Name: Revertir el ensayo de amplificación isotérmica mediada por el lazo de transcripción (RT-LAMP) para el Virus Zika y Housekeeping Genes en muestras de mosquitos, suero y orina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprende a detectar el virus Zika mediante RT-LAMP en orina, suero y mosquitos Aedes aegypti sin necesidad de aislamiento de ARN. Este método rápido de 30 minutos facilita el diagnóstico en salud reproductiva y vigilancia epidemiológica.

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Este trabajo fue apoyado por la contribución filantrópica familia Maureen y Ronald Hirsch y campo Instituto de Neurociencias, Santa María de Michigan. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. También agradecemos a Dr. Bernadette Zwaans y Elijah Ward por su revisión crítica del manuscrito.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Junta de revisión institucional (IRB) de salud de Beaumont. Todos los experimentos fueron realizados con arreglo a las normas y directrices pertinentes.
PRECAUCIÓN: Todos los materiales potencialmente infecciosos deben ser manipulados según las normas de bioseguridad nivel 2 incluyendo el uso de equipo de protección personal. Todos los procedimientos que pueden producir aerosoles deben realizarse en un gabinete de bioseguridad. Además, trabajo con mosquitos vivos debe realizarse en los centros de artrópodos contención nivel 1-3. Dado la Asociación de infección por ZIKV con anormalidades congénitas, las mujeres que estén embarazadas, intentando concebir, o los socios de estas mujeres deben minimizar significativamente su exposición del laboratorio a ZIKV. Transporte de muestras ZIKV se clasifica en los Estados Unidos como sustancias biológicas de categoría B según departamento de peligrosos materiales regulaciones del transporte (49 CFR parte 171-180) y por lo tanto, envío de muestras debe adherirse a los directrices. Importación en los Estados Unidos de ZIKV biológicas requiere un centros para el Control y prevención de enfermedades (CDC) permiso de importación. Importación de cualquier artrópodos que podría servir como un vector para la transmisión de ZIKV, incluso si no están infectados, requiere un permiso del Departamento de agricultura de Estados Unidos (USDA). Esta información está actualizada en el momento de publicación. Recomendaciones actualizadas pueden encontrarse en https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.
Nota: Las reacciones de RT-LAMP son propensas a mayores tasas de reacciones falsas positivas, por lo que se debe tener cuidado en la planificación experimental. Toda puesta en marcha y ejecución de las reacciones de RT-LAMP deben usar pipetas designados y extremidades de filtro. Idealmente, se debe establecer un flujo de trabajo lateral. Si es posible, análisis y proyección de imagen (sección 5) deben ocurrir en una sala cerrada para prevenir la contaminación. Apertura de tubos de ensayo que contengan productos de RT-LAMP debe mantenerse al mínimo.
1. RT-LAMP Primer preparación
<ol><li>Reconstituir cada primer RT-LAMP liofilizado en agua grado molecular a una concentración final de 100 μm (tabla 1). Vortex brevemente la solución de imprimación para garantizar una solución homogénea y girar brevemente por la solución a la máxima velocidad en una centrífuga de mesa para recoger toda la solución la cartilla.</li>
	<li>Preparar un 10 x RT-LAMP Primer Mix de los iniciadores de la FIP, BIP, F3, B3, LF y LB con los volúmenes en la tabla 2. Vortex brevemente la solución de imprimación para garantizar una solución homogénea y girar brevemente por la solución a la máxima velocidad en una centrífuga de mesa para evitar cualquier pérdida. Nota: El primer RT-LAMP para Ae. aegypti actinia (AEDAE) no contiene una cartilla LB (cartillas de lazo no son siempre necesarios para las reacciones de RT-LAMP). En este caso, vuelva a colocar el volumen de la cartilla LB con agua grado molecular.</li>
	<li>Almacenar los cebadores a-20 ° C entre usos y evitar ciclos de descongelación libre.</li>
</ol>2. preparación de la muestra
<ol><li>
Para las muestras de orina humana: Usar orina fresca, congelada orina u orina en conservante. Para la muestra fresca o congelada: inmediatamente girar por la muestra después de la recolección durante 10 min a 700 x gy utilizar el sobrenadante para el análisis o congelar a-80 ° C para su uso futuro. Descongelar las muestras congeladas en el hielo antes de usarlo.</li>
	<li>
Para muestras de suero humano: Utilice cualquiera de los dos sueros frescos o congelados.</li>
	<li>
Por ZIKV infectados líneas celulares: utilizar medios condicionados o lysates de la célula. Nota: Sin células acondicionado media de Ae. albopictus C6/36 células 8 días post-infección puede utilizarse como controles positivos para reacciones ZIKV RT-LAMP.</li>
	<li>
Para los mosquitos Ae. aegypti : utilizar cualquiera de los dos cadáveres de mosquitos entero fresco o congelado. Descongelar los mosquitos congelados en el hielo. Prepare un mosquito crudo lisado colocando un mosquito individual en 100 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y homogeneizar por aplastamiento el mosquito 10 veces con una punta de pipeta P10 (figura 1). Centrifugar brevemente el lisado para que sedimenten los residuos del crudo. Usar el sobrenadante para el análisis de RT-LAMP aguas abajo. Nota: Controles positivos pueden generarse en un entorno de laboratorio por infectar a los mosquitos hembras mediante microinyección intratorácica con aproximadamente 103 equivalentes de genoma del virus en un volumen de 200 nL y cosecha el mosquito 5 días infección posterior.</li>
</ol>3. prepare la mezcla maestra RT-LAMP
<ol><li>Preparar una reacción de RT-LAMP mix master en hielo para cada cartilla a utilizar por medio de guía de volumen en la tabla 3. Nota: El uso de termolábiles Uracil ADN glicosilasa (UDG) ayuda a prevenir falsos positivos.</li>
	<li>Vortex brevemente para asegurar que todas las muestras estén bien mezcladas, luego girar por brevemente para evitar la pérdida de volumen.</li>
</ol>4. RT-LAMP ensayo
<ol><li>
Pipeta 23,0 μL de la mezcla principal de RT-LAMP por reacción en un tubo PCR de 200 μl. Añada 2.0 μL de muestra (orina, suero o sobrenadante lisado crudo mosquitos como se describe en el paso 2). Esto traerá el volumen total a 25.0 μL por reacción de RT-LAMP. Para el control negativo, use agua de grado molecular. Incluir un control positivo. Nota: Una polimerización en cadena estándar o el virus de las poblaciones de sobrenadante de células infectadas pueden ser utilizado como control positivo.<ol>
<li>Opcional: Incluyen una reacción de control de la especificidad de un arbovirus relacionados como el virus del dengue (DENV). Preparar la muestra como se indica en el paso 2 según tipo de muestra. Añada 2.0 μL del control especificidad a 23.0 μL de la mezcla principal de RT-LAMP en un tubo PCR de 200 μl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calentar las muestras a 61 ° C por 30 min con un bloque de calor, baño de agua o termociclador.</li>
	<li>Calor desactiva la polimerasa por calentamiento a 80 ° C durante 10 minutos.</li>
</ol>5. RT-LAMP análisis
Nota: Realizar el análisis de RT-LAMP en un espacio independiente, cerrado.
<ol><li>
Después de la incubación, para acceder a las reacciones de RT-LAMP visualmente en busca de la presencia de un cambio de color.
	<ol>
<li>Diluir el ácido nucleico fluorescente tinte 1:10 en Tampón TAE (40 mM Tris, ácido acético de 20 mM, 1 mM EDTA). PRECAUCIÓN: Cualquier mancha de ácido nucleico se une a los ácidos nucleicos y por lo tanto es un agente carcinógeno. Use guantes cuando maneje.</li>
		<li>A 12 μl de la reacción de RT-LAMP, añadir 2 μl de dilución de colorante fluorescente de ácidos nucleicos. Nota: Las reacciones negativas es color anaranjado y reacciones positivas será amarillo-verde en color.</li>
		<li>Opcional: Tomar fotos de las reacciones de RT-lámpara sobre un fondo blanco con una cámara.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque las muestras en 302 nm UV luz para confirmar la presencia de productos de RT-lámpara de fluorescencia. Tomar fotografía del resultado del uso de una cámara. Nota: Las reacciones de RT-LAMP positivo tendrá una salida fluorescente. PRECAUCIÓN: Use protector de cara o gafas de protección ocular UV cuando se trabaja con luz UV.</li>
	<li>
Opcional: Confirmar la presencia de productos de RT-LAMP al realizar la electroforesis en gel de las muestras.
	<ol>
<li>Vierta un gel de agarosa al 2% en 1 buffer de x TAE con una mancha de ácido nucleico para la visualización. PRECAUCIÓN: Cualquier mancha de ácido nucleico se une a los ácidos nucleicos y por lo tanto es un agente carcinógeno. Use guantes cuando maneje.</li>
		<li>Añadir 5 μl de una escalera de DNA en el primer carril para comparar los pesos moleculares.</li>
		<li>Para cada reacción de RT-LAMP, mezcla 13 μl de mezcla de reacción RT-LAMP con 2 μl de ADN carga del tinte. Carga de la mezcla de 15 μl que contiene el ADN carga del tinte.</li>
		<li>Correr el gel en 90 V durante 90 minutos o hasta que las bandas se separan y la imagen con la luz de UV de 302 nm. Nota: Las reacciones de RT-LAMP positiva tendrá un patrón escalonado. Las reacciones de RT-LAMP negativas no deben contener cualquier bandas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. eliminación de desechos
<ol><li>Deshacerse de las reacciones de RT-LAMP en doble bolsas selladas. No autoclave como esto puede transformar los productos de RT-LAMP, conduciendo a falsas reacciones positivas en el futuro.</li>
</ol>

<ol><li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1602113">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li>
<li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Microbiological+Societies+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method%3A+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963(2015).</li>
<li>Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25741643">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens.</a> The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Lamb, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+of+Zika+Virus+in+Urine+Samples+and+Infected+Mosquitos+by+Reverse+Transcription-Loop-Mediated+Isothermal+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3803(2018).</li>
<li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18674965">One-step RT-PCR for detection of Zika virus.</a> Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
<li>Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+brugian+filariasis+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948(2012).</li>
<li>Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiple+target+detection+in+real-time+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification.</a> Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).</li>
<li>Chan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Affordable+and+Portable+Medium-Throughput+Molecular+Device+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus.</a> Scientific Reports. 6, 38223(2016).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instrument-Free+Point-of-Care+Molecular+Detection+of+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus.</a> Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).</li>
<li>Yaren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+of+sampling+detection+of+Zika+virus+within+a+multiplexed+kit+capable+of+detecting+dengue+and+chikungunya%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya.</a> BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Zika+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).</li>
<li>Priye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+smartphone-based+diagnostic+platform+for+rapid+detection+of+Zika%2C+chikungunya%2C+and+dengue+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses.</a> Scientific Reports. 7, 44778(2017).</li>
</ol>

LEL y MBC tienen propiedad intelectual sobre los métodos de diagnóstico de virus Zika. Los autores restantes tienen intereses que compiten.

El ensayo de ZIKV RT-LAMP descrito en este papel los trabajos utilizando muestras de humanos y mosquitos6. El límite de detección fue de aproximadamente 1 genoma equivalente6, que debería ser suficiente ya que la carga viral típica de un paciente sintomático ZIKV infectado es de 103  PFU/mL6 107. Además, este método puede detectar ZIKV en muestras sin primer RNA aislamiento y sin amplificación del virus en cultivo cel...

En 2015, Zika virus (ZIKV) ganó atención mundial prominente como una enfermedad infecciosa de preocupación porque la infección durante el embarazo era ligada a aborto espontáneo, mortinato, graves defectos congénitos neurológicos incluyendo microcefalia, así como otros congénita defectos de nacimiento1. En casos raros, ZIKV se ha asociado con el síndrome de Guillain-Barré. ZIKV es principalmente transmitida por los mosquitos Aedes ; sin embargo, también se puede propagar a través del contacto sexual1. Dado que la infección con ZIKV es asintomática en la mayoría de la gente o presenta con suaves gripe-como síntomas que se solapan con los síntomas de la infección de otros arborviruses1, hubo una necesidad de mejorar los métodos para la detección rápida y rentable de ZIKV para personas, así como las poblaciones de mosquitos locales.
Cuantitativa transcripción reversa PCR (qRT-PCR) es un ensayo confiable para ZIKV; sin embargo, esta técnica requiere costosos equipos especializados, personal capacitado y aislamiento de RNA de la muestra de interés. Amplificación isotérmica loop-mediated de reversa de la transcripción (RT-LAMP) es un método de amplificación de ácido nucleico un solo paso basado en la tecnología PCR que sólo requiere una temperatura de incubación debido al uso de una polimerasa de la DNA termófila con filamento características de la dislocación. Esto evita la necesidad de un termociclador y disminuye la cantidad de tiempo necesario para completar el ensayo. Ventajas adicionales de RT-LAMP incluyen su alta especificidad y sensibilidad, robustez en una gama de niveles de pH y temperatura y resistencia a muchos de los inhibidores de la PCR2. Tiene un costo relativamente bajo y los reactivos son estables a temperatura ambiente. Dadas estas características, lámpara de RT se puede implementar en un laboratorio o en el campo. Así, las reacciones de la lámpara se han desarrollado para detectar una gama de agentes patógenos y otros tipos de infección3,4,5. El protocolo de RT-LAMP descrito en este documento pretende detectar ZIKV sin aislamiento de RNA en suero y orina muestras humanas así como en un solo mosquito infectado dentro de 30 minutos a través de RT-LAMP. Este método puede utilizarse para reemplazar la qRT-PCR es una herramienta de diagnóstico sensible y rápida que funciona rápidamente y en ambientes fuera del laboratorio.

<table><tbody><tr><td>Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerasa</td> New <td>England Biolabs</td><td>M0537S</td><td></td></tr><tr><td>Isothermal Amplification Buffer&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0537S</td><td></td></tr><tr><td>WarmStart RTx Transcriptasa inversa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0380S</td><td></td></tr><tr><td>UDG termolábil antártico New</td><td>England Biolabs</td><td>M0372S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>New England Biolabs</td><td>B1003S</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP Solución</td> New <td>England Biolabs</td><td>N0440S</td> Set <td>de desoxinucleótidos N0446S</td></tr><tr><td>Solución dCTP de 100 mM</td><td>New England Biolabs</td><td>N0441S</td><td>Juego de desoxinucleótidos N0446S</td></tr><tr><td>Solución dTTP de 100 mM</td><td>New England Biolabs</td><td>N0443S</td><td>Juego de desoxinucleótidos N0446S</td></tr><tr><td>Solución dGTP de 100 mM</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td>Juego de desoxinucleótidos N0446S</td></tr><tr><td>Solución dUTP de 100 mM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0133</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Ácido nucleico verde I Tinción de gel</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Nancy-520</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01494</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de baja masa de ADN</td><td>Invitrogen</td><td>10-068-013</td><td></td></tr><tr><td>Control positivo del zika</td><td>Instituto Robert Koch, Alemania</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>BlueJuice Tampón de carga de gel</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>10816015</tr><tr><td>Primers</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>Oligo</td><td></td></tr><tr><td>personalizado Agua sin nucleasas</td><td>Ambiente</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>Conservante de orina</td><td>Norgen Biotek</td><td>18126</td><td></td></tr><tr><td>ZIKV Estándar de PCR</td> Instituto <td>Robert Koch N</td><td>/A</td><td>Sobrenadantes de células Vero E6</td></tr><tr><td>DENV2 Nueva Guinea C Control</td> Connecticut <td>Experimento Agrícola Estación</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

revertir el ensayo de amplificación isotérmica mediada por el lazo de transcripción (rt-lamp) para el virus zika y housekeeping genes en muestras de mosquitos, suero y orina

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Infección con el virus Zika (ZIKV) puede ser asintomática en adultos, sin embargo, la infección durante el embarazo puede causar aborto espontáneo y defectos congénitos neurológicos graves. El objetivo de este protocolo es detectar rápidamente ZIKV en muestras de humanos y mosquito. El actual estándar de oro para la detección de ZIKV es cuantitativa transcripción reversa PCR (qRT-PCR); amplificación isotérmica mediada lazo de transcripción inversa (RT-LAMP) puede permitir una prueba más eficiente y de bajo costo sin necesidad de equipo costoso. En este estudio, RT-lámpara se utiliza para la detección de ZIKV en diversas muestras biológicas dentro de 30 minutos, sin primero aislar el RNA de la muestra. Esta técnica se demostró usando ZIKV infectados en suero y orina de pacientes e infectados muestras de mosquitos. Ácido ribonucleico ribosomal de 18S y actina se utilizan como controles en muestras de humanos y mosquito, respectivamente.

Las reacciones de RT-LAMP pueden analizarse utilizando tres métodos diferentes. En primer lugar, con la adición de un colorante fluorescente de ácidos nucleicos, reacciones positivas será color amarillo/verde que reacciones negativas aparece naranja en color a simple vista. En segundo lugar, la adición de colorante fluorescente de ácidos nucleicos a la reacción de RT-lámpara produce una señal fluorescente cuando las muestras son excitadas por la luz UV. Las reacciones negativas no tendrá ...

Este protocolo proporciona un método eficiente y de bajo costo para detectar virus Zika o controlar objetivos en muestras de suero y orina humanas o en mosquitos por amplificación isotérmica mediada lazo de transcripción inversa (RT-LAMP). Este método no requiere aislamiento de RNA y se puede hacer dentro de 30 minutos.

Revertir el ensayo de amplificación isotérmica mediada por el lazo de transcripción (RT-LAMP) para el Virus Zika y Housekeeping Genes en muestras de mosquitos, suero y orina

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Este método puede determinar rápidamente si las muestras contienen el virus del Zika. Esto es útil para las mujeres embarazadas, las parejas que intentan concebir o la vigilancia de las poblaciones locales de mosquitos que están en riesgo de infección por Zika. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, fácil, no requiere equipos costosos y se puede hacer sin un paso de aislamiento de ARN.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de la infección por Zika, porque la infección durante el embarazo está relacionada con el aborto espontáneo, el mortinato y otros defectos congénitos neurológicos graves. Aunque este método puede proporcionar información sobre el zika, también se puede aplicar a otras enfermedades infecciosas como el dengue, el chikungunya o el virus del Nilo Occidental mediante el uso de imprimaciones específicas del virus. Para comenzar, reconstituir cada imprimación RT-LAMP en agua de grado molecular a una concentración final de 100 micromolares.Vórtice brevemente la solución de imprimación para garantizar que la solución sea homogénea. Centrifugar durante unos cinco segundos a la velocidad máxima para recoger la solución de imprimación. A continuación, prepare una mezcla de imprimación RT-LAMP de 10x como se describe en la tabla dos del protocolo de la tecnología.Vórtice brevemente para asegurar la homogeneidad. Y centrifugar brevemente a la máxima velocidad para evitar cualquier pérdida. Almacene las imprimaciones a menos 20 grados centígrados, entre usos, evitando cualquier ciclo de congelación y descongelación.Para muestras de orina humanas, utilice orina fresca, orina congelada u orina en conservantes. Descongelar cualquier muestra congelada en hielo antes de su uso. Las muestras de suero humano deben ser frescas o congeladas, mientras que las líneas celulares infectadas por ZIKV deben contener medios condicionados o lysates celulares.Por último, para los mosquitos Aedes aegypti, utilice cadáveres enteros, ya sea frescos o congelados. Descongelar los cadáveres de mosquitos congelados sobre hielo. Coloque un mosquito individual en 100 microlitros de PBS.Usando una punta de pipeta P10 aplastar al mosquito 10 veces, y homogeneizarlo para crear un lysate crudo mosquito. Centrifugar brevemente el izado crudo para peletizar cualquier escombro y utilizar el sobrenadante para el análisis RT-LAMP aguas abajo. Para comenzar, prepare una reacción de mezcla maestra RT-LAMP sobre hielo para cada conjunto de imprimación que se va a utilizar, como se describe en la tabla tres en el protocolo de la tecnología.Vórtice cada muestra para asegurar que está bien mezclado. A continuación, gire brevemente hacia abajo para evitar la pérdida de volumen. Para cada reacción, pipetear 23,0 microlitros de la mezcla maestra RT-LAMP en un tubo PCR de 200 microlitros.A continuación, agregue dos microlitros de muestra para llevar el volumen total a 25,0 microlitros. Use agua de grado molecular para el control negativo y asegúrese de incluir un control positivo. Opcionalmente, incluya una reacción de control de especificidad de un arbovirus relacionado como el virus del dengue, como se describe en el protocolo de la tecnología.Usando un bloque de calor, un baño de agua o un termociclo, caliente las muestras a 61 grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, aumente el calor a 80 grados Celsius durante 10 minutos para desactivar el calor de la polimerasa. Realice el análisis RT-LAMP en un espacio cerrado separado.Diluir el colorante de ácido nucleico fluorescente de uno a diez en tampón TAE. Añadir dos micorlitros de la solución de tinte de ácido nucleico fluorescente a 12 micorlitros de la reacción RT-LAMP. Evalúe visualmente las reacciones RT-LAMP buscando la presencia de un cambio de color.Opcionalmente, utilice una cámara para tomar fotografías de las reacciones RT-LAMP sobre un fondo blanco. A continuación, coloque las muestras bajo una luz UV de 302 nanómetros para confirmar la presencia de productos RT-LAMP por fluorescencia. Utilice una cámara para tomar una foto del resultado.Para comenzar a realizar electroforesis verter 2%agarosa gel en 1x Tampón TAE con una mancha de ácido nucleico para la visualización. Añadir cinco microlitros de una escalera de ADN en el primer carril para comparar los pesos moleculares. Para cada reacción RT-LAMP, mezcle 13 microlitros de mezcla de reacción RT-LAMP con dos microlitros de tinte de carga de ADN.Cargue esta mezcla de 15 microlitrotros. Ejecute el gel a 90 voltios durante 90 minutos o hasta que las bandas estén separadas. Una imagen con luz UV de 302 nanómetros.Cuando haya terminado, deseche las reacciones RT-LAMP en bolsas dobles selladas. En este estudio, se utilizan tres métodos diferentes para analizar las reacciones RT-LAMP. Cuando se utiliza ácido nucleico fluorescente, las reacciones positivas se convierten en amarillo-verde en color, mientras que las reacciones negativas aparecen de color naranja.Este tinte también da como resultado una señal fluorescente cuando las muestras son excitados por la luz UV. Por último, las reacciones RT-LAMP se pueden agotar con un gel de agarosa. Las reacciones positivas RT-LAMP tendrán un patrón de bandas, mientras que las reacciones negativas no tendrán bandas de ADN.Estos métodos se utilizan para demostrar la especificidad de la reacción ZIKV RT-LAMP. Sólo el control molecular de ZIKV tiene una reacción RT-LAMP positiva. Además, mientras que el ZIKV se detecta tanto en la orina como en el suero de un paciente con infección conocida por el VIRUSKK, no se observa en el paciente de control asintomático sin infección por ZIKV.A continuación, las muestras se analizan en busca de rRNA humana 18S. Sólo las muestras tomadas de los pacientes se consideran positivas para el RRNA 18S. Las muestras de mosquitos se pueden probar de forma similar para ZIKV o el control de calidad RT-LAMP AEDAE.Sólo el control molecular positivo para el ZIKV y el mosquito infectado con ZIKV se considera positivo para el ZIKV. Sin embargo, todos los mosquitos son positivos para AEDAE por RT-LAMP. Una vez masterada, esta técnica se puede hacer en menos de 30 minutos si se realiza correctamente.Es importante recordar que las reacciones RT-LAMP son propensas a reacciones falsas positivas. Los pasos de prevención incluyen el uso de una glicosilasa del ADN uracicida termolaces en las reacciones, el uso de un flujo de trabajo lateral, la realización de análisis en un espacio separado y la reducción del tiempo después de que los tubos de amplificación estén abiertos. Siguiendo este procedimiento se pueden realizar otros métodos como QPCR para responder preguntas adicionales, como cuántas copias el virus, u otros objetivos, están presentes en la muestra.Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo utilizar RT-LAMP para detectar el virus del Zika y controles de destino en la orina humana y el suero, así como mosquitos. No olvide que trabajar con el virus del Zika y la mancha de ácido nucleico puede ser extremadamente peligroso, y las precauciones como el uso de guantes siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento. Dada la asociación de la infección por el virus del Zika con anomalías congénitas, las mujeres que están embarazadas, tratando de concebir o parejas de estas mujeres, deben minimizar significativamente su exposición de laboratorio al virus del Zika.

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Este video muestra un método cuantitativo para detectar infecciones virales utilizando PCR con transcripción inversa en tiempo real. El paso de transcripción inversa convierte el ARN en ADNc, que luego se amplifica a través de ciclos de PCR. La presencia de ARN viral en la muestra se confirma mediante el análisis de las curvas de amplificación y disociación del ADN obtenidas de la PCR.

PCR cuantitativa con transcripción inversa en tiempo real para el diagnóstico de infecciones virales

El virus del Zika (ZIKV), un patógeno emergente, está relacionado con anomalías del desarrollo fetal y microcefalia. El establecimiento de un sistema eficaz de cultivo de células infecciosas es crucial para los estudios de replicación del ZIKV, así como para el desarrollo de vacunas y fármacos. En este estudio, se ilustran y discuten varios ensayos virológicos relacionados con el ZIKV.

Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em&gt; In Vitro</em&gt; Profiláctica Efecto de los interferones

Corriente de multiplexado de diagnóstico para detectar los Zika, chikungunya y dengue virus requieren preparación compleja y costosa instrumentación y son difíciles de usar en entornos de bajos recursos. Se muestra un diagnóstico que utiliza amplificación isotérmica con sondas desplazable filamento blanco específico para detectar y diferenciar estos virus con alta sensibilidad y especificidad.

La amplificación isotérmica multiplexada basado en plataforma de diagnóstico para detectar Zika, Chikungunya y Dengue 1

Para el eficiente control de mosquito transmitidas por transmisión del virus, el conocimiento del potencial vector de mosquitos respectivos es de particular interés. Describimos la salivación forzada como un método para analizar la competencia vectorial de Aedes albopictus y tres taxones diferentes de Culex para la transmisión del virus Zika.

Forzado de la salivación como un método para analizar la competencia de vectores de mosquitos

Se describe un método para evaluar el efecto de la inmunidad preexistente contra el virus del dengue en la infección del virus Zika mediante el uso de suero humano, las células humanas primarias y cuantificación de la infección por reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real.

Cuantificación de estimulación dependiente de los anticuerpos del Virus Zika en células humanas primarias

El protocolo presentado puede determinar la competencia vectorial de las poblaciones de mosquitos Aedes aegypti para un virus determinado, como el Zika, en un entorno de contención.

Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

En este trabajo, describimos los protocolos utilizados en los ensayos basados en replicon y en enzimas virales para detectar inhibidores de la replicación del virus del Zika en un formato de detección de alto rendimiento.

Ensayos antivirales de alto rendimiento para detectar inhibidores de la replicación del virus del Zika

El acceso a diagnósticos descentralizados, de bajo costo y de alta capacidad que se pueden implementar en la comunidad para realizar pruebas descentralizadas es fundamental para combatir las crisis sanitarias mundiales. Este manuscrito describe cómo construir diagnósticos en papel para secuencias de ARN viral que se pueden detectar con un lector óptico portátil.

Estudio de diseño a implementación para el desarrollo y validación de pacientes de diagnósticos de interruptores de punto de apoyo basados en papel

Aquí presentamos un protocolo que facilita la caracterización funcional de rendimiento medio a alto de construcciones de genes y promotores en tejido de tallo secundario de árbol dentro de marcos de tiempo comparativamente cortos. Es eficiente, fácil de usar y ampliamente aplicable a una variedad de especies de árboles.

El uso de Inducida somática Análisis del Sector (ISSA) para el estudio de genes y promotores implicados en la formación de la madera y el desarrollo del tallo Secundaria

la muerte de las células β de los islotes precede al desarrollo de la diabetes tipo 1, y la detección de este proceso puede permitir una intervención terapéutica temprana. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de cómo medir las especies de ADN INS metiladas diferencialmente en suero humano como biomarcador de la muerte celular β.

Medición de diferencialmente metilado<em&gt; INS</em&gt; Especies de ADN en muestras de suero humano como un biomarcador de la muerte celular de islotes β

Aprende a detectar el virus Zika mediante RT-LAMP en orina, suero y mosquitos Aedes aegypti sin necesidad de aislamiento de ARN. Este método rápido de 30 minutos facilita el diagnóstico en salud reproductiva y vigilancia epidemiológica.

Revertir el ensayo de amplificación isotérmica mediada por el lazo de transcripción (RT-LAMP) para el Virus Zika y Housekeeping Genes en muestras de mosquitos, suero y orina (Video) | JoVE Journal

Revertir el ensayo de amplificación isotérmica mediada por el lazo de transcripción (RT-LAMP) para el Virus Zika y Housekeeping Genes en muestras de mosquitos, suero y orina

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