Name: Generación de nanoliposomas catiónicos para la entrega eficiente de In Vitro transcribe ARN mensajero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a generar nanoliposomas catiónicos mediante el método de película seca para la entrega eficiente de ARN mensajero in vitro transcrito. Esta técnica mejora la captación de mRNA en células y aumenta la expresión de proteínas sin comprometer la viabilidad celular.

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1. generación de nanoliposomas catiónico (figura 1)
<ol><li>Disolver los lípidos colesterol DC (3β-[-(N′,N′-dimethylaminoethane) de N-Carbamoil] colesterol clorhidrato) y DOPE (dioleoyl fosfatidiletanolamina), entregado en forma de polvo, en cloroformo para obtener una concentración final de 25 mg/mL. Nota: Almacenar los lípidos disueltos a-20 ° C.</li>
	<li>Trabajar con 25 mg/mL de solución stock de ambos lípidos. Mix 40 μl de la DC-colesterol disuelto y 80 μl de la droga disuelta en un frasco de vidrio. Nota: La cantidad total de lípidos es de 3 mg. Para evitar la evaporación rápida del cloroformo, coloque los lípidos en hielo durante el pipeteo.</li>
	<li>Evaporar el cloroformo durante 15 min bajo un flujo de gas argón. Posteriormente, llene un desecador con gel de silicona, coloque el frasco de cristal abierto dentro y aplicar un vacío durante la noche para asegurarse de que se evapora el cloroformo restante, y una película lipídica está formada dentro del frasco de vidrio. Nota: Trabajo rápido y evitar el contacto innecesario de2 O.</li>
	<li>Rehidratar la película lipídica formada con 1 mL de agua libre de nucleasas y agitar la suspensión durante 15 min (figura 2A). Después, coloque la suspensión en un baño de sonicación durante 1 hora (figura 2B). Nota: La suspensión estará ligeramente nublada.</li>
	<li>Montar el mini extrusora según las instrucciones del fabricante, llene una jeringa con la suspensión de lípidos y coloque la jeringa llena y una jeringuilla vacía en ambos lados de la extrusora. Presione la suspensión lipídica a través de la membrana de una jeringa a la otra, 20 x, 25 x, para sacar la suspensión (figura 2). Nota: El tamaño de la NLps es determinado por el tamaño de los poros de la membrana utilizada.</li>
	<li>Almacenar el NLps en un frasco de vidrio a 4 ° C hasta su uso posterior. Nota: Después de tiempo de almacenamiento prolongado, la NLps debe colocarse en el baño de sonicación nuevamente durante 15 minutos por 35 kHz para evitar la formación de complejos.</li>
</ol>2. in Vitro de la transcripción de mRNA sintético
<ol><li>Preparar la codificación eGFP ARNm siguiendo el protocolo publicado anterior34.</li>
	<li>Amplificar la secuencia de eGFP desde el plásmido con el μm 0.7 del forward (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') y reversa (5'-T120 CTT CTT ley CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') kit de cartillas y la polimerasa con PCR.<ol>
<li>Mezclar 20 μl de solución amortiguadora comercial que cambia el comportamiento de fusión del DNA (Tabla de materiales), así como de 20 μl de la mezcla 5 x desde el kit de la polimerasa. Añadir 7 μl de cada cebador (adelante y atrás).</li>
		<li>Agregue 25 ng de plásmido eGFP a la mezcla y 2 μl de polimerasa del kit de la polimerasa. Nota: Mantenga la polimerasa en el hielo antes de pipetear la solución.</li>
		<li>Añadir libre de nucleasa H2O a la mezcla, hasta un volumen de 100 μl.</li>
		<li>Ejecute los ciclos PCR en termociclador siguiendo el protocolo en la tabla 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificar la secuencia de ADN de codificación eGFP con el kit de purificación de la polimerización en cadena.<ol>
<li>Por lo tanto, mezclar la solución PCR con 500 μl de tampón de unión del kit y utilizarlo para rellenar columnas de purificación.</li>
		<li>Centrifugue las columnas a la máxima velocidad durante 1 min y descartar el filtrado.</li>
		<li>Añadir 750 μl de tampón de lavado I de la columna, centrifugar nuevamente a la máxima velocidad durante 1 min y descartar el filtrado.</li>
		<li>Repita el paso de centrífuga 1 x para quitar el tampón desde el filtro de la columna.</li>
		<li>Transfiera la columna a un tubo de 1,5 mL fresco.</li>
		<li>Añadir 20 μl de H libre de nucleasa2O a la columna, incubar durante 1 minuto y centrifugar durante 1 min a velocidad máxima. Repita este paso.</li>
		<li>Medir la concentración de la DNA con un fotómetro y almacenar a-20 ° C.</li>
		<li>Realizar los análisis de calidad de ADN mediante electroforesis en gel. Añadir 0,5 g de agarosa en buffer borato-Tris-EDTA (TBE) y calentarlo en el microondas a fuego alto hasta que la agarosa se disuelva completamente.</li>
		<li>Añadir 5 μl de solución de tinción de gel de la agarosa líquida, llenar la solución en la cámara de gel y esperar hasta que el gel se polimeriza.</li>
		<li>Mezcla 200 ng de ADN con 2 μl de 6 x tinte y llenar hasta un volumen final de 12 μl. Pipetear una escalera de ADN, así como la muestra de ADN en los pocillos del gel y correr la electroforesis durante 1 h a 100 V de carga.</li>
		<li>Analizar el gel utilizando una estación de análisis de gel bajo luz UV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecutar la transcripción en vitro para generar ARNm de la secuencia de ADN con un kit de transcripción en vitro contiene polimerasa T7 y sustituir los nucleótidos modificados de UTP y CTP con Ψ-UTP y CTP de metilo.<ol>
<li>Para la transcripción en vitro , mezclar los ingredientes siguiendo la tabla 2. Nota: Reemplazar 1.5 μl de metil-CTP con 1:10 Cy3-CTP diluida en libre de nucleasa H2O durante la transcripción en vitro de eGFP mRNA para lograr Cy3-etiquetado del mRNA.</li>
		<li>Incubar la mezcla de reacción de IVT de 4 h a 37 ° C.</li>
		<li>Añadir 1 μl de DNasa I de la polimerasa T7 kit e incubar durante 15 min por 37 ° C para digerir la plantilla de la DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para purificar el mRNA, utilice el kit de limpieza de RNA.<ol>
<li>Llenar la mezcla IVT al volumen de 100 μl con libre de nucleasa H2O.</li>
		<li>Añadir 350 μl de tampón de lisis y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
		<li>Añadir 250 μl de etanol al 100% y mezclar otra vez. Pipetear la mezcla en las columnas de limpieza.</li>
		<li>Centrifugar durante 15 s en 8.000 x g y descartar el filtrado.</li>
		<li>Añadir 500 μl del buffer de lavado en una columna, centrifugar nuevamente por 15 s en 8.000 x gy eliminar el filtrado.</li>
		<li>Lavar la columna 1 x con 500 μl de tampón de lavado y centrifugar durante 2 min a 8.000 x g.</li>
		<li>Mover la columna en un tubo de reacción de 1,5 mL fresco. Procederá a la elución del mRNA 2 x por una incubación de 1-min de 20 μl de H libre de nucleasa2O en la membrana de la columna, seguido de una centrifugación de 1 min a velocidad máxima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire los grupos fosfato de los mRNA usando un kit de desfosforilación. Agregar 4.5 μl de tampón de fosfatasa de x 10 y 1 μl de la fosfatasa en el mRNA e incubar durante 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Purificar el ARNm una vez más, siguiendo los pasos 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	<li>Medir la concertación de mRNA con un fotómetro.</li>
	<li>Utilizar gel de electroforesis para analizar la pureza y el tamaño del mRNA. Por lo tanto, preparar un gel de agarosa como se describe en pasos 2.3.9 - 2.3.10.<ol>
<li>3.3 mezcla μl de formamida, 1 μl de formaldehído al 37%, 1 μl de 10 x hombres y 1,7 μl de 6 x carga tinta 200 ng de mRNA y llénela hasta 10 μl de H libre de nucleasa2O para cada muestra y marcador de RNA.</li>
		<li>Incubar la mezcla por 10 min a 65 ° C para la desnaturalización del mRNA. Los pozos del gel con el mRNA y RNA marcador de cargar y ejecutar el gel durante 1 h a 100 V.</li>
		<li>Analizar el gel utilizando una estación de doc de gel con luz UV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. complejación del mRNA sintético
<ol><li>Descongelar el mRNA sintético en hielo, vortex y centrifugar poco antes de abrir el tubo.</li>
	<li>Mezclar 10 μl de mRNA sintético (concentración de mRNA es 100 ng/μL) con 1 μl, 2.5 μl, 5 μl, 10 μl y 20 μl de la suspensión de PNL (NLp concentración es 3 mg/mL). Centrifugar brevemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente (RT) para la formación de nanolipoplex. Nota: No mezclar mediante pipeteo. Esto puede conducir a la pérdida de volumen. Vórtice poco para una mezcla completa.</li>
	<li>Añadir 1 mL de medio celular regular a los nanolipoplexes y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
</ol>4. Análisis de la eficiencia de encapsulación de nanoliposomas
<ol><li>Para realizar los experimentos de encapsulación, utilice el kit de cuantificación de RNA.</li>
	<li>Preparar la solución de trabajo diluyendo el colorante fluorescente 1: 200 para una gama alta y 1:2,000 para un ensayo de gama baja. Nota: Descongelar el tinte fluorescente en el hielo. Preparar la solución de trabajo directamente antes de su uso.</li>
	<li>Preparar las curvas estándar de gama alta y gama baja con 1 mL de una solución stock de 2 μg/mL de eGFP mRNA en libre de nucleasa H2O. Nota: Para las curvas estándar, utilice el mRNA que se utilizarán en los experimentos de encapsulación.</li>
	<li>Utilice la tabla 3 para la preparación del estándar de gama alta (20 ng/mL - 1 μg/mL).</li>
	<li>Para el estándar de gama baja, diluir la eGFP de 2 μg/mL mRNA solución madre 1:20 para lograr una concentración final de 100 ng/mL. Preparar un estándar de gama baja (1 ng/mL - 50 ng/mL) como se describe en la tabla 4.</li>
	<li>Combinar 1 μg de eGFP mRNA (10 μl) y 7,5 μg de NLps (2,5 μl) e incubar por 20 min a TA. Nota: Mantenga el mRNA en el hielo para evitar la degradación.</li>
	<li>Añadir 1 mL de H libre de nucleasa2O nanolipoplexes forma y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
	<li>Añadir 1 mL de solución de trabajo de colorante fluorescente de RNA de 1: 200 o 1:2,000 a los estándares y las muestras encapsuladas e incubar 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Pipetear los estándares y las muestras por duplicado en una placa de 96 pocillos negra y medir la fluorescencia a 530 nm en un lector de microplacas (figura 3).</li>
</ol>5. preparación de las células para transfección
<ol><li>Placa 1.5 x 105 células A549/pozo de una placa de 12 pozos 1 d antes de transfección.</li>
	<li>Incube las células a 37 ° C y 5% de CO2 en medio regular de la célula (glucosa alta DMEM con 10% suero fetal bovino [SBF], 2 mM L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina) durante 24 h antes de transfección.</li>
</ol>6. transfección de las células
<ol><li>Lavar el preparado células 1 x con 1 mL/pocillo de PBS (sin Ca2 +Mg2 +).</li>
	<li>Añadir 1 mL de la mezcla de preparados nanolipoplex, que contenga 1 μg de eGFP que mRNA encapsulado en 1 μl, 2.5 μl, 5 μl, 10 μl o NLps 20 μl, en un pocillo de la placa preparada con células A549.</li>
	<li>Añadir la suspensión de nanolipoplex a las células e incubar en condiciones regulares de 24 horas para analizar la eficacia de transfección, o 24 h y 72 h para analizar la viabilidad de las células después de transfección. Nota: Transfección con NLps no requiere un cambio de medio.</li>
</ol>7. Análisis de la eficacia de transfección celular mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia
<ol><li>Quite el sobrenadante y lavar las células con 1 mL/bien PBS (sin Ca2 +/Mg2 +) para quitar el restante NLps.</li>
	<li>Preparar las células para citometría de flujo.<ol>
<li>Trypsinize las células con 500 μL/pocillo tripsina/EDTA (0,05%) a 37 ° C por 3 min parada del proceso y desactivar la tripsina añadiendo la misma cantidad (500 μL/pocillo) de medio regular que contiene FBS.</li>
		<li>Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g y retire con cuidado el sobrenadante sin tocar el precipitado de células.</li>
		<li>Lavar las células con 1 mL de PBS (sin Ca2 +Mg2 +).</li>
		<li>Resuspender las células en 300 μL de solución de fijación x 1 y las células de transferencia en tubos de citómetro de flujo.</li>
		<li>Analizar las células en 488 nm en un citómetro de flujo (Figura 4A). Nota: Vórtice las células 1 x directamente antes de medir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar las células para la microscopía de fluorescencia.<ol>
<li>Fijar las células con 1 mL/pozo 100% metanol, que previamente se almacenó a-20 ° C.</li>
		<li>Añadir 500 μL/pocillo 300 nM DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole) disuelta en PBS (sin Ca2 +/Mg2 +) e incubar por 5 min en la oscuridad.</li>
		<li>Retirar la solución DAPI y lave las células otra vez con 100% metanol almacenado a-20 ° C.</li>
		<li>Analizar las células utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 4B). Nota: Use las siguientes longitudes de onda de excitación/emisión: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm y Cy3 550/570 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. ensayo de viabilidad celular
<ol><li>Disolver 5 mg de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) en 1 mL de RPMI (sin rojo de fenol). Nota: El MTT disuelta debe ser más diluida 1:10 (concentración final: 0.5 mg/mL) en RPMI antes de su uso.</li>
	<li>Lavar las células transfected 3 x con 1 mL/pozo PBS (sin Ca2 +/Mg2). Nota: Los restos del medio celular regular deben retirarse completamente.</li>
	<li>Añadir 500 μL/pocillo de 1:10 diluido solución MTT a las células e incubar durante 4 h a 37 ° C.</li>
	<li>Retirar la solución MTT de las células después de la incubación y agregar 500 μL/pocillo de DMSO (dimetil sulfóxido). Otra vez incubar 10 min a 37 ° C.</li>
	<li>Pipetear la solución de DMSO en tríos en una placa de 96 pocillos de fondo claro y medir la absorción a 540 nm utilizando un lector de microplacas.</li>
	<li>Establecer la viabilidad de la célula no tratada en el 100% y calcular la viabilidad de las células de los otros grupos en comparación con las células control sin tratar (figura 5).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado describe la generación de NLps con eficacia alta encapsulación de mRNA sintético modificado, así como la fiable transfección de células en vitro. Por otra parte, las NLps garantiza la liberación de ARNm, que a su vez, se traduce en una proteína funcional dentro de las células. Además, las transfecciones con NLps puede realizarse en medio celular regular, dando por resultado alta viabilidades de la célula durante la transfección, y durar hasta tres días después de la transfección.
<p c...

El uso de ARNm modificado para aplicaciones terapéuticas ha mostrado gran potencial en los últimos años. En enfermedades cardiovasculares, inflamatorias y monogenéticos, así como en el desarrollo de vacunas, el mRNA es un prometedor agente terapéutico1.
Terapia de reemplazo de la proteína con el mRNA ofrece varias ventajas sobre la terapia del gene clásico, basado en la transfección de la DNA en las células de destino2. La función de mRNA se inicia directamente en el citosol. Aunque el plásmido ADN (pDNA), una construcción de doble cadena, circular ADN que contiene una región promotora y una secuencia del gen que codifican la proteína terapéutica3, también actúa en el citosol, puede sólo ser incorporado en células que van a través de la mitosis en el momento de la transfección. Esto reduce el número de células transfected en el tejido1,4. Específicamente, la transfección de los tejidos con actividad de mitosis débiles, tales como células cardíacas, es difícil5. En contraste con pDNA, la transfección y traducción de mRNA ocurren en las células mitotic y no mitótica del tejido1,6. La integración viral de la DNA en el genoma del anfitrión puede venir con efectos mutagénicos o reacciones inmunes7,8, pero después de la transfección de células con una codificación de la proteína ARNm, la síntesis de novo de la proteína deseada inicia autónomamente9,10. Por otra parte, la síntesis de proteínas puede ajustarse precisamente a la necesidad del paciente a través de dosis individuales, sin interferir en el genoma y correr el riesgo de efectos mutagénicos11. El potencial de activación inmune de mRNA sintético generado podría reducirse drásticamente mediante pseudo uridina y 5'-methylcytidine en lugar de uridina y citidina12. Pseudo uridina mRNA modificada también se ha demostrado tener una mayor estabilidad biológica y una significativamente mayor capacidad traslacional13.
Para poder beneficiarse de las prometedoras propiedades de tratamiento basado en el mRNA en aplicaciones clínicas, es esencial para crear un vehículo adecuado para el transporte de ARNm en la célula. Este vehículo debe tener propiedades no tóxico en vitro e in vivo, proteger el mRNA contra degradación nucleasas y proporcionar suficiente absorción celular para una prolongada disponibilidad y traducción de los mRNA de14.
Entre todos los tipos de portador posible para en vivo entrega de la droga, tales como nanotubos de carbono puntos cuánticos y liposomas, estos últimos han sido estudiados más de15,16. Liposomas son vesículas que consiste en una bicapa de lípidos10. Son anfifílicas con una hidrofóbica y una hidrofílica sección, y a través de la propia disposición de estas moléculas, una doble capa esférica es formado17. Dentro de los liposomas, agentes terapéuticos o medicamentos pueden ser encapsulados y, así, protegidos de la degradación enzimática18. Liposomas que contienen N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloruro (DOTMA)19, [1, 2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propano] (DOTAP)20y21de dioctadecylamidoglycylspermine (perros), o DC-colesterol22, están bien caracterizadas y utilizado con frecuencia para transfección celular con ADN o ARN.
Liposomas catiónicos comprenden un lípido positivamente cargado y un fosfolípido23. Través de catiónicos liposomas de transfección es uno de los métodos más comunes para el transporte de los ácidos nucleicos en células24,25. Las partículas de lípidos catiónicos forman complejos con los grupos fosfato cargados negativamente en la columna vertebral de las moléculas de ácido nucleico26. Estos supuestos lipoplexes fije a la superficie de la membrana celular y entrar en la célula mediante endocitosis o mecanismos de endocitosis como27.
En 1989, Malone et al. con éxito se describe catiónico mediada por lípidos mRNA transfección28. Sin embargo, usando una mezcla de DOTMA y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga), el grupo encontró que DOTMA manifiesta efectos citotóxicos28. Además, Zohra et al demostró que DOTAP (cloruro de 1, 2-dioleoyloxy-3-trimetilamonio-propano) puede utilizarse como un mRNA de la transfección reactivos29. Sin embargo, para la transfección eficiente de células, DOTAP debe utilizarse en combinación con otros reactivos, tales como fibronectina29 o30de la droga. Hasta ahora, DOTMA era el lípido catiónico primero en el mercado para el gen entrega31. Otros lípidos son utilizados como portadores de la terapéuticos o se están probando en diferentes etapas de ensayos clínicos (p. ej., EndoTAG-I, que contiene DOTAP como portador lípido), actualmente está siendo investigada en un ensayo clínico de fase II32.
Este trabajo describe un protocolo para la generación de NLps que contiene colesterol DC y la droga. Este método es fácil de realizar y permite la generación de NLps de diferentes tamaños. El objetivo general de generación de PNL mediante el método de película seca es crear liposomas para la complejación de mRNA, así permitiendo la transfección eficiente y biocompatibles de la célula en vitro14,33.

<table><tbody><tr><td>(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT)</td><td>AppliChem, Darmstadt, Alemania</td><td>A2231</td><td></td></tr><tr><td>(3&beta;-[N-(N&prime;,N&prime;-dimetilaminoetano)-carbamoil]clorhidrato de colesterol (DC-Colesterol)</td><td>Avanti, Alabama, EE. UU</td>. <td>700001</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; &prime;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemania</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>BD FACScan system</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Fix (10x)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Alemania</td><td>340181</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania</td><td>20385.02</td><td></td></tr><tr><td>Dioleoyl fosfatidiletanolamina (DOPE)</td><td>Avanti, Alabama, EE. UU.</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Zeiss Axio, Oberkochen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemania</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Mini extrusora</td><td>Avanti, Alabama, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemania</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>tampón PBS (sin Ca2+/Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemania</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reactivos de ARN verde Quant-iT Ribo Thermo</td><td>Fisher Scientific, Darmstadt, Alemania</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (sin rojo fenol)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemania</td><td>11835030</td><td></td></tr><tr><td>Gel de sílice</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>P077</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA (0,05 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemania</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Kit de polimerasa HotStar HiFidelity</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación QIAquick PCR</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td> Pseudouridina-5'-Trifosfato (&psi;-UTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, EE. UU.</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>5-metilcitidina-5'-trifosfato (metil-CTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, EE. UU.</td><td>N-1014</td><td></td></tr><tr><td>Cianina 3-CTP</td><td>PerkinElmer, Baesweiler, Alemania</td><td></td><td></td>NEL580001EA</tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit de transcripción</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemania</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G Estructura de la tapa de ARN análogo</td><td>New England Biolabs, Ipswich, EE. UU.</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasa antártica</td><td>Nuevo Inglaterra Biolabs, Ipswich, EE. UU.</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemania</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium, Fremont, EE. UU.</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>peqGOLD Mezcla de escalera de ADN</td><td>VWR, Pensilvania, EE. UU.</td><td>25-2040</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen 0.5-10kb Escalera de ARN</td><td>Fisher Scientific, G&ouml; teborg, Suecia</td><td>11528766</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de nanoliposomas catiónicos para la entrega eficiente de in vitro transcribe arn mensajero

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

El desarrollo de RNA mensajero (mRNA)-base terapéutica para el tratamiento de diversas enfermedades, se convierte cada vez más importante debido a la positiva propiedades de in vitro transcripción mRNA (IVT). Con la ayuda de mRNA IVT, puede inducirse la síntesis de novo de una proteína deseada sin necesidad de cambiar el estado fisiológico de la célula diana. Por otra parte, biosíntesis de la proteína pueden ser precisamente controlada debido al efecto transitorio del mRNA IVT.
Para la transfección eficiente de células, nanoliposomas (NLps) pueden representar un vehículo de entrega segura y eficiente para el mRNA terapéutico. Este estudio describe un protocolo para generar seguro y eficiente catiónico NLps compuesto de colesterol DC y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga) como un vector de la entrega para IVT mRNA. NLps tener definido el tamaño, una distribución homogénea y una capacidad de complejación alta y puede ser producidos utilizando el método de película seca. Por otra parte, presentamos sistemas de prueba diferentes para analizar la complejación y eficacias de transfección con sintético mejorado proteína verde fluorescente (eGFP) mRNA, así como su efecto en la viabilidad celular. En general, el protocolo presentado proporciona un acercamiento eficaz y seguro para la complejación de mRNA, que puede avanzar y mejorar la administración de terapéutica mRNA.

Utilizando el protocolo como se describe, NLps consisten en los lípidos colesterol DC y la droga fueron preparados utilizando el método de película seca (figura 1). Durante la preparación, la solución nanoliposoma muestra diferentes etapas en turbidez (figura 2).
La eficacia de la encapsulación de la NLps luego puede ser analizada después de la encapsulación de 1 μg de ...

Aquí se describe un protocolo para la generación de nanoliposomas catiónicos, que se basan en el método de película seca y pueden ser utilizado para la caja fuerte y una entrega eficiente de in vitro transcribe ARN mensajero.

Generación de nanoliposomas catiónicos para la entrega eficiente de In Vitro transcribe ARN mensajero

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Este protocolo permite la producción de nanoliposomas seguros y eficientes que se pueden utilizar como vehículos de transfección para EL ARN mensajero terapéutico. Estos nanoliposomas facilitan la absorción de ARNm en las células, lo que resulta en un aumento de los niveles de expresión de proteínas sin afectar la viabilidad celular. La principal ventaja de esta técnica es la generación rápida y fácil de nanoliposomas estables con tamaño definido y distribución homogénea.Además, protegen el ARNm encapsulado de la degradación y conducen a una traducción prolongada. Demostrar el procedimiento estará Antonia Link, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, preparar soluciones de stock para los lípidos, COLESTEROL DC y DOPE disolviendo cada uno en cloroformo a una concentración final de 25 miligramos por mililitro.Mezclar 40 microlitros del colesterol DC disuelto con 80 microlitros del DOPE disuelto en un matraz de vidrio. Vaporizar el cloroformo bajo un flujo de gas argón durante 15 minutos. A continuación, llene un desecador con gel de sílice.Coloque el matraz de vidrio abierto dentro y aplique un vacío durante la noche para asegurarse de que el cloroformo restante se evapora. La película lipídica resultante se formará dentro del matraz de vidrio. Al día siguiente, añadir un mililitro de agua libre de nucleasas para rehidratar la película lipídica.Y vórtice la suspensión durante 15 minutos. Coloque la suspensión en un baño de sonicación durante una hora. Después de esto, montar el mini extrusor de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Llene una jeringa con la suspensión líquida y colóquela a un lado del extrusor. Coloque una jeringa vacía en el otro lado. Presione la suspensión de lípidos a través de la membrana de una jeringa a la otra, aproximadamente 20-25 veces para extruir la suspensión.A continuación, guarde los nanoliposomas en un matraz de vidrio a cuatro grados Centígrados hasta que estén listos para usar. Primero, descongela el ARNm sintético sobre hielo. Vórtice el ARNm congelado y luego centrifugarlo poco antes de abrir el tubo.A continuación, mezclar un microgramo del ARNm sintético con varias cantidades de suspensión nanoliposoma. Centrifugar brevemente e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos para la formación de nanolipoplex. Luego, agregue mililitro de medio celular regular al nanolipoplex y mezcle pipeteando arriba y abajo.Prepare las células un día antes de la transfección. Por lo tanto, placa 150, 000 A549 células en cada poción de una placa de 12 pozos un día antes de la transfección. Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un medio celular regular durante 24 horas.Luego, al día siguiente, lave cada pozo de células preparadas una vez con un mililitro de PBS. Añadir un mililitro de una mezcla de nanolipoplex preparada a uno de los pozos que contienen las células A549. Incubar en condiciones regulares durante 24 horas para analizar la eficiencia de la transfección, o durante 24-72 horas para analizar la viabilidad celular después de la transfección.Retire el sobrenadante y lave cada pozo con un mililitro de PBS para eliminar los nanolipomas restantes. Para preparar las células para la citometría, primero agregue 500 microlitros de trippsina EDTA a cada pozo e incubar a 37 grados Celsius durante tres minutos para probar las células. A continuación, agregue 500 microlitros de medio regular que contenga FBS para detener el proceso e inactivar la tripina.Centrifugar las células a 400 veces G durante cinco minutos. Y retire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet celular. Lave las células con un mililitro de PBS.Luego vuelva a suspender las células en 300 microlitros de solución de fijación celular y transfiéralas a tubos de citometría de flujo. Utilice un citómetro de flujo para analizar las células a 488 nanómetros. Para preparar las células para la microscopía de fluorescencia, agregue un mililitro de metanol refrigerado a cada pozo para fijar las células.Añadir 500 microlitros de una solución nanomolar 300 de DAPI disuelta en PBS a cada pozo. Incubar en la oscuridad durante cinco minutos. Después de esto, retire la solución DAPI y lave las células de nuevo con 100%metanol que se almacenó previamente a menos 20 grados Celsius.Utilice un microscopio de fluorescencia para analizar las células utilizando las longitudes de onda de excitación y emisión que se muestran aquí. En este estudio, los nanoliposomas se generan con alta eficacia de encapsulación para el ARNm modificado sintéticamente. Utilizando el kit de cuantificación de ARN, la eficacia de encapsulación de los nanoliposomas se puede analizar después de la encapsulación de un microgramo de ARNm de codificación eGFP mediante el análisis de la cantidad libre de ARNm que no está encapsulado.Después de la encapsulación de EGFP mRNA en diferentes cantidades de nanoliposomas, los nanolipoplexos formados se pueden incubar con células in vitro y el porcentaje de células que expresan eGFP se puede analizar utilizando citometría de flujo 24 horas después de la transfección. Como se ve aquí, incluso un microlitro de la solución de nanoliposomas es suficiente para lograr una alta transfección de las células invitro. Cuando las células se trans infectan con nanoliposomas que contienen mRNA eGFP etiquetada Cy3, se puede visualizar la presencia del ARNm eGFP en el citoplasma, así como la proteína eGFP ya producida.Dado que la transfección de células que utilizan nanolipoplexos puede tener efectos adversos en las células, la viabilidad de las células se probó después de 24 horas y 72 horas después de la transfección. No se pudieron detectar efectos sobre la viabilidad celular cuando las células fueron tratadas con 2,5 o cinco microlitros de nanolipopplexos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar en un ambiente libre de etanol todo el tiempo porque esto podría dañar la estabilidad de los nanoliposomas.Mientras prepara y mezcla el colesterol DC con DOPE, debe utilizar una pipeta de vidrio para evitar la contaminación de los lípidos disueltos con componentes solubles de las puntas de pipeta de plástico. Siguiendo este protocolo, los nanoliposomas generados se pueden manipular fácilmente durante o después de la preparación. Por ejemplo, la incorporación de moléculas de PEG o anticuerpos específicos conduciría a una mayor estabilidad o iniciaría la orientación activa del tejido.Los nanoliposomas generados cumplen los aspectos de seguridad necesarios y facilitan la absorción de ARNm a las células diana. Los nanoliposomas complejos con un NRNA terapéutico específico pueden hacer una contribución esencial al desarrollo de nuevas terapias basadas en ARNM en el campo de la ingeniería de tejidos o la terapia de reemplazo, por ejemplo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Inyecciones retro-orbitales repetidas de complejos catiónicos liposomes/siRNA/ITSN-1s en ratones, cada 72 horas durante 24 días, eficiente entregar el dúplex siARN de la microvasculatura pulmonar del ratón la reducción de ARNm ITSN-1s y expresión de la proteína en un 75%. Esta técnica es altamente reproducible en un modelo animal, no tiene efectos adversos y evita accidentes mortales.

Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

El objetivo de este protocolo es utilizar liposomas catiónicos/aniónicos con un péptido neuro-dirigido como sistema de administración del SNC para permitir que el siRNA atraviese la BBB.  La optimización de un sistema de administración de tratamientos, como el siRNA, permitiría más opciones de tratamiento para los priones y otras enfermedades neurodegenerativas.

Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas

Se describe un método de usar polietilamina (PEI)-recubierto de óxido de hierro superparamagnético nanopartículas para transfectar macrófagos con ARNsi. Estas nanopartículas pueden administrar siRNA a macrófagos in vitro y en vivo y silencio blanco genes.

Nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de ARN interferente pequeño a los macrófagos In Vitro e In Vivo

Se presentan los métodos para preparar y caracterizar las propiedades fisicoquímicas y la bioactividad de las nanopartículas de siRNA con respuesta al pH, que son neutralmente cargadas. Se discuten los criterios para los nanomedicamentos siRNA exitosos, como el tamaño, la morfología, la carga superficial, la carga de siRNA y el silenciamiento del gen.

La preparación de nanopartículas poliméricas con capacidad de pH, cargadas de neutralmente, para la entrega de siRNA citosólica

Las nanopartículas lipídicas se desarrollan utilizando un enfoque de plataforma de mezcla microfluídica para la encapsulación de ARNm y ADN.

Formulación y caracterización de nanopartículas lipídicas para la administración de genes utilizando una plataforma de mezcla microfluídica

Los métodos de producción de nanopartículas lipídicas (LNP) basados en microfluídicas han atraído la atención en los sistemas de administración de fármacos (DDS), incluida la administración de ARN. Este protocolo describe la fabricación, la producción de LNP (LNP cargado de siRNA) y los procesos de evaluación de LNP utilizando nuestro dispositivo microfluídico original llamado iLiNP.

Producción de nanopartículas lipídicas cargadas de siRNA utilizando un dispositivo microfluídico

Utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilenimina (PEI), producimos partículas lentivirales para la expresión estable de shRNAs en células madre embrionarias humanas H9 (hESC) y células progenitoras neurales derivadas de H9 (NPC) transducidas transitoriamente con alta eficiencia.

Administración mediada por lentiviral de shRNAs a hESCs y NPCs usando polietileno de polímero catiónico de bajo costo (PEI)

Se desarrolla una nanopartícula de péptido-poloxamina autoensamblada (PP-sNp) utilizando un dispositivo de mezcla microfluídica para encapsular y entregar ARN mensajero transcrito in vitro . El ARNm/PP-sNp descrito podría transfectar eficientemente células cultivadas in vitro.

Transfección eficiente del ARNm transcrito in vitro en células cultivadas utilizando nanopartículas de péptido-poloxamina

Aquí, se presenta un protocolo para la formulación de nanopartículas lipídicas (LNPs) que encapsulan el ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga. La potencia de estos LNP se probó in vitro en células HepG2 e in vivo en ratones C57BL/6.

Prueba de la eficiencia in vitro e in vivo de nanopartículas lipídicas de ARNm formuladas mediante mezcla microfluídica

Se demuestra un protocolo detallado para sintetizar nanopartículas lipídicas (LNPs) utilizando tecnologías de mezcladores de chorro de impacto confinado (CIJ), incluyendo un CIJ de dos chorros y un mezclador de vórtice de entrada múltiple de cuatro chorros (μMIVM). Los mezcladores CIJ generan entornos de micromezcla turbulentos y reproducibles, lo que da como resultado la producción de LNP monodispersos.

Síntesis de nanopartículas lipídicas por flujo turbulento en mezcladores de chorro de impacto confinados

Aprende a generar nanoliposomas catiónicos mediante el método de película seca para la entrega eficiente de ARN mensajero in vitro transcrito. Esta técnica mejora la captación de mRNA en células y aumenta la expresión de proteínas sin comprometer la viabilidad celular.

Generación de nanoliposomas catiónicos para la entrega eficiente de In Vitro transcribe ARN mensajero

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