Name: Medida de alto rendimiento de macropinocitosis discoideum de Dictyostelium por citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprende a medir macropinocitosis de alto rendimiento en Dictyostelium discoideum mediante citometría de flujo. Este método permite analizar mutaciones genéticas y concentraciones de inhibidores con resolución de célula única.

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Agradecemos a la Medical Research Council UK para la base del financiamiento (U105115237) a RRK.

1. preparación de células y materiales
<ol><li>Cultivar células en placas de agar SM junto con las bacterias como la Klebsiella aerogenes, o en un medio nutritivo como HL5 como descrito23. Nota: Mutantes knockout que defecto de macropinocitosis en bacterias de crecimiento ayuda a prevenir la acumulación de mutaciones secundarias que pueden aumentar la tasa de macropinocitosis. Mantener el número de paso inferior a 4 después de platear las células de la acción para obtener resultados óptimos. Mutantes deben almacenarse como acciones congeladas tan pronto como sea posible después de aislamiento.</li>
	<li>Para cultivar las células en placas de agar SM, crecer K. aerogenes a confluencia en medio de la SM. Añadir 200 – 300 μL de bacterias en una placa de agar de SM y extensión. Tomar un bucle estéril de células (al transferir de otra placa bacteriana) y se separaron en un borde de la placa. Incubar a 22 ° C durante hasta una semana.</li>
	<li>Dextrano de Tetra-metil-rodamina isotiocianato (TRITC-) a 50 mg/mL en agua se disuelven, filtrar usando 0,22 μm filtros en alícuotas de 1 mL y almacenar a-20 ° C. Alícuotas se pueden mantener indefinidamente. Nota: 155 kDa es el tamaño típico utilizado con este método, como se puede comprar barato en grandes cantidades, pero más pequeño dextranos medir macropinocitosis apenas tan con eficacia en Dictyostelium24. Dextranos no templables al diferentes, como la cascada azul o Alexa-647, son alternativas en caso de diferentes fluoróforos.</li>
</ol>2. conversión de las mediciones cualitativas en cuantitativas (opcionales)
<ol><li>
Realizar un ensayo de absorción de fluido con células en suspensión.
	<ol>
<li>Pellet de células axenically crecientes a 300 x g durante 3 min, descartar el sobrenadante y resuspender en medio nutritivo a 1 x 107 células/mL. Añadir dextrano TRITC a 0,5 mg/mL y agitar a 180 rpm, 22 ° C.</li>
		<li>Diluir 0,8 mL muestras en 0,7 mL de helado KK2 a 0, 30, 60, 90, 120 min lavado en 1,5 mL de helado KK2 buffer23 en una centrífuga de sobremesa, resuspender en 1 mL en el mismo buffer y almacenan en hielo. Nota: lavar inmediatamente o una vez que todas las muestras han sido recogidas produce resultados equivalentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinar el volumen de líquido internalizado por las células.
	<ol>
<li>Establecer el Fluorímetro para medir fluorescencia con una longitud de onda de excitación de longitud de onda nm y emisión 544 de 574 nm con una raja de nm 10. Establecer una serie de diluciones de dextrano TRITC y utilizarlo para medir la fluorescencia para volúmenes de dextrano. Crear una curva de calibración.</li>
		<li>Medir la fluorescencia internalizada por las células en la sección 2.1 con 0,9 mL de la suspensión de células. Calcular el volumen de líquido internalizado por la célula usando la curva de calibración24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluir el resto de las células de cada momento por separado en 0,5 mL de hielo frío KK2. Filtrar con un colador de célula 70 μm en tubos de citometría de flujo de poliestireno de 5 mL. Establecer el citómetro de flujo para que las células de cada momento son distintas unos de otros y grabación su fluorescencia (véanse las secciones 3.4 y 3.5).</li>
	<li>Medir la fluorescencia de los granos de la calibración en el citómetro de flujo con la configuración anterior y registrarla. Nota: Esta es la referencia para todas las mediciones de fluorescencia futuras en el citómetro de flujo: antes de usar nuevamente ejecutar las cuentas y ajustar la configuración para que tengan la misma fluorescencia. Esto le dará un pico definido muy estrecho. Poner una puerta alrededor del pico de fluorescencia puede hacer esto más fácil.</li>
	<li>Repetir tres veces y trama de los datos de fluorescencia de células obtenidos en las secciones 2.2 y 2.3 uno contra el otro. Trazar una línea de mejor ajuste y utilice la ecuación para convertir los datos cualitativos de la citometría de flujo en unidades cuantitativas.</li>
</ol>3. medición de absorción de líquido
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig1.jpg"> Figura 1: esquema de medición de alto rendimiento de macropinocitosis. (A) crece Dictyostelium en una placa SM sembrada con bacterias de K. aerogenes (amarillo). Cosechar las células de la parte delantera de alimentación (naranja), evitando las células que ya están desarrolladas (verde), en 25 mL de tampón2 de KK. Vortex a disociar, pellets por 3 minutos de centrifugación a 300 x g, luego lavar 3 veces en 50 mL de tampón de2 KK, descartar el sobrenadante cada vez. Suspender a 1 x 105 células/mL en medio del crecimiento HL5 y añadir 50 μL en tres pocillos por muestra de una placa de 96 pozos de fondo plano. Incubar a 22 ° C por 24 h. (B) diluir TRITC-dextrano a 1 mg/mL en medio del crecimiento HL5 de una solución de 50 mg/mL. Añadir 50 μl de cada muestra (excepto los pocillos de control de la absorción de 0 min) e incubar a 22 ° C por 1 h, después de que agregue el dextran para el control de la absorción de 0 min. (C) decantar inmediatamente los medios de comunicación, pat la placa en un pañuelo de papel para quitar el exceso medio y sumerge en un baño de helada de tampón2 KK, llenando los pozos para lavar. Decantar el búfer y séquelo de nuevo. Añada 100 μl de 5 mM de azida de sodio disuelta en KK2MC para separar las células. Tomar al flujo citómetro para medición de fluorescencia internalizada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58434/58434fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>
Configurar una placa de cultivo de tejidos de 96 pozos fondo plano (figura 1A). Uso de las células cultivadas en bacterias y se puedan transferir en medio HL5 (que contiene 100 μg/mL de dihidroestreptomicina, 100 μg/mL ampicilina y kanamicina 50 μg/mL) 24 h antes del ensayo; Esto permite macropinocitosis que alza de los bajos niveles en células cultivadas en bacterias24. Alternativamente, diluir las células directamente en cultivo axénico, incubar durante 24 h antes del ensayo, para reducir los errores debido a las células ser diluidas de diferentes densidades.<ol>
<li>Cosechar las células de alimentación frente a 25 mL de KK2 en un tubo de centrífuga de 50 mL. Disociar las células por Vortex y pellets a 300 x g durante 3 min. Eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado y lavar 3 veces a 300 x g durante 3 minutos en 50 mL de KK2, descartar el sobrenadante cada vez para eliminar las bacterias.</li>
		<li>Determinar la densidad celular (con un hemacitómetro u otro sistema de conteo de celdas) y diluir en antibióticos que contienen HL5 a 1 x 105 células/mL. Pipetee 50 μL en cada pocillo, utilizando tres pozos para cada condición. Incubar a 22 ° C por 24 h. Recuerde establecer un control de la absorción de 0 min. Nota: Una alternativa media, por ejemplo, SIH, VL6 puede utilizarse en su lugar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Carga las células con TRITC-dextrano (figura 1B).
	<ol>
<li>Diluir el dextrán a 1 mg/mL en el medio utilizado (esto se puede aumentar a 2.5 – 5 mg/mL cuando se evalúan células con muy baja absorción). Añadir 50 μL a cada pozo (dando una concentración final de 0,5 mg/mL dextran TRITC) y devolver la placa a 22 ° C por 1 h, ya que esto permite acumulación significativa de dextrano pero exocitosis de dextrano aún no ha comenzado. Nota: una pipeta repetidor permite este paso a hacerse más rápidamente, reduciendo el error.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar las células para citometría de flujo (figura 1).
	<ol>
<li>Inmediatamente antes del lavado, agregar 50 μL que contiene dextrán los medios de comunicación a los controles de absorción de 0 min.</li>
		<li>Decante el medio y séquelo en un tejido. Lavarse sumergiendo la placa en la helada KK2, luego decantar. Nota: algunas cepas con defectos de adherencia pueden desprenderse durante este paso, por ejemplo, un nocaut de ambos homólogos del Talin (talA-/ talB -)25. Tenga cuidado al trabajar con líneas celulares que Coloque mal y aspiración los medios de comunicación si es necesario.</li>
		<li>Añada 100 μL de helada de 5 mM de azida de sodio disuelta en KK2MC (KK2 + 2 mM MgSO4 y 100 μM de CaCl2). PRECAUCIÓN: La azida sódica es extremadamente tóxica. Utilice una mascarilla antipolvo y gafas de seguridad cuando se trabaja con el polvo. Siempre use guantes y bata de laboratorio. Evitar el calor y no se mezcle con el ácido. Nota: Las células rápidamente separar y exocitosis es prevenido24. Un microscopio puede ser utilizado para ello.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Absorción de líquido de medida por citometría de flujo
	<ol>
<li>Si planea convertir valores relativos en los absoluto, utilice granos de estandarizar parámetros de citómetro de flujo (ver sección 2). Por otra parte, utilizamos las células cargada de dextrano como en la sección 2 para asegurarse de que la dispersión hacia delante y la dispersión lateral se fijan apropiadamente para aislar las células (figura 2A), asegurando que la máquina no se bloquea, (figura 2B) y ajustan los parámetros a medir la fluorescencia internalizada (figura 2).</li>
		<li>Conectar sistema de muestreo de alto rendimiento y del agregan la placa. Establecer un protocolo para medir la fluorescencia (para TRITC-dextran utiliza un láser de color verde amarillo para excitar y medir en el canal de nm 582 o similar) de hasta 65 μL de la suspensión de células y funcionamiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analizar resultados de la citometría de flujo
	<ol>
<li>Puerta en las células mediante dispersión hacia delante y la dispersión lateral (figura 2A). Calcular la mediana fluorescencia de las células mediante la opción de estadísticas. Establezca los parámetros de una muestra y se aplica a todas las muestras. Nota: Los perfiles de dispersión dispersión hacia delante o lateral pueden variar entre las muestras al utilizar diferentes mutantes o inhibidores.</li>
		<li>Determinar la media de los tres pozos para cada condición y restar el control de la absorción de 0 min. O convertir en valores cuantitativos utilizando la ecuación determinada en la sección 2 o normalizar el control.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. realizar la evolución temporal de absorción de líquido
<ol><li>Configurar las células como en la sección 3, con tres pozos para cada punto del tiempo y esfuerzo o condición.</li>
	<li>Añadir medio con dextrano a los diferentes pozos secuencialmente. Un curso típico de tiempo mide la absorción flúida en 0, 30, 60, 90, 120 y 180 minutos añadir medio que contiene dextrán para 180 min tiempo punto pozos, seguida de 60 min más tarde agrega a los pozos para el punto de tiempo min 120, etc. (Figura 3A).</li>
	<li>En el minuto 0, añada 50 μL de dextrán conteniendo medio inmediatamente decantar y lavar la placa como en la sección 3.3. Analizar como se describe en la sección 3.5.</li>
</ol>5. curvas de respuesta a la dosis
<ol><li>Configurar las células como se describe en la sección 3, con tres pozos para cada cepa y el estado.</li>
	<li>Diluir el compuesto de interés en medio que contiene dextrán 1 mg/mL en el doble la concentración final máxima deseada del compuesto. Preparar un segundo tubo que contiene medio con dextrano con la misma proporción del vehículo como el primer. Vortex para mezclar.</li>
	<li>Crear una serie de diluciones del compuesto de interés en dextrano 200 μL que contiene medio por muestra (Figura 4A). Vortex para mezclar. Añadir 50 μL del medio a cada muestra para 1 h.</li>
	<li>Lavar y analizar como se describe en la sección 3.3 en adelante.</li>
</ol>6. la fagocitosis y la absorción de la membrana
<ol><li>Para medir la absorción de la membrana, preparar las células como se describe en la sección 3. Añadir 50 μL de medio conteniendo 20 μM FM 1-43 para una concentración final de 10 μM. Después de la carga, lavar y preparar las células para citometría de flujo como en la sección 3.3. Mida en el canal de 585 nm o similar, utilizando un láser azul para excitar. Nota: Como se trata de la membrana es más rápida que la fase de líquido, 10 minutos es un momento más apropiado de usar que 1 h26. Tintes alternativos que es fluorescente cuando incorporado en la membrana se pueden utilizar en su lugar.</li>
	<li>
Usar fluorescencia con granos o bacterias para medir fagocitosis. No puede usarse levadura fluorescente, ya que son inseparables de Dictyostelium por adelante y lado dispersan24. Configurar las células como se describe en la sección 3 y analizar como descrito27.<ol>
<li>Para medir la fagocitosis de los granos de añadir amarillo-verde con abalorios como se describe en la sección 3.2 para una concentración final de 5 x 107 granos/mL (1,75 y 2 μm) o granos de 1 x 10 8/mL (1 y 1,5 μm) durante 1 hora antes del lavado y preparación para citometría de flujo como en Sección 3.3. Mida en el canal de 525 nm o similar, utilizando un láser azul para excitar. Nota: Concentraciones más altas conducirá a la separación de la célula.</li>
		<li>Para medir la fagocitosis de bacterias, añadir que Texas Red etiquetada biopartículas Escherichia coli como se describe en la sección 3.2 a 1 x 108 bacterias/mL durante 1 hora antes del lavado y preparación para citometría de flujo como en la sección 3.3. Mida en el canal de nm 610 o similares, usando un laser de color verde amarillo a excitar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Mientras que otros métodos para evaluar la absorción de líquidos son bajo rendimiento, lavado las células en situ y el uso de azida de sodio para separar las células es los pasos críticos en este método, que permiten alto rendimiento medición de macropinocitosis, absorción de la membrana, o fagocitosis por Dictyostelium. Como las células se unen a una superficie y el medio no es, pueden ser colocadas mientras que el medio que les rodea en primer lugar se lanza apagado y luego cambió por inmersión en solución tampón y lanzados apagado otra vez. Azida sódica, que agota el ATP celular y despolarizan la membrana30, entonces se utiliza para separar las células y también previene la exocitosis sin afectar la viabilidad de la célula24.
Mientras que mediante citometría de flujo para medir la macropinocitosis por Dictyostelium da una medición muy precisa de la absorción de líquido muy rápidamente, para establecer la razón por qué una cepa particular o condición ha alterado la absorción flúida, más investigación utilizando la microscopia es necesario24. También cabe señalar que, en algunos casos, resultados previamente publicados demuestran una diferencia en la absorción de líquido por cepas mutantes cultivadas en una superficie (como en este caso), o en la agitación de la suspensión (como en el protocolo estándar)31. Este método puede significar que, en casos raros, defectos de absorción de fluido aparente falten. Además, al medir fagocitosis, pueden utilizarse sólo bajas concentraciones de partículas. La máxima tasa de fagocitosis que se puede determinar con esta técnica es muy inferior a la máxima real, aunque todavía es posible medir diferencias relevantes en fagocitosis entre cepas y condiciones24. Para determinar la máxima tasa de fagocitosis, se medirá la absorción en sacudiendo la suspensión por un protocolo alternativo27. Las células que han fagocitado los granos han aumentado dispersión lateral, por lo que esto debe corregirse para en consecuencia cuando se configura el citómetro de flujo.
Citometría de flujo puede utilizarse para medir la absorción de líquido en células de mamíferos32, sin embargo la mayor proporción de líquido fase absorción por otras vías endocíticas que visto en Dictyostelium es una preocupación. Además, las células son típicamente separadas usando tripsina a 37 ° C, permitiendo que más progresión endocíticas de dextrano internalizada. Azida sódica helada no causa macrófagos que separan de una superficie (Williams, inédito observación), lo que esta técnica no es aplicable a células de mamífero sin más optimización.
Medida de alto rendimiento de macropinocitosis tiene el potencial para ser utilizado para la pantalla de forma rápida y barata para los efectos de los inhibidores, mutación genética o knockdown de genes en células de Dictyostelium . Mutantes siempre deben ser comparados con su padre directo solamente. Si el lector no tiene ninguna preferencia previa por Dictyostelium cepa, cepas no axénicos DdB como NC4 son más "tipo salvaje" que axénicos y pueden manipularse efectivamente axénicos de las cepas33. De lo contrario, son el axénicos Ax2 cepas cepas con el menor genoma duplicaciones34, mientras que muchas variedades de Ax4 son nocauts A Talin y deben ser evitado si es posible23. Más las cepas previamente publicadas pueden solicitarse desde el centro de Stock de Dicty35.
Esta técnica permite mayores posibilidades de investigación que antes era posible sobre los efectos de diferentes condiciones, inhibidores y mutaciones de macropinocitosis de Dictyostelium.

A gran escala no específico líquida absorción por macropinocitosis es importante en varios contextos biológicos1, incluyendo muestreo de antígeno por inmune las células2, entrada del patógeno en host células3, cáncer de la célula proliferación4 y la propagación de prion enfermedades5. En mamíferos y en las células de Dictyostelium , actina6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (aunque la naturaleza exacta de los lípidos es diferente entre los dos11), activado Ras12,13y activado Rac14,15 son importantes para la eficiente absorción del líquido por macropinocitosis, aunque quedan muchas preguntas sin respuesta acerca de cómo es el parche macropinocytic formado, organizado y eventualmente interiorizada. Descubrir las proteínas más importantes de macropinocitosis y determinación de cómo son importantes en los diversos contextos biológicos, le dará una comprensión más completa de macropinocitosis y permitir desarrollo de tratamientos específicos para una variedad de condiciones.
Dictyostelium es un sistema modelo ideal para estudiar la macropinocitosis. El alto nivel de macropinocitosis constitutiva en cepas de laboratorio estándar significa que la absorción flúida está sobre el 90% debido a la macropinocitosis6. Esto permite macropinocitosis a medir únicamente mediante la determinación de absorción de líquidos, a diferencia de las células mamíferas donde es mucho menor la proporción de absorción de líquido debido a la macropinocitosis. Macropinocitosis está tan bien definida y fácilmente visualizados12 en este sistema de igual manera ofrece ventajas distintivas para la investigación de base componentes conservados de la macropinosome frente a otros sistemas que puede haber múltiples señales reglamentarias 16 , 17.
La técnica estándar usada para medir la macropinocitosis por células de mamífero consiste en fijar las células después de la pulsación con dextrano durante un período corto de tiempo seguido por microscopia para determinar el área de una célula que está ocupado por vesículas de dextrano-positivo18. Esta técnica sin embargo no da cuenta de la posibilidad de macropinosomes contracción al entrar en la célula, que se ha divulgado en Dictyostelium19y sólo tiene en cuenta planos individuales de la célula, lo que significa el volumen internalizado no está claro. Una técnica alternativa, de contar el número de macropinosomes internalizado en un momento dado, tiene los mismo inconvenientes20. Uso de Dictyostelium evita estos problemas; sin embargo, las técnicas existentes para medir la absorción flúida en Dictyostelium son relativamente cantidad de mano de obra, usando un grande de las células y dextrano21. Las células se agitan a alta densidad en muestras retiradas en varios puntos del tiempo para la determinación de la fluorescencia internalizada usando un Fluorímetro y dextranos fluorescentes. Células preparadas de esta manera se pueden analizar mediante citometría de flujo para obtener unicelular, en lugar de a nivel de población, resolución22, aunque esto sigue siendo bajo rendimiento.
Aquí, la técnica estándar para medir líquido internalizada usando dextranos fluorescentes como etiqueta se adapta a un formato de placa de 96 pocillos, con las muestras analizadas por citometría de flujo utilizando un accesorio de toma de muestras de alto rendimiento (HTS). Las células se alimentan no templables al dextrano fluorescente para un periodo determinado de tiempo, lavado por inmersión en buffer helada y separadas con azida de sodio 5 mM, que también se detiene la exocitosis. Las células en cada pozo se analizan por citometría de flujo. Este método fue diseñado para superar las limitaciones de los métodos anteriores y permitir comparación simultánea de la absorción de líquido de un gran número de cepas y condiciones utilizando menos recursos y reduciendo la mano de obra involucrada.

<table><tbody><tr><td>LSR_II citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences-Otros</td><td></td> <td>Los citómetros de flujo también pueden desempeñar esta función, por ejemplo, el LSRFortessa de BD</td></tr><tr><td>TRITC-dextrano (155 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287</td><td>Otros dextranos no templables, y otros tamaños también son finos</td></tr><tr><td>HL5 medio</td><td>Formedium</td><td>HLGCFG</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Cualquier cultivo de tejido de fondo plano tratado con placa de 96 pocillos funcionará</td></tr><tr><td>Sulfato de dihidroestreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1517</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina sódica</td><td>Formdium</td><td>AMP50</td><td></td></tr><tr><td>Monosulfato de kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>VWR</td><td>103694M</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de sulfato de magnesio</td><td>VWR</td><td>25169.295</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>VWR</td><td>1.02382.0250</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de potasio</td><td>VWR</td><td>1.04877.1000</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato dipotásico</td><td>VWR</td><td>1.05104.1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorímetro</td><td>Perkin-Elmer</td><td>LS 50 B</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Thermofisher</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microesferas 1.00 y micro; m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas de carboxilo YG fluoresbrite 1.50 y micro; m</td><td>Polysciences</td><td>09719-10</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas de carboxilado YG de fluoresbrite 1.75 &; m</td><td>Polysciences</td><td>17687-5</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas de carboxilo YG fluoresbrita 2.00 &; m</td><td>Polysciences</td><td>09847-5</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red E. coli biopartículas</td><td>Thermofisher</td><td>E2863</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosferas de ajuste de flujo</td><td>Beckman Coulter</td><td>6607007</td><td>Calibration Beads</td></tr><tr><td>SM agar</td><td>Formedium</td><td>SMACFG</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m filtro de jeringa</td><td>Elkay Laboratory Products</td><td>E25-PS22-50S</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de fondo redondo</td><td>Corning</td><td>352058</td><td>Utilice un tubo que se ajuste a su citómetro de flujo.</td></tr><tr><td>70 y micro; filtro de células m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr> tubo de <tr><td>centrífuga de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de repetición</td><td>Eppendorf</td><td>M4-SK</td><td></td></tr><tr><td>5 mL puntas de pipeta de repetición</td><td>Eppendorf</td><td>30089650</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LY294002</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>70920</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404-2MG</td><td></td></tr></tbody></table>

medida de alto rendimiento de macropinocitosis discoideum de dictyostelium por citometría de flujo

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

A gran escala no específico líquida absorción por macropinocitosis es importante para la proliferación de ciertas células de cáncer, antígeno muestreo, invasión de la célula huésped y la propagación de las enfermedades neurodegenerativas. Las cepas de laboratorio comúnmente usado de la ameba Dictyostelium discoideum tienen tasas de absorción de líquido extremadamente altas cuando se cultiva en medio nutritivo, más del 90% de los cuales es por macropinocitosis. Además, muchos de los componentes conocidos de macropinocitosis mamíferos también están presentes, lo que es un sistema modelo excelente para estudiar la macropinocitosis. Aquí, la técnica estándar para medir líquido internalizada usando dextranos fluorescentes como etiqueta se adapta a un formato de placa de 96 pocillos, con las muestras analizadas por citometría de flujo utilizando un accesorio de toma de muestras de alto rendimiento (HTS).
Las células se alimentan no templables al dextrano fluorescente para un periodo determinado de tiempo, lavado por inmersión en buffer helada y separadas con azida de sodio 5 mM, que también se detiene la exocitosis. Las células en cada pozo se analizan por citometría de flujo. El método también puede ser adaptado para medir la absorción de la membrana y fagocitosis de perlas fluorescentes o bacterias.
Este método fue diseñado para permitir la medición de la absorción de líquido por Dictyostelium de una manera eficiente de alto rendimiento, trabajo y recursos. Permite la comparación simultánea de múltiples cepas (por ejemplo , mutantes de octavos de final de un gen) y condiciones (por ejemplo células en diferentes medios de comunicación o tratados con diferentes concentraciones de inhibidor) en paralelo y simplifica el tiempo-cursos.

Una vez que se ha realizado la técnica y las células son cargados con dextrano y listos para el análisis (figura 1), el citómetro de flujo no está bloqueada y ajustar el perfil de dispersión dispersión hacia delante o lateral para parecerse a las células que se muestra en la figura 2A. Si la máquina está bloqueada, se verá más como que se muestra en la figura 2B y debe ser desbloqueado antes de continuar. Asegurar los parámetros Mostrar control axénicos células de tienen fluorescencia alta dextrano internalizada en más puntos del tiempo y baja fluorescencia internalizada en más cortos (figura 2).
Al buscar diferencias entre mutantes, es probable que exista uno de los tres fenotipos. Los mutantes podrían tener absorción de fluido normal, podrían tener un defecto parcial o absorción de líquido podría suprimirse totalmente. Figura 2D muestra una cepa con la normal absorción de líquido, en este caso la cepa de laboratorio estándar Ax2, un mutante con un ~ 50% disminución en la absorción de líquido (Ax2 rasG-14) y uno con suprimió la absorción flúida (Ax3 gefB-28). Obtener el promedio mediana absorción líquida (sección 3.5) y utilizarlo para calcular el volumen de líquido interiorizado (como en la figura 3B) o comparar los datos a un control (como en la Figura 4B y C 4).
Al realizar un curso de tiempo de absorción de líquido, como en la Figura 3A, la fluorescencia internalizada debe aumentar de 60 a 90 min, después de que el dextrano comienza a ser exocytosed y se llega a una meseta (figura 3B). Usando 60 min como tiempo estándar cuando comparando macropinocitosis en mutantes y condiciones diferentes, por tanto, permite una buena señal para lograrse, y ninguna señal se pierde por exocitosis. Mutantes donde exocitosis es severamente obstruido pueden tardar más en llegar a una meseta29.
Cuando tratar las células con inhibidores que son eficaces contra la macropinocitosis en Dictyostelium (configurar como en la Figura 4A), el dextrano internalizado en 1 h irá abajo a casi nada de mayores concentraciones de inhibidor en la mayoría de los casos (Figura 4B). Algunos inhibidores no pueden ser 100% eficaz, sin embargo, por ejemplo nocodazole inhibe sólo hasta un 50% de la absorción de líquido por macropinocitosis cuando agudo (figura 4). Si los inhibidores no son eficaces, las células interiorizan una cantidad similar de dextrano como el control, y no se verá una disminución de fluorescencia. Esta técnica permite una amplia gama de diferentes inhibidores y las concentraciones de inhibidor a un cribado para efectos sobre la absorción de líquido por macropinocitosis muy rápidamente, reduciendo el tiempo de optimizar el tratamiento del inhibidor.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig2.jpg"> Figura 2: configuración del flujo de datos de citometría y representante. (A) el forward scatter (FSC) y perfiles de scatter (SSC) laterales de las células deben establecerse para que las células pueden distinguirse fácilmente. Se muestra un ejemplo de cómo deben ser las células Ax2. (B) si se bloquea el citómetro de flujo, como en este ejemplo, las células tienen dispersión lateral muy bajo. El láser no excita los fluoróforos correctamente y la máquina se debe desbloquear antes de continuar. Deben desecharse cualquier datos obtenidos mientras que la máquina se bloqueó. (C) la fluorescencia debe ajustarse para que una muestra de absorción de 0 min tiene baja fluorescencia, que se incrementa cuando las células han sido incubadas durante más tiempo en el medio de fluorescente, como se muestra en este ejemplo tomado de Williams &amp; Kay 201824. (D) ejemplos de células que han sido incubados con dextrano TRITC durante 1 h con normal macropinocitosis (Ax2, verde), redujo la macropinocitosis (Ax2 rasG -HM172614, naranja) y suprimido macropinocitosis (Ax3 gefB -, HM177628, azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58434/58434fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig3.jpg"> Figura 3: realización de cursos tiempo de absorción líquido en placas de 96 pocillos. (A) dextrano debe añadirse a cada conjunto de muestras secuencialmente, con el mismo tiempo de acabado. Luego lavar los pocillos, separar y medir la fluorescencia internalizada por citometría de flujo. Veces de ejemplo para agregar el dextrano se muestran aquí. (B) absorción líquido-curso del tiempo las células Ax2 realizado en placas de 96 pocillos. Williams &amp; Kay 201824, barras de error muestran el error estándar de tres experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58434/58434fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig4.jpg"> Figura 4: curvas de respuesta de dosis de absorción de líquido. (A) añadir el compuesto de interés, en este caso la PI3K inhibidor LY294002, HL5 que contiene 1 mg/mL TRITC-dextran al doble la concentración máxima final deseada. Mezclar con medio de cultivo HL5 + dextrano 1 mg/mL que contiene en diversas proporciones para generar una serie de dilución de 200 μL de medio por condición del vehículo. Añadir a wells como normal durante 1 hora antes de lavar y medir la fluorescencia internalizada. (B) curva de respuesta de dosis de absorción líquido Ax2 células incubadas con el medio que contiene el LY294002 de A. Adaptado de Williams y Kay 201824. Absorción de líquidos se normaliza a un control sin tratar. Barras de error indican el error estándar de tres experimentos independientes. (C) curva de respuesta de dosis de absorción líquido Ax2 células incubadas con el nocodazole. Adaptado de Williams y Kay 201824. Absorción de líquidos se normaliza a un control sin tratar. Barras de error indican el error estándar de tres experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58434/58434fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Macropinocitosis, a gran escala absorción de líquido no específico, es importante en muchas áreas de la biología clínica incluyendo Inmunología, infección, cáncer y enfermedades neurodegenerativas. Aquí, las técnicas existentes se han adaptado para permitir la resolución de alto rendimiento, sola celda medición de macropinocitosis en la macropinocitosis modelo organismo discoideum de Dictyostelium utilizando citometría de flujo.

Medida de alto rendimiento de macropinocitosis discoideum de Dictyostelium por citometría de flujo

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de Dictyostelium y macropinocitosis, como si un gen, proteína o vía molecular en particular está involucrado en la macropinocitosis. La principal ventaja de esta técnica es que muchas variables como el tiempo, las mutaciones genéticas, las concentraciones de inhibidores y las composiciones de los medios se pueden probar en paralelo, dando resultados con una resolución de una sola célula. Para comenzar este procedimiento, obtenga células cultivadas en agar SM con bacterias como se describe en el protocolo de texto.Recoja las células del frente de alimentación en 25 mililitros de tampón KK2 en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Agite el tubo para disociar las células y centrifugue a 300 G durante tres minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 50 mililitros de tampón KK2 fresco.Repetir este lavado tres veces centrifugando, eliminando el sobrenadante y volviendo a suspender en 50 mililitros de tampón KK2 para cada lavado. Después de esto, use un hemocitómetro u otro dispositivo de conteo de células para determinar la densidad de células. Diluya las células en un medio HL5 que contenga antibióticos hasta una concentración de 100.000 células por mililitro.Pipetee 50 microlitros de la solución celular diluida en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos, utilizando tres pocillos para cada condición. Incubar a 22 grados centígrados durante 24 horas. A continuación, diluya TRITC-dextrano a un miligramo por mililitro en el medio utilizado.Agregue 50 microlitros a cada pocillo para obtener una concentración final de TRITC-dextrano de 0.5 miligramos por mililitro en cada pocillo. Incubar a 22 grados centígrados durante una hora. Para comenzar a preparar las células para la citometría de flujo, agregue 50 microlitros de medios que contengan dextrano a los controles de actualización de cero minutos.A continuación, decanta el medio del plato y sécalo con un pañuelo de papel. Lave la placa sumergiéndola en tampón KK2 helado y luego decante el tampón de la placa. Agregue 100 microlitros de una solución que contenga azida de sodio de cinco milimolares helada disuelta en KK2MC a cada pocillo.Mida la actualización de fluidos por citometría de flujo como se describe en el protocolo de texto. Prepare una placa de cultivo de tejido fresca de fondo plano de 96 pocillos como se describió anteriormente, con tres pocillos para cada cepa y condición. Para un curso de tiempo típico, planee medir la absorción de líquidos a cero, 30, 60, 90, 120 y 180 minutos.Agregue 50 microlitros de medio marcado con dextrano a los pocillos de punto de tiempo de 180 minutos. 60 minutos más tarde, agregue medio marcado con dextrano a los pocillos de punto de tiempo de 120 minutos. Continúe agregando el medio de esta manera secuencialmente para todo el plato.A los cero minutos, agregue 50 microlitros de medio que contenga dextrano a los pocillos de control de cero minutos. A continuación, decanta inmediatamente el medio. Lave la placa sumergiéndola en un tampón KK2 helado y luego decante el tampón de la placa.Analice la placa mediante citometría de flujo como se describe en el protocolo de texto. Prepare una placa de cultivo de tejido fresca de fondo plano de 96 pocillos como se describió anteriormente, con tres pocillos para cada cepa y condición. Prepare el medio que contenga dextrano a una concentración de un miligramo por mililitro.Utilice este medio para diluir el compuesto de interés a una concentración que sea el doble de la concentración final máxima deseada. A continuación, prepare un segundo tubo con medio que contenga dextrano en la misma proporción de vehículo. Mezcle ambas soluciones por vórtice.Utilice estas soluciones para crear una serie de diluciones del compuesto de interés en 200 microlitros de medio que contenga dextrano por muestra. Mezcle cada muestra por vórtice. Agregue 50 microlitros de este medio a cada pocillo de muestra.Después de una hora, decantar el medio del plato. Lave la placa sumergiéndola en tampón KK2 helado y luego decante el tampón de la placa. Analice la placa mediante citometría de flujo como se describe en el protocolo de texto.Los datos representativos de citometría de flujo muestran que cuando el citómetro no está bloqueado y los perfiles de dispersión directa y lateral de las células se establecen correctamente, las células se pueden distinguir fácilmente. Al buscar diferencias entre mutantes, es probable que haya uno de tres fenotipos. Los mutantes podrían tener una absorción de líquidos normal, podrían tener un defecto parcial o la absorción de líquidos podría eliminarse por completo.La mediana media de la absorción de líquidos se utiliza para calcular el volumen de líquido internalizado. En un curso de tiempo de absorción de líquido, la fluorescencia internalizada aumenta durante 60 a 90 minutos. Después de lo cual el dextrano comienza a ser exocitado y se alcanza una meseta.La mediana media de absorción de líquidos también se utiliza cuando se comparan los datos con un control, como cuando se tratan células con inhibidores que son eficaces contra la macropinocitosis. En las células tratadas, se observa que el dextrano internalizado en una hora disminuye y casi cae a cero a concentraciones más altas de inhibidores. No todos los inhibidores son completamente efectivos, como el nocodazol, que solo inhibe hasta el 50% de la absorción de líquidos por la macropinocitosis.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía, para responder preguntas adicionales, como si la absorción de líquidos puede ser diferente en una afección particular, por ejemplo, si las células con macropinocitosis reducida producen menos macropinosomas o si son más pequeñas.

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El presente protocolo describe un nuevo método de identificación de una población de enucleación eritroblastos ortocromáticas por el flujo de imágenes multiespectrales citometría, proporcionando una visualización del proceso de enucleación eritroblastos.

Identificación de un murino eritroblasto subpoblación Enriquecido en enucleación Eventos Multi-espectral Imaging Citometría de Flujo

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la fagocitosis de partículas fluorescentes por una línea celular de macrófagos adherentes utilizando un método fluorométrico. Este método facilita una cuantificación de alto rendimiento de la internalización de partículas, así como la polimerización de actina resultante.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

La cuantificación precisa de los eventos de tráfico vesicular a menudo proporciona información clave sobre las funciones de proteínas específicas y los efectos de las mutaciones. En este artículo se presentan métodos para utilizar la pHluorina supereclíptica, una variante de GFP sensible al pH, como herramienta para la cuantificación de eventos endocíticos en células vivas mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa y citometría de flujo.

Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Aquí describimos los métodos para evaluar la respuesta celular al estímulo mecánico agudo. En el análisis de microscopía, examinamos localización de biosensores marcada con fluorescencia Tras estimulación breve con esquileo del flujo. También probamos la activación de diversas proteínas de interés en respuesta a la estimulación mecánica aguda bioquímicamente.

Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Los ensayos automatizados que utilizan microplacas de múltiples pocillos son enfoques ventajosos para identificar reguladores de vías al permitir la evaluación de una multitud de condiciones en un solo experimento. Aquí, hemos adaptado el protocolo de cuantificación e imágenes de macropinosomas bien establecido a un formato de microplaca de 96 pocillos y proporcionamos un esquema completo para la automatización utilizando un lector de placas multimodo.

Imágenes y análisis automatizados para la cuantificación de macropinosomas marcados fluorescentemente

Aquí presentamos dos protocolos para cuantificar el envolvimiento microglial de sinapsis positivas para vGLUT1 y sinaptosomas crudos marcados con pHRodo Red mediante citometría de flujo.

Cuantificación de la envolvimiento microglial de material sináptico mediante citometría de flujo

El método IP-FCM se presenta, lo que permite un sensible, sólida evaluación, bioquímicos nativos de interacciones proteína-proteína, sin necesidad de la ingeniería genética o muestras de gran tamaño.

IP-FCM: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo

Aprende a medir macropinocitosis de alto rendimiento en Dictyostelium discoideum mediante citometría de flujo. Este método permite analizar mutaciones genéticas y concentraciones de inhibidores con resolución de célula única.

Medida de alto rendimiento de macropinocitosis discoideum de Dictyostelium por citometría de flujo

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