Name: Reglamento de vía señalización innata mieloide por MALT1 Paracaspase actividad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprende a analizar vías de señalización en células mieloides humanas y murinas usando inhibidores selectivos de MALT1. Este método permite estudiar la regulación de citoquinas en respuestas inmunes innatas.

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Damos las gracias a Elsevier para su autorización (número de licencia 4334770630127) reproducir aquí figura 2A de Unterreiner et al. (2017).

Experimentos se realizaron según las pautas y normas de la Comisión de ética de investigación humana Novartis.
1. preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de escudos humanos de Buffy
Nota: Hemos recibido buffy coats de voluntarios sanos un día después de la recolección en bolsas de 50 mL. Estaban siempre bajo consentimiento informado y recogidos a través del Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz. Manejamos utilizando el procedimiento a continuación, a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario.
<ol><li>Preparar un par de tijeras y un vaso de precipitados de 1 L con una bolsa de plástico (bajo flujo lamina) estéril y limpio.</li>
	<li>Transferir la capa buffy en el vaso y abra cuidadosamente con las tijeras.</li>
	<li>Utilizando una pipeta de 25 mL, añadir 100 mL de tampón fosfato salina tampón/dihidratada del ácido (PBS/EDTA: pH de 1 x PBS 7.4 que contiene no de CaCl2 y no de MgCl2, suplementado con 2 mM pH 8.0 de EDTA). Nota: Con la misma pipeta y después lentamente pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo, dispensar 25 mL de la capa anteada diluida en 6 tubos de centrífuga cónico de 50 mL previamente llenado con 15 mL de gradiente de densidad base de polisacárido.</li>
	<li>Centrifugar 20 min a 800 x g (establecido en 4 de 9) la aceleración moderada y sin freno para permitir la separación de las células que se basa en sus densidades. Nota: Después de la centrifugación, tres capas serán visibles; un pellet que contiene eritrocitos y granulocitos, una capa superior de plasma, y entre un círculo blanco que contiene las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs).</li>
	<li>Cosecha el anillo PBMC con una pipeta de 10 mL y transferencia a nuevos tubos de 50 mL. Nota: Tubos de 50 mL dos o tres son normalmente requeridos por la capa anteada. En esta etapa, algunos plasma probable contamina las PBMCs recogidos, que no deben influir en los pasos de enriquecimiento posterior.</li>
	<li>Superior a 50 mL de cada tubo con PBS/EDTA y proceder a tres lavados sucesivos con la disminución de velocidad (15 min a 520 x g, 10 min a x 330 g, 8 minutos a 150 x g) y tiempo de centrifugación. Nota: En cada paso, el sobrenadante se vierte de un recipiente de desechos líquidos y el precipitado celular se resuspendió en 50 mL de PBS/EDTA (pellets pueden combinarse después del primer lavado).</li>
	<li>Después del último lavado, Resuspender el precipitado en 25 mL de un tampón de lisis helada (véase Tabla de materiales) para lisar los glóbulos rojos por presión osmótica.</li>
	<li>Incubar hasta que la solución llega a estar clara (≤5 min a temperatura ambiente).</li>
	<li>Detener la reacción añadiendo 25 mL de buffer de separación (PBS 1 x pH 7.4, que contiene no CaCl2 y no MgCl2, suplementado con 2% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) y 1 mM EDTA pH 8.0).</li>
	<li>Lavar una vez más a 150 x g durante 8 minutos. Nota: En esta etapa PBMCs pueden ser utilizados como una población a granel (consulte el paso 3: tratamientos PBMCs y monocitos y condiciones estimulantes) o procesado para el enriquecimiento de monocitos (consulte el paso 2: preparación de monocitos de PBMCs), o congelado abajo para su uso posterior (ver paso 5: Monocitos y PBMCs procedimientos de congelación/descongelación).</li>
</ol>2. preparación de monocitos de PBMCs
<ol><li>Suspender las PBMCs obtenidos paso 1.10 en tampón de separación y contarlos para llegar a 5 x 107células/mL.</li>
	<li>Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga cónico de 14 mL con tapa.</li>
	<li>Añadir 50 μl de anticuerpo de enriquecimiento monocito cóctel por cada mL de suspensión celular, vortex e incubar 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Añadir 50 μl de granos de enriquecimiento del monocito de células por mL. Nota: Los granos deben ser bien agitarse para asegurar la homogeneidad de la suspensión.</li>
	<li>Después de agregar las cuentas del vórtice poco la suspensión de células e incubar 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Enjuague la parte superior del tubo con tampón de separación hasta que el tubo se llena hasta 10 mL.</li>
	<li>Mezcle lentamente la solución mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
	<li>Coloque el tubo sin la tapa en un imán de separación.</li>
	<li>Incubar durante 2,5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Vierta lentamente en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL.</li>
	<li>En esta fase, utilizar monocitos directamente (consulte el paso 3: tratamientos de PBMCs y monocitos y condiciones estimulantes) o diferenciar en mmature Monocyte-derivado Dendritic Cells (iMoDCs) (ver paso 4), o congelarlas abajo para su uso posterior (ver paso 5).</li>
</ol>3. PBMCs y monocitos tratamientos y condiciones estimulantes
<ol><li>Contar las células y diluir en medio de cultivo (medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 10% FBS 1 mM de piruvato de sodio + 100 U/mL penicilina estreptomicina (Pen/Strep) + μm 5 β-mercaptoetanol), hasta 1,25 x 104 células/pocillo.</li>
	<li>Distribuir 30 μl de suspensión de células por pocillo de una placa de 384 pozos.</li>
	<li>Añadir 15 μl de 4 x soluciones concentradas de compuestos y los incuban durante 1 h a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Añadir lipopolysaccharide (LPS) a una concentración final de 10 ng/mL, agotado zymosan (DZ) a una concentración final de 100 μg/mL o mantener en llano medio.</li>
	<li>Incubar durante una noche a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Tomar 10 μl del sobrenadante para medir los niveles de TNF-a secretada (consulte el paso 7: medición de citoquinas y viabilidad).</li>
</ol>4. monocitos diferenciación en condiciones estimulantes y iMoDCs
<ol><li>Cuenta de monocitos (enriquecidos en el paso 2) y Centrifugue la suspensión de células a 520 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Pipeta del sobrenadante y agregar medio de cultivo (RPMI + 10% FBS para obtener una suspensión final de 0,4 x 106 células/mL.</li>
	<li>Añadir 80 ng/mL recombinante humano IL-4 + 100 ng/mL GM-CSF.</li>
	<li>Pipetear 5 mL de suspensión de células por pocillo en una placa de 6 pozos.</li>
	<li>Incubar 7 días a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>En el día 7, cosechar las células pipeteando suavemente para evitar su activación.</li>
	<li>Centrifugar a 520 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Aspiración al vacío y resuspender en 50 mL de medio de cultivo sin factores de crecimiento.</li>
	<li>Centrifugue a 520 x g durante 5 min y resuspender en 1 x 106 células/mL en medio de cultivo.</li>
	<li>Añada 100 μl de suspensión celular (105 células) por pocillo de una placa de fondo plano de 96 pozos.</li>
	<li>Pre-incubate por 1 h a 37 ° C después de añadir 50 μl de 4 x concentrado compuestas soluciones, preparadas como se describe en el paso 8: preparación de los compuestos.</li>
	<li>Añadir 50 μl de estímulos (4 x concentrado), preparado como se describe en el paso 9.</li>
	<li>Incubar 24 h a 37 ° C.</li>
	<li>Mezclar cada bien y la transferencia de células y sobrenadante (SN) en una placa de 96 pocillos fondo V.</li>
	<li>Desactivación a 475 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un nuevo plato de fondo plano de 96 pozos, sellar y congelar a-20 ° C hasta su uso posterior.</li>
</ol>5. monocitos y PBMCs procedimientos de congelación/descongelación
<ol><li>
Congelación
	<ol>
<li>Desactivación de PBMC o monocito preparaciones celulares a 520 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en congelación medio 1 x 107 células/ml.</li>
		<li>Dispensar 1 mL de la suspensión celular en criotubos, los tubos de transferencia a un dispositivo de enfriamiento específico (ver la tabla de materiales) y a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
El deshelar
	<ol>
<li>El criotubo de descongelar y transferir rápidamente su contenido en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL que contiene 9 mL de medio de cultivo.</li>
		<li>Centrifugar a 520 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Aspirar aspirar sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 5 mL de medio de cultivo. Las células están listas para más procesamiento experimental.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. células de bazo de ratón preparación y tratamiento
Nota: Llevamos a cabo los sacrificios de animales según las directrices y normas de la organización de Bienestar Animal de Novartis. Los estudios fueron aprobados por el Comité de ética de la autoridad gubernamental regional (los Kantonales Veterinäramt der Stadt Basel). Sacrificaban animales por exposición excesiva de isoflurano, con todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
<ol><li>El bazo de la cosecha y disociar tejido utilizando un tubo equipado con un dispositivo de amoladora mecánica del tejido y llena con 5 mL de Medio RPMI frío.</li>
	<li>Utilizar el programa de la bazo de la máquina de disociación para moler los órganos.</li>
	<li>Filtro de las células a través de un tamiz de 100 mm nylon celular.</li>
	<li>Transferir la suspensión a tubos de 50 mL y centrifugar a 4 ° C por 10 min a x 320 g.</li>
	<li>Vacío Aspire el sobrenadante, Resuspender el precipitado de células en 3 mL de tampón de lisis helada e incubar durante ≤2 minutos en hielo.</li>
	<li>Deje de lisis añadiendo 7 mL de Medio RPMI.</li>
	<li>Filtrar nuevamente a través de un tamiz de celular 100 μm nylon.</li>
	<li>Desactivación de la suspensión celular a 330 x g por 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirar aspirar sobrenadante y resuspender las células en 11 x 106 células/mL en medio completo (RPMI suplementado con 10% FBS, 100 U/mL Pen/paso y 5 μm β-mercaptoetanol).</li>
	<li>Placa de 1 x 106 células/pozo (90 μl) en una placa de 96 pocillos (fondo plano).</li>
	<li>Añadir 5 μl de 20 x concentrado compuesto solución diluida previamente en Medio RPMI como se describe en el paso 8.3: dilución seriada de las células de bazo de ratón.</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Añadir 5 μl de 20 x había concentrado DZ (concentración final de 30 μg/mL) o 20 x concentrado LPS + IFN-g (TLR-4) (concentración final 1 μm LPS y 10 ng/mL IFN-g).</li>
	<li>Incubar durante una noche a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Centrifugar a 330 x g por 10 min.</li>
	<li>Transferencia de sobrenadantes en nuevas placas, sellar y congelar a-20 ° C hasta su uso posterior.</li>
</ol>7. citoquinas y medidas de viabilidad
<ol><li>
Humano TNF-a medida por HTRF (fluorescencia de resueltos de tiempo homogéneo) Nota: El protocolo seguido las recomendaciones del proveedor, que se resume brevemente a continuación.<ol>
<li>Mezclar 1 volumen de reactivo reconstituido (anti TNF a cryptate y anti-TNF-a-XL665) con 19 volúmenes de tampón de reconstitución (50 m m tampón fosfato pH 7.0, 0,8 M fluoruro de potasio (KF), 0.2% albúmina de suero bovino (BSA)).</li>
		<li>Mezclar las dos soluciones de anticuerpo listo para su uso 1:1 antes de la dispensación de los reactivos.</li>
		<li>Dispensar 10 μl de sobrenadante del paso 3.6 en blanco placas de 384 pocillos.</li>
		<li>Dispensar 10 μl de la mezcla de anticuerpos.</li>
		<li>Cubra la placa con un sellador e incubar a 4 ° C durante la noche.</li>
		<li>Lea la placa con un lector de microplacas (50 – 200 flash).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Humana medida de la IL-23 por HTRF (fluorescencia de resueltos de tiempo homogéneo) Nota: El protocolo seguido las recomendaciones del proveedor, que se resume brevemente a continuación.<ol>
<li>Mezclar un volumen de reactivo reconstituido (anti IL-23-cryptate-anticuerpo y anti-IL-23 D2-anticuerpo) con 19 volúmenes de tampón de detección #3.</li>
		<li>Mezclar las dos soluciones de anticuerpo listo para su uso 1:1 antes de la dispensación de los reactivos.</li>
		<li>Dispensar 10 μl de sobrenadante del paso 3.6 en blanco placas de 384 pocillos.</li>
		<li>Dispensar 10 μl de la mezcla de anticuerpos.</li>
		<li>Cubra la placa con un sellador e incubar a 4 ° C durante la noche.</li>
		<li>Lea la placa con un lector de microplacas (flash de 50-200 nm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Humano IL-6, IL-8, IL-1β y TNF-α mediciones por electrochemiluminescence Nota: Todas las muestras se diluyeron en 1/150 en diluyente 2 (primera dilución: 10 μL en 150 μL y 20 μl en 180 μL). El protocolo había seguido las recomendaciones del proveedor:<ol>
<li>Diluir las muestras y el estándar en diluyente 2.</li>
		<li>Proceder a la dilución de la norma en diluyente 2 usando una dilución de 1/4 doblez serial.</li>
		<li>Lavar las placas tres veces con tampón de lavado.</li>
		<li>Dispensar 50 μl de las muestras o estándar por pozo.</li>
		<li>Incubar por 2 h a temperatura ambiente en agitación.</li>
		<li>Lavar el plato cuatro veces con PBS + 0.05% polisorbato 20.</li>
		<li>Añada 25 μl del anticuerpo de detección (60 μL de cada anticuerpo para final de 3 mL) en 3 diluyente.</li>
		<li>Incubar por 2 h a temperatura ambiente en agitación.</li>
		<li>Lavar el plato cuatro veces con PBS + 0.05% polisorbato 20.</li>
		<li>Evitando las burbujas, añadir 150 μL por pocillo de leer buffer (búfer de Tris que contiene tripropylamine, diluido 2 x en ddH20) como un reactivo Co de generación de luz en electrochemiluminescence inmunoensayos.</li>
		<li>Leer la placa (sin demora) en un lector de placas multiplex.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ratón TNF-a medida por ELISA siguiendo el protocolo del proveedor
	<ol>
<li>Diluir 1:1 en diluyente de ensayo (listo para usar que contiene proteína tampón) del sobrenadante.<ol>
<li>Preparación de reactivos, muestras y diluciones estándar como se describe en el kit. Añadir 50 μL de diluyente de ensayo a cada pocillo.</li>
			<li>Añadir 50 μL de estándar, control o muestra por pozo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mezclar golpeando suavemente el marco de la placa durante 1 minuto.</li>
		<li>Cubrir con la cinta adhesiva provista e incubar por 2 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirar cada uno bien y lavar con 400 μL/pozo (Repita este paso cinco veces en total).</li>
		<li>Después del último lavado, eliminar cualquier tampón de lavado restante por aspiración.</li>
		<li>Invertir la placa y luego contra toallas de papel limpias.</li>
		<li>Añada 100 μL de conjugado de ratón TNF-α a cada pocillo. Cubrir con una nueva tira adhesiva.</li>
		<li>Incubar por 2 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Repetir la aspiración/lavado como en el paso 7.4.4.</li>
		<li>Añada 100 μL de solución sustrato a cada pocillo e incubar durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz.</li>
		<li>Añada 100 μL de solución de ácido clorhídrico diluido (solución de parada) a cada pocillo. Golpear suavemente la placa para asegurar una mezcla completa.</li>
		<li>Medir la densidad óptica a 450 nm (con la longitud de onda de corrección a 560 nm) usando un lector de microplacas (a realizar dentro de 30 minutos).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Viabilidad celular
	<ol>
<li>Después de la eliminación de sobrenadantes de preparaciones de PBMC o monocito, evaluar viabilidad celular mediante un listo utilizar solución de resazurina (indicador de oxidación-reducción) añadido directamente a la suspensión de células a concentración final de 10%.</li>
		<li>Incubar durante 1 a 2 h a 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Leer la fluorescencia a 590 nm (excitación 540 nm) usando un lector de microplacas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. preparación de compuestos
<ol><li>
Dilución seriada de iMoDCs
	<ol>
<li>Diluir la solución madre de MLT-827 (10 mM en dimetil sulfóxido (DMSO) en el medio para llegar a 8 μm de una sola vez (4 x concentrado).</li>
		<li>Realizar una dilución seriada de seis pasos 1:5, utilizando medio + 0.08% DMSO. Utilizar el mismo medio + solución de DMSO de 0.08% para el estado del vehículo (no compuesto).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dosis única de prueba para iMoDCs
	<ol>
<li>Diluir las soluciones stock MLT-827, AFN700 y Cpd11 en medio para llegar a 4 μm de una sola vez (4 x concentrado).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dilución seriada de las células de bazo de ratón
	<ol>
<li>Diluir una solución de MLT-827 10 μm (obtenida de una solución stock de 10 mM después de una dilución de ir uno en medio) a 0,01 μm, con una concentración final de DMSO de 0.1%.</li>
		<li>Para los pasos de dilución, tomar 2 μl de cada dilución, añadir 38 μl de RPMI y Pipetee 5 μL en el pozo. Nota: Todos los tratamientos se realizan por triplicado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. estímulos preparación
<ol><li>
Zymosan empobrecido (DZ)
	<ol>
<li>Añadir 2 mL de agua estéril libre de endotoxina a 10 mg de DZ.</li>
		<li>Vortex para homogeneizar la solución, vortex también antes de cada uso.</li>
		<li>Alícuotas alícuotas de la solución y almacenar a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trehalosa-6,6-dibehenate (TDB)
	<ol>
<li>Añadir 100 μl de DMSO a TDB, calor a 60 ° C en un baño de agua durante 15 – 30 s. de 1 mg.</li>
		<li>Vórtice e inmediatamente agregar 900 μl de PBS estéril, vórtice otra vez.</li>
		<li>Calentar durante 10-15 min a 60 ° C y homogeneizar por antes de Vortex cada uso.</li>
		<li>Mantener la solución a 4 ° C.</li>
		<li>Realizar diluciones seriadas y preparación de dosis única como por el compuesto de MLT-827. Nota: Porque TDB necesita estar preparado en DMSO, una concentración final de DMSO 1% está presente durante la estimulación celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo, utilizamos simple configuración experimental para estudiar vías de señalización en humano y ratón células innatas e interrogar su dependencia en la función proteolítica MALT1. Ampliando el anterior trabajo11, nuestro estudio mostró que la actividad de paracaspase MALT1 controla c-tipo lectin-como el receptor inducido por producción de citoquinas, incluyendo el TNF-α. Por el contrario, TLR-4-inducida por el TNF-α fue independiente de MALT1 en ambas especies. Colectivamente, estos d...

La actividad paracaspase de MALT1 (proteína 1 de desplazamiento linfoma mucosa-asociado del tejido linfoide) fue revelada en el 20081,2. Desde entonces, varios estudios han reportado su contribución crítica a las respuestas del receptor de antígeno en los linfocitos. Modelos genéticos en el ratón, así como datos de Farmacología apoyan un papel clave en las células T, autoinmunidad dependiente de células T y células B linfoma configuración3,4. En linfocitos, activación de MALT1 paracaspase ocurre a Asamblea de CARD11-BCL10-MALT1 complejo5, que se activa por antígeno receptor de señalización proximal descendente de los receptores de células T o B. También hay amplia evidencia de que un complejo similar de CARD9-BCL10-MALT1 es importante para la propagación de señales corriente abajo de los receptores de lectina-como de tipo C (CLLR), por ejemplo,, Dectin-1, Dectin-2 y algunos en mieloide de las células6,7. Dectin-1 ha sido particularmente bien estudiada porque esta vía es crítica para la defensa del huésped contra infecciones micóticas8,9. Implicación de MALT1 en vías de Toll-like receptor (TLR), sin embargo, sigue siendo controvertido10. La evidencia reciente en células mieloides humanas descartó un papel directo para MALT1 paracaspase actividad en la regulación de la producción de TNF abajo de TLR-411.
En el presente trabajo, utilizamos varios ajustes experimentales y condiciones estimulantes en humanos y células mieloides ratón para sonda innatas vías de señalización, depender de los inhibidores de la herramienta farmacológica específica y la medición de producción de citoquinas.

<table><tbody><tr><td>100 y micro; m filtro de células de nylon</td><td>Sigma CLS431752</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 mL Tubo Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo</td><td>Falcon Falcon</td><td>352090</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo Falcon</td><td></td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fondo plano de 96 pocillos, con tapa de baja evaporación</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Placa inferior en V de 96 pocillos</td><td>Costar</td><td>734-1798</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio - NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente de ensayo RD1-W ELISA</td><td>R& D</td><td>895038</td><td>Diluyente de ensayo</td></tr><tr><td>Microplaca de cultivo celular, 384 pocillos,</td><td>Greiner</td><td>negro 781986</td><td></td></tr><tr>Zymosan <td>Invivogen</td><td>empobrecido</td><td>tlrl-dzn</td><td>ahora: tlrl-zyd</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>Ácido etilendiaminotetraacético sal disódica dihidratada</td></tr><tr><td>ELISA muTNF-y alfa;</td><td>R& D</td><td>SMTA00</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Tubos C</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS disociador</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Novartis-Heat-inactivated</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>FBS</td></tr><tr><td>HTRF hu IL-23</td><td>CisBio</td><td>62HIL23PEG</td><td></td></tr><tr><td>HTRF hu TNF-&alpha;</td>Tampón de reconstitución <td>CisBio</td><td>62TNFPEC</td><td></td></tr><tr><td>HTRF</td><td>CisBio</td><td>62RB3RDE</td><td>50mM Tampón de fosfato, pH 7,0, 0,8M KF, 0,2% BSA</td></tr><tr><td>IFN-&gamma;</td><td>R& D</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Novartis-Isoflurano</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Abbott</td><td>Forene</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS utilizado en muestras humanas</td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos</td><td>Sigma</td><td>L4516</td><td>LPS utilizado en muestras murinas</td></tr><tr><td>Tampón de lisis</td><td>Fabricación</td><td></td> <td>propia-155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7,4</td></tr><tr><td>Imán</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca, 384 pocillos blanco</td><td>Greiner</td><td>784075</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de monocitos</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1&deg; C Contenedor de congelación</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001 dispositivo de</td><td>enfriamiento (que contiene Propanol-2)</td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td><td>Gibco</td><td>10010</td><td>Solución salina tamponada con fosfato</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Pen/Estreptococo</td></tr><tr><td>Bicarbonato de potasio - KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td>Solución de Resazurin para la evaluación de la viabilidad</td></tr><tr><td>Propanol-2</td><td>Merck</td><td>1.09634</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lectura</td><td>MesoScale Discovery</td><td>R92TC-3</td><td>Tampón a base de Tris que contiene tripropilamina</td></tr><tr><td>Recuperación de células medio de congelación</td><td>Gibco</td><td>12648-010</td><td>Medio de congelación</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medio (RPMI)) con Glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td>+ 10% FBS para iMoDCs + 10% FBS + 1 mM de piruvato de sodio + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &micro; M &beta;-mercaptoetanol para PBMC y monocitos humanos + 10% FBS + Pen/Strep + 5 &micro; M &beta;-mercaptoetanol para esplenocitos murinos</td></tr><tr><td>Tampón de separación</td><td>Hecho por ti</td> <td>mismo-PBS</td> <td>pH 7,4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8,0</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Trehalosa-6,6-dibehenato</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-tdb</td><td>TDB</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Polisorbato 20</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15675</td><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td></tr><tr><td>Sellador Viewseal</td><td>Greiner BioOne</td><td>676070</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX Panel Proinflamatorio 1 Kit Humano</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15049D</td><td>ensayo multiplexado electroquimioluminiscente (IL-1&beta;, TNF-&alpha;, IL-6, IL-8)</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr></tbody></table>

reglamento de vía señalización innata mieloide por malt1 paracaspase actividad

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Además de su función en las células linfoides, que ha sido abordado por numerosos estudios, el paracaspase MALT1 también juega un papel importante en las células naturales aguas abajo de los receptores de reconocimiento de patrón. Mejor estudiados son los Dectin-1 y Dectin-2 miembros de la familia del lectin-como el receptor de tipo C que inducen un dependiente SYK y CARD9 señalización cascada lleva a la activación de NF-κB, en una forma dependiente de MALT1. Por el contrario, receptores tipo Toll (TLR), como TLR-4, propagar la activación de NF-κB pero la señal a través de una cascada de MYD88/IRAK-dependiente. Sin embargo, ha quedado claro si MALT1 podría contribuir a la señalización de TLR-4. Evidencia reciente con MLT-827, un inhibidor potente y selectivo de la actividad de paracaspase de MALT1, indica que TNF-producción aguas abajo de los TLR-4 en células mieloides humanas es independiente de MALT1, en contraposición a la producción de TNF abajo de Dectin-1, que es MALT1 dependiente. Aquí, nos dirigimos a la implicación selectiva de MALT1 en reconocimiento de patrones de detección adicional, usando una variedad de preparaciones celulares de ratón y humanos y estimulación de las vías Dectin-1, algunos o TLR-4. También proporcionamos perspectivas adicionales mediante la exploración de citoquinas más allá de TNF-y comparando MLT-827 a un inhibidor SYK (Cpd11) y un inhibidor de la IKK (AFN700). Colectivamente, los datos que más evidencian de la dependencia MALT1 de lectin-como el receptor tipo C, señalando por el contrario a la señalización de TLR.

En células mieloides, MALT1 retransmite las señales de activación río abajo de varios receptores de lectina-como tipo C, tales como Dectin-1, Dectin-2 y algunos6. Estas vías dependen de receptores que contienen los adorno (hem) ITAM (e.g., Dectin-1) o receptores de cooperación que contienen motivos ITAM (e.g., FcRγ Dectin-2 y algunos) que reclutan y activan la quinasa SYK (figura 1). Esto conduce a la activación de un...

MALT1 regula la inmunidad innata pero cómo esto ocurre sigue siendo mal definida. Utilizamos el inhibidor selectivo de la paracaspase del MALT1 MLT-827 a desentrañar la contribución de MALT1 al innato señalización corriente abajo de los receptores de lectina-como Toll-like o tipo C, demostrando que MALT1 regula la producción de citocinas mieloide y aguas abajo de los receptores de lectina-como de tipo C, selectivamente.

Reglamento de vía señalización innata mieloide por MALT1 Paracaspase actividad

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Así que el objetivo del método en nuestro manuscrito es proporcionar un análisis comparativo de las vías de señalización en células mieloides utilizando sistemas humanos y de ratón. Ayuda a definir qué vía de señalización está implicada aguas abajo de los receptores de reconocimiento de patrones seleccionados. Así que este método es fácil de implementar.Se basa en preparaciones de células primarias y compuestos de referencia validados, que es esencial para el esclareciómiento de los mecanismos de señalización. Demostrar el procedimiento serán Ratiba Touil y Adeline Unterreiner, respectivamente científica y asociada de investigación en nuestro grupo. En una capucha de flujo laminar estableció un par de tijeras estériles, un vaso de precipitados de un litro y una bolsa de plástico.Coloque la capa buffy previamente obtenida en el vaso de precipitados y use las tijeras para abrirla cuidadosamente. Usando una pipeta de 25 mm añadir 100 ml de PBS complementado con 2 milimolar de EDTA. Mezclar en pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo.Y luego transferir 25 ml de la capa de buffy diluida en seis tubos de centrífuga cónica de 50 ml que han sido precargados con 15 ml de gradiente de densidad basado en polisacárido. Centrifugar los tubos durante 20 minutos a 800 g con una aceleración moderada sin la rotura para permitir la separación de las células en función de sus densidades. Después de la centrifugación se verán tres capas, un gránulo que contiene glóbulos rojos y granulocitos, una capa superior hecha de plasma, y un anillo blanco que contiene células mononucleares de sangre periférica.Utilice una pipeta de 10 ml para cosechar los anillos PBMC y transferirlos a un nuevo tubo de 50 ml. Recarga con PBS y EDTA. Realice tres lavados sucesivos con disminución del tiempo de centrifugación y la velocidad como se describe en el protocolo de texto.Después del lavado final, resuspender el pellet en 25 ml de tampón de lyis helada para la lyse los glóbulos rojos por presión osmótica. Incubar la solución a temperatura ambiente hasta que quede clara. A continuación, añadir 25 ml de tampón de separación para detener la reacción.Centrifugar a 150 g durante ocho minutos para lavar la solución. Vierta el sobrenadante y resusppend el pellet con tampón de separación. Después de contar las células, diluirlas en medio de cultivo hasta 12.500 células por pozo.Distribuir 30 ml de esta suspensión celular en cada pozo de una placa de 384 pozos. A continuación, añada 15 microlitros de cuatro soluciones compuestas concentradas a cada pozo y preincubate la placa a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante una hora. Si lo desea, añada LPS a la concentración final de 1 ng por ml o Zymosan agotado a una concentración final de 100 mcg por ml.Luego incubar la placa durante la noche a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente tomar 10 microlitros del sobrenadante para medir los niveles alfa de TNF secretados. Para iniciar la dilución en serie, diluya la solución de stock MLT-827 con una concentración media para alcanzar una concentración de 8 micromolares de una sola vez.Realice una dilución en serie de seis pasos 1:5 utilizando el medio con 0.08%DMSO. Para prepararse para pruebas de dosis únicas, diluya las soluciones de stock MLT-827, AFN700 y compuesto 11 con medio para alcanzar una concentración de 4 micromolares de una sola vez. En primer lugar, añadir 2 ml de agua estéril libre de endotoxinas a 10 mg de Zymosan agotado.Vortex esta solución de stock para homogeneizarlo. Aliquot la solución y luego almacenar las alícuotas a 20 grados Celsius. En este estudio, los PBMC humanos y las células del bazo de ratón se estimulan con Zymosan agotado, un agonista Dectina-1, o lipopolisacárido, un agonista TL4.La liberación alfa NTNF en el sobrenadante se mide después de 20 horas. En los ensayos humano y ratón, el compuesto MLT-827 bloquea selectivamente la producción alfa TNF impulsada por la vía Dectin-1, pero no por la vía TLR4. En monocitos estimulados con LPS, la producción de TNF alfa es casi completamente abrogada por AFN700 pero no es sensible a Cpd11, que es consistente con la dependencia de la vía TLR4 de la actividad NF-kappa B y su independencia en la actividad siC.En contraste, la producción alfa TNF impulsada por Dectin-1 y MODC muestra sensibilidad a MLT-827, AFN700 y Cpd11. Esto proporciona más evidencia para la participación de una cascada de señalización SIC CBM en la vía Dectin-1. La producción de IL-1 beta, IL-6 e IL-23 también es sensible a los tres inhibidores, lo que indica mecanismos reguladores similares al alfa TNF.Sin embargo, el efecto limitado observado en la producción de IL-8 sugiere que esta citoquina tiene un mecanismo regulatorio distinto. Aumentar las concentraciones de trehalosa-dibehenate por encima de 50 mcg por ml conduce a la producción de TNF alfa, IL-6 e IL-1 beta, que se basaron en la actividad de paracaspacse MALT1 de acuerdo con el efecto de bloqueo de MLT-827. Se observaron resultados similares al desafiar a los MODC con concentraciones crecientes de Zymosan agotado para estimular la Dectina-1.Este método hizo posible demostrar que la paracaspacse MALT1 regula selectivamente la señalización del receptor similar a la lectina de tipo C. Es esencial utilizar compuestos de referencia bien caracterizados. Preste atención al procedimiento para la dilución de soluciones de stock.Esto es crítico para compuestos con solubilidad limitada.

myeloid-innate-signaling-pathway-regulation-malt1-paracaspase

Research

Investigación

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Biology

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El ensayo sialidasa es un enfoque simple técnica que dilucidar nuevo mecanismo molecular (s) de los sensores de TLR de las infecciones microbianas y la participación en las enfermedades inflamatorias a nivel del receptor en la superficie celular de los macrófagos en vivo.

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Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Divulgamos los métodos para la caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en necroptosis incluyendo proyección de imagen de la microscopia convencional y confocal de células vivas, análisis de microscopia electrónica y enlace de lípidos basada en NMR.

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Visualización de la proximidad inducida por caspasas inflamatorias en macrófagos derivados de monocitos humanos

Este protocolo describe un método integral para evaluar la activación de caspasas (caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-11) en respuesta a modelos de infección, insultos estériles y cáncer tanto in vitro como in vivo (en ratones) para determinar el inicio de vías de muerte celular, como piroptosis, apoptosis, necroptosis y PANoptosis.

Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

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Aquí, se describe un método basado en citometría de fosfoflujo para analizar la señalización aguas abajo de las vías mTORC1, JAK/STAT5 y MAPK en células de leucemia mieloide humana aguda xenoinjertadas en ratones y obtenidas de aspirados de médula ósea. Los niveles de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 y p-ERK1/2 se miden simultáneamente utilizando un citómetro de flujo espectral de última generación con alta sensibilidad.

Citometría de fosfoflujo intracelular de xenotrasplantes derivados de pacientes con leucemia mieloide aguda

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Reglamento de vía señalización innata mieloide por MALT1 Paracaspase actividad

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