portaobjetos con PBS 3 veces durante 5 minutos cada.</li>
	<li>Incube los portaobjetos con 4', solución 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar los portaobjetos con solución de PBS tres veces por 5 minutos cada uno y montar el portaobjetos con solución de PBS-glicerol.</li>
	<li>Analizar imágenes en un microscopio de fluorescencia. Deposición de EB se indica mediante fluorescencia roja; núcleos se indican con fluorescencia azul.</li>
</ol>8. MRI-SWI
<ol><li>Realizar MRI en un imán 7-T cuenta con un sistema degradado activamente blindado (16 cm de diámetro interno).</li>
	<li>Siete días después del tratamiento, anestesiar las ratas por inhalación de facemask de isoflurane 1.5 – 2.0% mediante un sistema de anestesia isoflurano.</li>
	<li>Aplique ungüento veterinario en los ojos de la rata para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.</li>
	<li>Mantener a las ratas en posición prona y realizar una exploración de MRI-SWI.</li>
	<li>Obtener análisis de IHQ ponderada utilizando una secuencia de eco de la vuelta rápida usando los siguientes parámetros: tiempo (TE) de eco de 8 ms, repetición tiempo (TR) 40 ms, ángulo del tirón = 12°, campo de visión (FOV) 35 mm × 35 mm, matriz de adquisición 384 × 384, para obtener 1 mm de espesor rebanadas.</li>
	<li>Identificar CMHs en MRI-SWI según Greenberg et al. 11, que incluye los siguientes criterios: (1) un diámetro de ≤10 mm y manchas aisladas, (2) circular y señal de baja intensidad.</li>
	<li>Al final del experimento, eutanasia a las ratas con el método de dióxido de carbono (un flujo de 6 L/min) o 30% del volumen del contenedor de sobredosis.</li>
</ol>

<ol><li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+inflammation-induced+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).</li>
<li>Vernooij, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+risk+factors+of+cerebral+microbleeds+the+Rotterdam+Scan+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study.</a> Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).</li>
<li>Pettersen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbleed+topography%2C+leukoaraiosis%2C+and+cognition+in+probable+Alzheimer+disease+from+the+Sunnybrook+dementia+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study.</a> Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds+and+neuropsychiatric+symptoms+in+an+elderly+Asian+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+iron+quantification+in+collagenase-induced+microbleeds+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).</li>
<li>Reuter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cerebral+microbleeds+in+the+APP23-transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloid+angiopathy-a+9.4+tesla+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).</li>
<li>Scott, L. L., Downing, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neonatal+exposure+to+BMAA+in+a+rat+model+produces+neuropathology+consistent+with+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases.</a> Toxins. 10 (1), E22(2018).</li>
<li>Toth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+hypertension-induced+cerebral+microhemorrhages+in+mice%3A+role+of+resveratrol+treatment+in+vasoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection.</a> Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+H%26E+and+Prussian+blue+staining+in+a+mouse+model+of+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).</li>
<li>Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+subacute+cerebral+microhemorrhages+with+involvement+of+Nitric+Oxide+Synthase+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stroke+and+Cerebrovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats.</a> Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).</li>
<li>Greenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds%3A+A+guide+to+detection+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation.</a> Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).</li>
<li>Hoffmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Field+MRI+reveals+a+drastic+increase+of+hypoxia-induced+microhemorrhages+upon+tissue+reoxygenation+in+the+mouse+brain+with+strong+predominance+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb.</a> Plos One. 11 (2), e0148441(2016).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phosphodiesterase+3A+modulation+on+murine+cerebral+microhemorrhages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+development+of+cerebral+microbleeds+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).</li>
<li>Mello, B. S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+in+behavior+and+brain+inflammatory+and+oxidative+alterations+in+mice+submitted+to+lipopolysaccharide-induced+inflammatory+model+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression.</a> Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).</li>
<li>Souza, D. F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+astroglial+markers+in+a+maternal+immune+activation+model+of+schizophrenia+in+Wistar+rats+are+dependent+on+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).</li>
<li>Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lipopolysaccharide+Parkinson%27s+disease+animal+model%3A+mechanistic+studies+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).</li>
<li>El-Sayed, N. S., Bayan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+role+of+resveratrol+targeting+estradiol+and+neprilysin+pathways+in+lipopolysaccharide+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).</li>
<li>Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+infection+evokes+exaggerated+sickness+behaviour+in+pre-clinical+murine+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease.</a> Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).</li>
<li>Pantoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+small+vessel+disease%3A+from+pathogenesis+and+clinical+characteristics+to+therapeutic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges.</a> Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).</li>
<li>Rosand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+clustering+of+hemorrhages+in+probable+cerebral+amyloid+angiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy.</a> Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li>
<li>Kraft, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+induced+cerebral+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease.</a> Plos One. 12 (8), e0182822(2017).</li>
<li>Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+breakdown+as+the+starting+point+of+cerebral+small+vessel+disease%3F+-+New+insights+from+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Translational+Stroke+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model.</a> Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Estudios sobre las CMHs han aumentado en los últimos años. Sin embargo, el mecanismo de CMHs sigue siendo confuso, lo que los científicos a establecer modelos animales que simulan esta condición particular. Por ejemplo, Hoffmann et al. desarrollado un modelo de ratón de CMHs inducida por la hipoxia que muestra que CMHs son causadas por hipoxia y alteración de la autorregulación cerebrovascular12. Reuter et al. 5 estableció un modelo de CMHs en ratones tran...

Microhemorragias cerebrales clásicas (CMHs) consulte perivascular diminutos depósitos de productos de degradación de la sangre como hemosiderina de glóbulos rojos en el cerebro1. Según el estudio de exploración de Rotterdam, CMHs podían encontrarse en casi el 17,8% de las personas de 60-69 años de edad y 38,3% en los 80 años2. La prevalencia de CMHs en los ancianos es relativamente alta, y una correlación entre la acumulación de CMHs y disfunción cognitiva y neuropsiquiátrica ha establecido3,4. De CMHs en varios modelos animales se han divulgado recientemente, incluyendo modelos de roedores inducidos por tipo colagenasa IV de inyección estereotáctica5, transgénicos APP6, β-N-methylamino-L-alanina exposición7y8de hipertensión, con CMHs inducidas por inflamación sistémica como una de las opciones más bien aceptadas. Fisher et al. 9 utilizado primero LPS derivados de Salmonella typhimurium para desarrollar un modelo de ratón agudo de CMHs. Posteriormente, el mismo grupo informó el desarrollo de un modelo de ratón de CMHs agudo utilizando el mismo enfoque2.
LPS se considera como un estímulo inflamatorio estandarizado mediante inyección intraperitoneal. Estudios previos han confirmado que la inyección de LPS puede causar neuroinflamación tal y como refleja grandes cantidades de microglia y activación de astrositos en animales modelos de2,10. Además, una correlación positiva entre la activación de la activación de la neuroinflamación y el número de CMHs ha sido establecido2,10. Basado en estos estudios previos, nos llevó a desarrollar un modelo de rata de CMHs por inyección intraperitoneal de LPS.
Los avances en la detección de tecnologías han dado lugar a un aumento en el número de trabajos de CMHs. Más ampliamente reconocieron que los métodos de detección de CMHs incluyen la detección de glóbulos rojos por hematoxilina y eosina (HE) tinción, detección de hierro férrico por9, la coloración de azul de Prusia azul de detección de Evans deposición (EB) por inmunofluorescencia imágenes y Tesla 7,0 susceptibilidad resonancia magnética ponderada proyección de imagen (MRI-SWI)10. El presente estudio tiene como objetivo desarrollar un método de detección de CMHs.

<table><tbody><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2630</td><td>para la inducción de la inflamación</td></tr><tr><td>EB</td><td>Sigma-aldrich</td><td>E2129</td><td>para la detección de fugas EB</td></tr><tr><td>DAPI solución de teñido</td><td>Servicbio</td><td>G1012</td><td>medio de recuento para IF</td></tr><tr><td>Perl' s Tinción prusiana</td><td>Solarbio</td><td>G1424</td><td>Kit para tinción prusiana</td></tr><tr><td>Tinción HE</td><td>Solarbio</td><td>G1120</td><td>Kit para tinción HE</td></tr><tr><td>hidrato de cloral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47335U</td><td>Para anestesia</td></tr> solución <tr><td>salina tampón de fosfato (PBS)</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>un tipo de solución tampón comúnmente utilizada en experimentos</td></tr><tr><td>Solución</td> <td>salina al 0,9%Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China</td><td></td><td>solución para la perfusión</td></tr><tr><td>paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>un tipo de solución comúnmente utilizada para la fijación de</td></tr> solución de <tr><td>sacarosa al 20%</td><td>Solarbio</td><td>G2461</td><td>un tipo de solución comúnmente utilizada para la fijación de solución de</td></tr><tr><td>sacarosa al 30%</td><td>Solarbio</td><td>G2460</td><td>un tipo de solución comúnmente utilizada para la fijación</td></tr><tr><td>ungüento veterinario</td><td>Solcoseryl eye gel, Bacel, Suiza</td><td></td><td>para la protección de los ojos de las ratas</td></tr></tbody></table>

microhemorragias cerebrales aguda inducida por la inyección de lipopolisacáridos en ratas

Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats

Microhemorragias cerebrales (CMHs) son comunes en pacientes mayores y están correlacionados con varios trastornos neuropsiquiátricos. La etiología de CMHs es compleja, y neuroinflamación se observa a menudo como una co-ocurrencia. Aquí, describimos una aguda inducido por la inyección de lipopolisacáridos (LPS), así como un método para detectar inyección de CMHs. LPS sistémico del modelo de la rata de CMHs es relativamente simple, económico y rentable. Una ventaja importante de la inyección de LPS es su estabilidad para inducir inflamación. CMHs causadas por la inyección de LPS se podían detectar por observación bruto, hematoxilina y coloración de eosina (HE), Perl prusiano tinción, etiquetado doble de azul de Evans (EB) y la tecnología de imágenes (MRI-SWI) proyección de imagen de resonancia magnética-susceptibilidad ponderada. Por último, otros métodos de desarrollo de modelos animales de CMHs, incluyendo sus ventajas y desventajas, también se discuten en este informe.

CMHs pueden detectarse utilizando diversos enfoques. Los métodos más bien aceptados son los siguientes: (1) bruto observación y evaluación de CMHs superficiales (se muestra en la figura 1, panel superior); (2) la coloración para la detección de células de sangre rojas (se muestra en la figura 2A, panel superior) o prusiano tinción detecta hierro férrico derivaba de lisis de glóbulos rojos (figura 2A,...

Presentamos un protocolo para inducir y detectar CMHs causadas por la inyección de LPS en ratas Sprague-Dawley, que puede ser utilizaron en el futuro las investigaciones de la investigación en la patogenesia de CMHs.

Microhemorragias cerebrales aguda inducida por la inyección de lipopolisacáridos en ratas

Cerebral microhemorrhages (CMHs) are common in aged patients and are correlated to various neuropsychiatric disorders. The etiology of CMHs is complex, ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la micro-hemorragia cerebral, como la etiología, la distribución y la detección de micro-hemorragia cerebral, etc. La principal ventaja de esta técnica es que las inyecciones de LPS inducen inflamación de forma estable. Además, la inyección de LPS es bastante simple, económica y rentable.Aunque este método puede proporcionar información sobre la inducción de hemorragia cerebral, también se puede aplicar a otros trastornos cerebrales como depresión, esquizofrenia, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, y la enfermedad de priones. Administrar LPS a una dosis de un miligramo por kilogramo de peso corporal a ratas Sprague Dawley macho de 10 semanas de edad por inyección intraperitoneal, luego devolver cada rata a la jaula de origen. Repita la inyección de LPS después de seis horas y 16 horas.Tenga en cuenta que la inyección de ratas SD con LPS a una dosis de un miligramo por kilogramo puede dar lugar a una mortalidad del 5%. La mortalidad podría aumentar aún más en ratas más jóvenes o mayores o ratas hembra embarazadas. Devuelva a las ratas a sus jaulas después de la inyección de LPS, y proporcione acceso ad libitum a alimentos y bebidas.Bajo anestesia terminal, realice una punción cardíaca de cinco a ocho milímetros de profundidad en cada rata. El punto de punción debe ser de cinco milímetros al margen izquierdo del esternón en el tercer y cuarto espacio intercostal. Sujete la aguja en su lugar y reemplace el tubo vacío por un tubo que contenga el azul Evans.Espere hasta que se observe la recuperación de sangre, y luego inyecte Evans azul a una dosis de 0,2 mililitros por cada 100 gramos de peso corporal en el ventrículo izquierdo del corazón. Mantenga a la rata en posición supina durante 10 minutos si evalúa la fuga de azul de Evans a través de la barrera hematoencefálica mediante imágenes de inmunofluorescencia. Realizar perfusiones cardíacas utilizando hielo-frío 200 a 300 mililitros de 0.9%solución salina para limpiar la vasculatura cerebral y el cerebro.Cambie a hielo frío 4%paraformaldehído para fijación. Luego, después de aislar el cerebro, sumérgelo en 20%sacarosa en PBS durante al menos seis horas o hasta que el cerebro se hunda en la parte inferior del tubo. Cambie la solución a 30%sucrose y arrójela durante otras seis horas.Finalmente, prepara secciones de tejido cerebral de 10 milímetros de grosor usando un criostato. Lave los portaobjetos con PBS tres veces durante cinco minutos cada uno y luego incubar los portaobjetos con 4, 6'diamidino-2-fenilindole o solución DAPI durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar los portaobjetos en PBS como antes, monte los portaobjetos con solución pbS-glicerol.Captura imágenes en un microscopio de fluorescencia. La deposición EB está indicada por fluorescencia roja, los núcleos están indicados por fluorescencia azul. Comience la tinción de H&E lavando los portaobjetos en agua destilada.A continuación, sumerja en solución de hematoxilina durante ocho minutos. Alternativamente, para la tinción azul prusiana Perl, manchar en la solución de reacción con mezcla de partes iguales de ferrocianuro y ácido clorhídrico durante 10 minutos. Después de la tinción, lavar en agua corriente del grifo durante cinco minutos.Diferenciar en 1% de alcohol ácido durante 30 segundos. Después de lavar en agua corriente del grifo durante un minuto, manche en 0.2%agua de amoníaco o solución saturada de carbonato de litio durante 30 segundos a un minuto. A continuación, lavar en agua corriente del grifo durante cinco minutos.Contramancha con solución de eosina durante 30 segundos a un minuto. Deshidratar a través de 90%alcohol, luego 95%alcohol, y alcohol absoluto durante 0.5 a dos minutos cada uno. Después de la deshidratación, transparente en xileno durante 30 segundos.Después del montaje, analice la tinción H&E con un microscopio de fluorescencia de campo brillante. Los glóbulos rojos liberados de los vasos sanguíneos, que son componentes de las CMH, aparecen en rojo-naranja bajo la tinción de H&E. Las CMH de superficie se pueden detectar mediante la observación bruta, como indican las flechas rojas.La tinción azul de Evans revela fluorescencia roja visible donde las moléculas azules de Evans se filtraban de una barrera hematoencefálica lesionada. La tinción de H&E muestra glóbulos rojos encontrados fuera de los capilares, y la tinción prusiana revela puntos de iones férricos derivados de la lisis de los glóbulos rojos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la dosis de LPS para inducir la micro-hemorragia cerebral es mayor que la utilizada en la enfermedad de Parkinson o modelo de esquizofrenia.Por lo tanto, el medio ambiente de los animales debe mantenerse limpio para reducir la tasa de mortalidad. Después de este procedimiento, se podrían realizar otros métodos como microscopía electrónica, resonancia magnética e imágenes inmunofluorescentes para determinar el daño a la estructura externa de la barrera hematoencefálica en la microb hemorragia cerebral, la distribución de micropermor hemorragias cerebrales en el parénquima cerebral in vivo, así como la activación de células gliales.

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Neurociencia

Hemorragia subaracnoidea aneurismática (HSA) es la hemorragia que se produce en el espacio subaracnoideo cuando un aneurisma se rompe. Mientras que la morbilidad y la mortalidad por este evento ha estado en un declive debido a la mejora de los métodos de tratamiento, el riesgo de vasoespasmo después de la hemorragia subaracnoidea continúa siendo el mismo que era hace unos años. La importancia de establecer un modelo animal completo y reproducible para identificar sucesos iniciadores de...

Una baja mortalidad modelo de rata para evaluar vasoespasmo cerebral retardado tras la hemorragia subaracnoidea experimental

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Inducción de microhemorragias cerebrales en un modelo de rata utilizando lipopolisacárido

Este video muestra un ensayo para detectar microhemorragias cerebrales (CMHs) en un modelo de rata. Las CMH son hemorragias cerebrales debidas a la alteración de la barrera hematoencefálica, identificadas por la fuga de glóbulos rojos (RBC). En un modelo de rata, el tejido cerebral fijo se crioprotege, se secciona y se tiñe con hematoxilina-eosina para los glóbulos rojos, lo que permite la visualización microscópica de las CMH. Los glóbulos rojos con fugas aparecen como rojo-anaranjado bajo el...

Detección de microhemorragias cerebrales en un modelo de rata

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Modelado Encefalopatía del Prematuro El uso prenatal hipoxia-isquemia con lipopolisacárido intraamniótica en ratas

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Hemorragia pontina masiva por inyección dual de sangre autóloga

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Administración endotraqueal no invasiva de lipopolisacáridos para inducir daño pulmonar agudo en roedores

Aprende a inducir microhemorragias cerebrales agudas mediante inyección de lipopolisacáridos en ratas Sprague-Dawley. Este protocolo permite estudiar la patogénesis inflamatoria y la integridad de la barrera hematoencefálica.

Microhemorragias cerebrales aguda inducida por la inyección de lipopolisacáridos en ratas

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