Revertir el ensayo de amplificación isotérmica mediada por el lazo de transcripción (RT-LAMP) para el Virus Zika y Housekeeping Genes en muestras de mosquitos, suero y orina

Este método puede determinar rápidamente si las muestras contienen el virus del Zika. Esto es útil para las mujeres embarazadas, las parejas que intentan concebir o la vigilancia de las poblaciones locales de mosquitos que están en riesgo de infección por Zika. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, fácil, no requiere equipos costosos y se puede hacer sin un paso de aislamiento de ARN.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de la infección por Zika, porque la infección durante el embarazo está relacionada con el aborto espontáneo, el mortinato y otros defectos congénitos neurológicos graves. Aunque este método puede proporcionar información sobre el zika, también se puede aplicar a otras enfermedades infecciosas como el dengue, el chikungunya o el virus del Nilo Occidental mediante el uso de imprimaciones específicas del virus. Para comenzar, reconstituir cada imprimación RT-LAMP en agua de grado molecular a una concentración final de 100 micromolares.

Vórtice brevemente la solución de imprimación para garantizar que la solución sea homogénea. Centrifugar durante unos cinco segundos a la velocidad máxima para recoger la solución de imprimación. A continuación, prepare una mezcla de imprimación RT-LAMP de 10x como se describe en la tabla dos del protocolo de la tecnología.

Vórtice brevemente para asegurar la homogeneidad. Y centrifugar brevemente a la máxima velocidad para evitar cualquier pérdida. Almacene las imprimaciones a menos 20 grados centígrados, entre usos, evitando cualquier ciclo de congelación y descongelación.

Para muestras de orina humanas, utilice orina fresca, orina congelada u orina en conservantes. Descongelar cualquier muestra congelada en hielo antes de su uso. Las muestras de suero humano deben ser frescas o congeladas, mientras que las líneas celulares infectadas por ZIKV deben contener medios condicionados o lysates celulares.

Por último, para los mosquitos Aedes aegypti, utilice cadáveres enteros, ya sea frescos o congelados. Descongelar los cadáveres de mosquitos congelados sobre hielo. Coloque un mosquito individual en 100 microlitros de PBS.

Usando una punta de pipeta P10 aplastar al mosquito 10 veces, y homogeneizarlo para crear un lysate crudo mosquito. Centrifugar brevemente el izado crudo para peletizar cualquier escombro y utilizar el sobrenadante para el análisis RT-LAMP aguas abajo. Para comenzar, prepare una reacción de mezcla maestra RT-LAMP sobre hielo para cada conjunto de imprimación que se va a utilizar, como se describe en la tabla tres en el protocolo de la tecnología.

Vórtice cada muestra para asegurar que está bien mezclado. A continuación, gire brevemente hacia abajo para evitar la pérdida de volumen. Para cada reacción, pipetear 23,0 microlitros de la mezcla maestra RT-LAMP en un tubo PCR de 200 microlitros.

A continuación, agregue dos microlitros de muestra para llevar el volumen total a 25,0 microlitros. Use agua de grado molecular para el control negativo y asegúrese de incluir un control positivo. Opcionalmente, incluya una reacción de control de especificidad de un arbovirus relacionado como el virus del dengue, como se describe en el protocolo de la tecnología.

Usando un bloque de calor, un baño de agua o un termociclo, caliente las muestras a 61 grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, aumente el calor a 80 grados Celsius durante 10 minutos para desactivar el calor de la polimerasa. Realice el análisis RT-LAMP en un espacio cerrado separado.

Diluir el colorante de ácido nucleico fluorescente de uno a diez en tampón TAE. Añadir dos micorlitros de la solución de tinte de ácido nucleico fluorescente a 12 micorlitros de la reacción RT-LAMP. Evalúe visualmente las reacciones RT-LAMP buscando la presencia de un cambio de color.

Opcionalmente, utilice una cámara para tomar fotografías de las reacciones RT-LAMP sobre un fondo blanco. A continuación, coloque las muestras bajo una luz UV de 302 nanómetros para confirmar la presencia de productos RT-LAMP por fluorescencia. Utilice una cámara para tomar una foto del resultado.

Para comenzar a realizar electroforesis verter 2%agarosa gel en 1x Tampón TAE con una mancha de ácido nucleico para la visualización. Añadir cinco microlitros de una escalera de ADN en el primer carril para comparar los pesos moleculares. Para cada reacción RT-LAMP, mezcle 13 microlitros de mezcla de reacción RT-LAMP con dos microlitros de tinte de carga de ADN.

Cargue esta mezcla de 15 microlitrotros. Ejecute el gel a 90 voltios durante 90 minutos o hasta que las bandas estén separadas. Una imagen con luz UV de 302 nanómetros.

Cuando haya terminado, deseche las reacciones RT-LAMP en bolsas dobles selladas. En este estudio, se utilizan tres métodos diferentes para analizar las reacciones RT-LAMP. Cuando se utiliza ácido nucleico fluorescente, las reacciones positivas se convierten en amarillo-verde en color, mientras que las reacciones negativas aparecen de color naranja.

Este tinte también da como resultado una señal fluorescente cuando las muestras son excitados por la luz UV. Por último, las reacciones RT-LAMP se pueden agotar con un gel de agarosa. Las reacciones positivas RT-LAMP tendrán un patrón de bandas, mientras que las reacciones negativas no tendrán bandas de ADN.

Estos métodos se utilizan para demostrar la especificidad de la reacción ZIKV RT-LAMP. Sólo el control molecular de ZIKV tiene una reacción RT-LAMP positiva. Además, mientras que el ZIKV se detecta tanto en la orina como en el suero de un paciente con infección conocida por el VIRUSKK, no se observa en el paciente de control asintomático sin infección por ZIKV.

A continuación, las muestras se analizan en busca de rRNA humana 18S. Sólo las muestras tomadas de los pacientes se consideran positivas para el RRNA 18S. Las muestras de mosquitos se pueden probar de forma similar para ZIKV o el control de calidad RT-LAMP AEDAE.

Sólo el control molecular positivo para el ZIKV y el mosquito infectado con ZIKV se considera positivo para el ZIKV. Sin embargo, todos los mosquitos son positivos para AEDAE por RT-LAMP. Una vez masterada, esta técnica se puede hacer en menos de 30 minutos si se realiza correctamente.

Es importante recordar que las reacciones RT-LAMP son propensas a reacciones falsas positivas. Los pasos de prevención incluyen el uso de una glicosilasa del ADN uracicida termolaces en las reacciones, el uso de un flujo de trabajo lateral, la realización de análisis en un espacio separado y la reducción del tiempo después de que los tubos de amplificación estén abiertos. Siguiendo este procedimiento se pueden realizar otros métodos como QPCR para responder preguntas adicionales, como cuántas copias el virus, u otros objetivos, están presentes en la muestra.

Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo utilizar RT-LAMP para detectar el virus del Zika y controles de destino en la orina humana y el suero, así como mosquitos. No olvide que trabajar con el virus del Zika y la mancha de ácido nucleico puede ser extremadamente peligroso, y las precauciones como el uso de guantes siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento. Dada la asociación de la infección por el virus del Zika con anomalías congénitas, las mujeres que están embarazadas, tratando de concebir o parejas de estas mujeres, deben minimizar significativamente su exposición de laboratorio al virus del Zika.