Microdiálisis de aminoácidos excitatorios durante las grabaciones de EEG en mover libremente las ratas

Aquí, describimos un método para microdiálisis en vivo analizar liberación de aspartato y glutamato en el hipocampo ventral de ratas epilépticas y no epilépticas, en combinación con las grabaciones de EEG. Concentraciones extracelulares de aspartato y glutamato pueden ser correlacionadas con las diferentes fases de la enfermedad.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en las neurociencias como las alteraciones en la neuroquímica durante la historia natural de las enfermedades neurológicas. La principal ventaja de la técnica de EEG de microdiálisis propuesta es que este enfoque combinado permite el emparejamiento de cambios en la liberación de neurotransmisores dentro de etapas específicas del desarrollo y progresión de la enfermedad. Comience encendiendo el amplificador situado fuera de la jaula Faraday.

Abra el software EEG e inicie la adquisición de EEG y observe la señal EEG producida por cables no conectados. A continuación, conecte el animal al sistema de grabación EEG atado sosteniendo la cabeza del animal entre dos dedos estirados de una mano y atornillando los conectores al pedestal del electrodo usando la otra mano libre. Establezca un factor de amplificación en cada canal del amplificador de acuerdo con la señal de electrodo de un solo animal para que la señal EEG esté en escala.

A continuación, deje que el animal explore la nueva jaula durante al menos una hora bajo la observación directa del investigador. Ajuste el cable de acuerdo con la mercancía del animal y asegúrese de que los cables no interfieran con los movimientos y la postura de acostarse del animal. Por último, compruebe si hay el encuadre de imagen correcto en las cámaras de vídeo y, a continuación, inicie la grabación de EEG de vídeo.

Comience preparando las sondas de microdiálisis para el primer uso de acuerdo con la guía del usuario del fabricante y llénelos con la solución de Ringer. A continuación, corte trozos de 10 centímetros de largo de tubos FEP y conéctelos a las cánulas de entrada y salida de la sonda utilizando los adaptadores de tubería de diferentes colores. Asegúrese de que el tubo toca los adaptadores sin espacio muerto en todas las conexiones.

Retire la cánula ficticia de su guía usando las pinzas sosteniendo la cabeza del animal firmemente. Inserte la sonda de microdiálisis en la cánula guía y utilice arcilla de modelado para reafirmar aún más la cánula. A continuación, conecte el animal al sistema de grabación EEG atado.

A continuación, poner el animal en el cilindro de plexiglás y dejar que explore el nuevo entorno. Siga los movimientos despiertos y libremente en movimiento de las ratas. A continuación, conecte la entrada de la sonda a la jeringa de 2,5 mililitros con una aguja de calibre 22 contundente que contenga la solución de Ringer utilizando los adaptadores de tubería.

Empuje un mililitro de la solución de Ringer en la sonda en 10 segundos empujando el pistón de la jeringa de 2,5 mililitros continuamente. Compruebe la caída del líquido que aparece en la toma de corriente para indicar cuándo la sonda está lista para su uso. Por último, llene las jeringas de 2,5 mililitros conectadas a los adaptadores de tubo FEP mediante adaptadores de tubo con la solución de Ringer y colóquelas en la bomba de perfusión.

Encienda la bomba a dos microlitros por minuto y déjela funcionar durante la noche. Después de verificar a través de video EEG graba la ausencia de convulsiones en las tres horas anteriores a la recolección de muestras, detenga la bomba que lleva las jeringas canuladas FEP llenas con la solución de Ringer. Monte otro conjunto de jeringas de 2,5 mililitros conectadas a tubos FEP con adaptadores de tubo llenos de una solución de Ringer modificada que contenga 100 solución de potasio milimiolar.

Encienda la bomba a dos microlitros por minuto y déjela funcionar. Compruebe la ausencia de burbujas de aire en el sistema y asegúrese de que el tubo toca los adaptadores sin espacio muerto en todas las conexiones. A continuación, compruebe si la gota del líquido que aparece en la toma de corriente significa cuando la sonda está lista para su uso.

A continuación, conecte el tubo FEP de las jeringas llenas con la solución de Ringer a la cánula de entrada de la sonda en cada animal y espere a que la aparición del líquido caiga en la punta de la salida. Conecte la salida de la sonda al tubo FEP, lo que conduce a la recogida en el tubo de ensayo. Inserte el tubo FEP en el tubo de ensayo cerrado de 0,2 mililitros con una tapa perforada y asegúrese de que el tubo permanezca en su lugar fijándolo con un trozo de arcilla de modelado.

Después de ejecutar la bomba a dos microlitros por minuto durante 60 minutos sin recoger muestras para equilibrar el sistema, recoja cinco muestras consecutivas de dialesato de 30 minutos en condiciones de referencia y almacene muestras en hielo. Después de 10 minutos, cambie el tubo de las jeringas que contienen 100 soluciones de Ringer de potasio milimétrica a la solución normal de Ringer y deje que la bomba funcione. Después de la recolección del quinto dialato post-equilibrio, recoja 20 fracciones de dialato de microlitros cada 10 minutos durante una hora.

A continuación, recoja tres muestras de dialato de 30 minutos adicionales y detenga la bomba. Por último, almacene las muestras a menos 80 grados centígrados después del experimento hasta el análisis de HPLC. Una vez completado el experimento, enjuague las sondas de microdiálisis usadas con agua destilada y guárdelas en un vial lleno de agua destilada limpia hasta su próximo uso.

Por último, enjuague toda la configuración de microdiálisis con agua destilada seguida de un 70 por ciento de etanol. Reemplace el etanol por aire y almacene la configuración en un entorno estéril. Estos son los rastros representativos del EEG registrados desde el hipocampo de las ratas de control y epilépticos durante la fase crónica de la enfermedad.

No se observó alteración del EEG en ratas de control, mientras que se observó una actividad epileptiforma paroxística sincronizada unos 500 milisegundos antes y durante las convulsiones conductuales en ratas epilépticas. La concentración basal de glutamato encontrada en ratas epilépticas crónicas fue significativamente mayor que en animales de control. El alto nivel de potasio evocó una liberación adicional de glutamato durante unos 30 minutos en ratas de control y durante unos 60 minutos en ratas epilépticas crónicas.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los animales implantados con el dispositivo son propensos a perderlo durante un experimento prolongado, por lo que utilizar un conjunto de cabeza ligera y cables lo suficientemente largos para evitar interferir con la movilidad animal. Dependiendo de la disponibilidad de un ensayo analítico adecuado, el método se puede utilizar más para probar diferentes moléculas solubles en el cerebro cuando se emplea la grabación de EEG al mismo tiempo. Después de su desarrollo, esta técnica permitió a los investigadores en el campo de la epileptología proporcionar una visión de las alteraciones en la neurotransmisión excitatoria en el caso de una epilepsia del lóbulo temporal.

Después de ver este video, confiamos en que usted tendrá una mejor comprensión de cómo realizar la microdiálisis in vivo junto con la grabación de electrodo de profundidad EEG en una rata epiléptica que se mueve libremente.