Name: Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprende a manejar y almacenar muestras biológicas para espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica a temperatura ambiente y 77 K. Este protocolo permite detectar radicales libres en modelos celulares y tejidos con sondas de espín selectivas.

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Este trabajo fue financiado por la Universidad de Colorado escuela de medicina Decano concesión de infraestructura de investigación estratégica, R01 HL086680-09 y 1R35HL139726-01, al Premio de beca E.N.G. y UCD CFReT (él). Los autores agradecen a Dr. Sandra Eaton y el Dr. Gareth Eaton (Universidad de Denver), Dr. Gerald Rosen y Dr. Joseph P. Kao (Universidad de Maryland) y Dr. Sujatha Venkataraman (Universidad de Colorado Denver) para discusiones útiles y Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie y Ivy McDermott (Universidad de Colorado Denver) para el soporte técnico.

Todos los estudios en animales fueron aprobados por la Universidad de Colorado Denver Animal cuidado institucional y Comité de uso.
1. preparación de reactivos
<ol><li>
Stock de Diethylenetriaminepentaacetic ácido (DTPA) (150 mM)
	<ol>
<li>Añadir 2,95 g de DTPA (393.35 g/mol) a 10 mL de agua desionizada.</li>
		<li>Para disolver el DTPA, añadir 1 M NaOH gota a gota y a un pH de 7.0.</li>
		<li>Llevar el volumen a 50 mL con agua a una concentración final de DTPA de 150 mM y almacenar a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solución salina buffer fosfato (PBS) (50 mM, pH 7.4)
	<ol>
<li>Preparar 5 M de cloruro de sodio (NaCl) (58.44 g/mol; 29,22 g/100 mL).</li>
		<li>Preparar 1 M de potasio Fosfato dibásico HK2PO4 (174.18 g/mol; 17,42 g/100 mL)</li>
		<li>Preparar 1 M de potasio fosfato monobásico KH2PO4 (136,1 g/mol; 13,61 g/100 mL). Mezclar 3 mL de 5 M NaCl con 4,24 de 1 M de fosfato de potasio dibásico y 0,760 mL de potasio de 1 M fosfato monobásico. Compruebe el pH.</li>
		<li>Llevar el volumen a 100 mL con agua desionizada.</li>
		<li>Almacenar a temperatura ambiente (RT) para a corto plazo (días) y a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo (semanas).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tampón de Krebs-Henseleit (KHB) que contiene 100 μm DTPA
	<ol>
<li>En tubo de centrífuga cónico de 50 mL, añadir 33,3 μl de solución stock de 150 m m DTPA.</li>
		<li>Llevar a un volumen de 50 mL con tampón Krebs-Henseleit (KHB).</li>
		<li>Preparación buffer fresca con DTPA cada día y mantener a TA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tampón Tris-EDTA que contiene sacarosa
	<ol>
<li>Preparar acciones de Tris de 0,5 M: disolver 15,14 g de Tris base (121.14 g/mol) en 150 mL de agua desionizada. Con ácido clorhídrico, ajustar el pH a 7.8 y llevar a un volumen final de 250 mL.</li>
		<li>Disolver 21,4 g de sacarosa (g/mol 342.29; concentración final = 0.25 mM) en 150 mL de agua desionizada.</li>
		<li>Añadir 5 mL de Tris acción a sacarosa para lograr una concentración final de Tris 10 mM.</li>
		<li>Añada 0,5 mL de caldo de EDTA de 0.5 M de Tris sacarosa para lograr una concentración final de 1 mM.</li>
		<li>Compruebe el pH y ajústelo a 7,4.</li>
		<li>Llevar a un volumen final de 250 mL con agua desionizada y almacenar a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eritrocito bovino stock de Cu/Zn superóxido dismutasa (SOD) (30.000 U/mL)
	<ol>
<li>Reconstituir 30.000 U de SOD en 1 mL de PBS (aproximadamente 5,7 mg, dependiendo de la actividad de gran cantidad SOD).</li>
		<li>Mezcla bien, alícuota y almacenar a-20 ° C a corto plazo (6-12 meses) y a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solución de trabajo de SOD (1000 U/mL)
	<ol>
<li>Transferir una alícuota de 30 μl de 30.000 acciones de césped U/mL en un 870 μl de PBS estéril.</li>
		<li>Mantener la solución en el hielo y usar fresco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stock de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (5 mM)
	<ol>
<li>Disolver 1 mg de PMA (616.83 g/mol) en 325 μl de DMSO (concentración final = 5 mM).</li>
		<li>Parte alícuota de una solución de 5 mM PMA y almacenar a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solución de trabajo PMA (125 μm)
	<ol>
<li>Diluir una alícuota de 10 μl del stock PMA de 5 mM en 390 μl de PBS estéril.</li>
		<li>Mantener la solución en el hielo y usar fresco.</li>
		<li>Para un control de vehículos de PMA, utilice 10 μl de DMSO en 390 μl de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cloruro de Diphenyliodonium (DIP) (2,5 mM)
	<ol>
<li>Disolver 3,2 mg de inmersión (316.57 g/mol) en 4 mL para obtener un stock de 2, 5 mM.</li>
		<li>Preparar la solución y utilizarla fresca.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sal de mesilato de deferoxamina (DFO) (20 mM)
	<ol>
<li>Disolver 4,5 mg de DFO (656,79 g / mol) en 340 μL para obtener un stock de 20 mM.</li>
		<li>Preparar la solución y utilizarla fresca.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de antimicina stock A (AA) (5 mM)
	<ol>
<li>Disolver 5,4 mg de AA (532 g/mol) en 2 mL de etanol (concentración final = 5 mM).</li>
		<li>Alícuota del material en frascos de cristal y almacenar a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de puntas de prueba de giro
	<ol>
<li>La burbuja 50 mM fosfato buffer que contiene 100 μm DTPA con nitrógeno durante 30 min para eliminar el oxígeno disuelto de la solución tampón.</li>
		<li>Retire la sonda de spin del congelador de-20 ° C y deje el recipiente a RT (10-15 min).</li>
		<li>Pesar 2,4 mg de 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· Ácido clorhídrico (CMH) (237.8 g/mol)</li>
		<li>CMH se disuelven en 1 mL del buffer fosfato sin oxígeno para una concentración final de 10 mM.</li>
		<li>Pesar 5 mg de dicloruro de 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium (mito-TEMPO-H) (529.1 g/mol).</li>
		<li>Mito-TEMPO-H se disuelven en 1 mL del buffer fosfato desoxigenada hasta una concentración final de 9,5 mM.</li>
		<li>Pesar 4,9 mg de 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· Ácido clorhídrico (CPH) (223.7 g/mol).</li>
		<li>CPH se disuelven en 1 mL del buffer fosfato sin oxígeno para una concentración final de 22 mM.</li>
		<li>Alícuota y conservar a-80 ° C (congelación y descongelación no se recomienda).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. detección de superóxido en vitro
<ol><li>
Detección de superóxido intracelular, extracelular y total en estimulada por PMA RAW 264.7 células en RT
	<ol>
<li>Siguiendo una técnica aséptica adecuada, descongelar las células RAW 264.7 y paso en medio DMEM suplementado con 10% FBS (libre de endotoxinas bajo) y 1% antimicótico/ampicilina a 37 ° C en incubadora de CO2 .</li>
		<li>Las células RAW 264.7 de semilla en 1 x 106 células/pozo en placas de 6 pocillos un día antes del tratamiento.</li>
		<li>Suavemente Retire media y lavar las células una vez con 1 mL de tampón KHB.</li>
		<li>Añadir KHB conteniendo 100 μm DTPA a cada pocillo y tratar en un volumen total de 500 μl con los siguientes:</li>
		<li>Para pocillos pretratados con el césped, añadir 15 μL/pocillo de solución de trabajo de SOD (1000 U/mL, concentración final de SOD = 30 U/mL) e incubar 10 min a 37 ° C antes de la adición de CMH y PMA.</li>
		<li>Añadir 12.5 μL/pocillo de la acción CMH de 10 mM (concentración final = 0.25 mM).</li>
		<li>Agregar 40 μL/pocillo de solución de trabajo de PMA de 125 μm (concentración final = 10 μm) o 40 μl (stock 10 μl de DMSO en 390 μl de PBS).</li>
		<li>Incubar durante 50 min a 37 ° C en un incubador de CO2 .</li>
		<li>Retire las placas de la incubadora y coloque inmediatamente en hielo.</li>
		<li>Recoger el buffer de cada pozo en separado, 1.5 mL, etiquetado tubos. Mantener el hielo a lo largo.</li>
		<li>Añadir 100 μl de buffer KHB fresco que contiene 100 μm DTPA, suavemente raspar las células y resuspender mediante pipeteo arriba y abajo varias veces. Mantener el hielo a lo largo de resuspensión de células.</li>
		<li>Carga la muestra recogida en los pasos 2.1.10 y 2.1.11 (50 μL) en cada uno de los tubos capilares. Selle ambos extremos y ejecute el EPR. Nota: Siempre probar un tubo o bien (sin células) que contiene la sonda en solución tampón (misma concentración = 0.25 mM), tratada bajo las mismas condiciones que las células (mismo tiempo de incubación y temperatura) como control, ya que es la intensidad de fondo de la sonda de temperatura - y dependiente del tiempo.</li>
		<li>Establecer los parámetros de adquisición de EPR a lo siguiente: frecuencia de microondas = 9,65 GHz; campo de centro = 3432 G; amplitud de modulación = 2.0 G; anchura de barrido = 80 G; potencia de microondas = 19,9 mW; número total de exploraciones = 10; tiempo de barrido = 12.11 s; y constante de tiempo = 20,48 ms.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detección de superóxido mitocondrial en células RAW 264.7
	<ol>
<li>Siga los pasos 2.1.1 y 2.1.2 células RAW 264.7 de semilla un día antes del experimento.</li>
		<li>Los medios de quitar y lavar las células una vez con 1 mL de tampón KHB.</li>
		<li>Añadir 200 μL de KHB conteniendo 100 μm DTPA a cada pocillo.</li>
		<li>Añadir 5.3 μL/pocillo de stock de mito-TEMPO-H 9.5m m (concentración final = 0.25 mM)</li>
		<li>Incubar por 10 min a TA.</li>
		<li>Añadir 1 μL/pocillo de antimicina A (AA), solución madre 5 mM en etanol (concentración final = 25 μm).</li>
		<li>Incubar durante 50 min a 37 ° C en un incubador de CO2 .</li>
		<li>Retire las placas de la incubadora y coloque inmediatamente en hielo.</li>
		<li>Suavemente raspar las células y resuspender mediante pipeteo arriba y abajo. Mantener en hielo.</li>
		<li>Cargar la muestra en un tubo capilar. Selle ambos extremos.</li>
		<li>Consulte la sección anterior para el valor de APE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detección de superóxido en las células RAW 264.7 en 77 K
	<ol>
<li>Colocar el tampón recogido en el paso 1.1.10 preparado PTFE tubo 1-2 pulgadas de largo (3/16" OD x 1/8" ID). Asegúrese de que la tubería de PTFE es recta por lo que puede ser fácilmente insertado y removido del dedo dewar. Use un tapón de caucho para cerrar un extremo de la tubería de PTFE, pipetear el tampón o la suspensión de la célula (100 a 150 μL) en el tubo de PTFE y sellar el tubo con un tapón de segunda.</li>
		<li>Flash congelar la muestra en nitrógeno líquido. La muestra se transfirió a un tubo etiquetado criopreservación para almacenamiento a-80 ° C o ejecutar inmediatamente.</li>
		<li>Llenar el dedo dewar con nitrógeno líquido y coloque la tubería de PTFE que contiene la muestra en el dedo dewar. Asegúrese de que la muestra está centrada en el espacio activo del resonador y ejecutar EPR a 77 K. Nota: Iniciar el flujo de gas nitrógeno a su espectrómetro de 15-30 min antes de las mediciones y continuar este flujo a lo largo de las medidas para evitar la condensación de agua en el resonador.</li>
		<li>Definir los parámetros de adquisición de EPR a lo siguiente: frecuencia de microondas = 9,65 GHz; campo de centro = 3438 G; amplitud de modulación = 4,0 G; anchura de barrido = 150 G; potencia de microondas = 0.316 mW; número total de exploraciones = 10; tiempo de barrido = 60 s; y constante de tiempo = 1,28 ms.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EPR mediciones en líquidos
<ol><li>
Sangre entera
	<ol>
<li>Tratamiento de ratones (8-12 semanas) con una sola dosis de bleomicina intratraqueal (Bleo; 100 μL en 1 U/mL) disuelta en PBS o PBS solo como se describió anteriormente16,17.</li>
		<li>Eutanasia a ratones mediante la administración de isoflurano inhalado (1.5-4%) seguido de exsanguinación y la dislocación cervical. Aspirar sangre a través del ventrículo derecho en una jeringa con heparina (1000 USP/mL) conteniendo 100 μm DTPA y transfiéralo a un tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>En un tubo separado 1,5 mL, añadir 15 μl de PBS con DTPA de 100 μm y 3 μl de CMH (10 mM) a 132 μl de sangre para un volumen total de 150 μL y concentración final de CMH de 0,2 mM.</li>
		<li>Incubar sangre 10 min a 37 ° C en un baño de agua.</li>
		<li>Retirar los tubos del baño de agua.</li>
		<li>Tomar una alícuota por la carga de sangre en un tubo capilar y corren EPR RT con los siguientes parámetros de adquisición de EPR: frecuencia de microondas = 9,65 GHz; campo de centro = 3432 G; amplitud de modulación = 1,0 G; anchura de barrido = 80 G; potencia de microondas = 19,9 mW; número total de exploraciones = 3; tiempo de barrido = 12.11 s; y constante de tiempo = 20.48 Sra. alternativamente, las muestras pueden ser flash congelado como se describe en el paso 2.3 para las mediciones de parámetros de adquisición de 77 K. EPR son los siguientes: frecuencia de microondas = 9,65 GHz; campo de centro = 3438 G; amplitud de modulación = 4,0 G; anchura de barrido = 150 G; potencia de microondas = 0.316 mW; número total de análisis = 2; tiempo de barrido = 60 s; y constante de tiempo = 1,28 ms.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavado broncoalveolar (BALF)
	<ol>
<li>Después de la eutanasia (ver paso 3.1.2), recoger BALF por infundir lentamente y retirar 1 mL de PBS con 100 μm DTPA tres veces en una jeringa a través de una cánula colocada en la tráquea.</li>
		<li>En un tubo de 1,5 mL, tratar 200 μL de BALF con 4 μL de CMH (10 mM) para obtener una concentración final de 0,2 mM.</li>
		<li>Incubar BALF durante 50 min a 37 ° C en un baño de agua.</li>
		<li>Tome los tubos en el baño de agua y coloque en hielo.</li>
		<li>Carga BALF en un tubo capilar y EPR funcionamiento a temperatura ambiente con la misma configuración de EPR en paso 1.1.13 o flash congelar en nitrógeno líquido como se describe en el paso 2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medición de APE en sangre BALF en 77 K
	<ol>
<li>Seguir el protocolo para recoger la sangre (pasos 3.1.1. a 3.1.4) y BALF (pasos 3.2.1 a 3.2.4).</li>
		<li>Lugar 150 μL de sangre tratada o BALF en PTFE (1-2 in) de la tubería. Use un tapón de caucho para cerrar un extremo de la tubería de PTFE antes de añadir la muestra y otro tapón para sellar el tubo.</li>
		<li>Flash congelar la muestra en nitrógeno líquido.</li>
		<li>Ver punto 2.3 para detalles sobre la ejecución de EPR en muestras congeladas en tubería de PTFE con el dedo que Dewar en 77 K. funcionamiento congelados CMH había tratado muestras de sangre con en una semana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EPR medidas en tejido pulmonar
<ol><li>
Flash tejido pulmonar congelados
	<ol>
<li>Después de recoger el BALF en paso 3.2.1, se abre el pecho y pulmones enjuagarse con 10 mL de PBS frío a través del ventrículo derecho para quitar la sangre. Flash congelar el tejido pulmonar en nitrógeno líquido. Tejido pulmonar congelados puede almacenarse a-80 ° C hasta 6 meses hasta su uso para la medición de APE.</li>
		<li>Estabilizar el tejido pulmonar en hielo seco con unas pinzas y corte varios trozos pequeños (5-15 mg) de tejido pulmonar con un solo filo.</li>
		<li>Pese el tejido en un tubo de 1,5 mL, coloque el tubo en la balanza y Tarar la balanza, entonces añadir las piezas de tejido y registrar el peso.</li>
		<li>A los tejidos en el tubo de 1,5 mL, añadir 196 μl de KHB conteniendo DTPA y 4 μL de CMH (0,2 mM) para lograr un volumen total de 200 μl.</li>
		<li>Incubar durante 1 h a 37 ° C en un baño de agua.</li>
		<li>Desactivación (durante unos segundos) en una microcentrífuga a 3.884 x g.</li>
		<li>Coloque en hielo y Pipetear 150 μL del sobrenadante en el tubo de PTFE y congele para las mediciones de 77 K, como se describe en la sección 2.3. Nota: Para este método, debe considerarse la heterogeneidad de la lesión. Por una lesión pulmonar inducida por bleomicina, dado que es una lesión altamente heterogénea, se recomienda cortar varias piezas de tejido de diferentes partes del pulmón de cada ratón. Alternativamente, un pedazo más grande de tejido puede ser homogeneizado en tampón KHB que contiene 100 μm DTPA con una relación peso a volumen de 1:6 (mg/μL) como se describe a continuación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tejido pulmonar fresco conservado en tampón de sacarosa
	<ol>
<li>Limpie los pulmones lavaged con PBS frío para extraer sangre como hecho en el paso 3.1.2.</li>
		<li>Homogeneizar el tejido pulmonar fresco en tampón Tris-EDTA que contiene sacarosa de 0,25 M con una relación de 1:6 pulmón tampón (mg/μL) Dounce tejido molinillo con un vaso o mortero PTFE.</li>
		<li>Añadir 50 μl del homogeneizado de pulmón a 450 μl de KHB conteniendo 100 μm DTPA.</li>
		<li>En un tubo de 1.5 mL (en un volumen total de 100 μL), a 98 μl de homogenado de pulmón en KHB, añadir 2 μl de CMH de stock de 10 mM para obtener una concentración final de 0,2 mM.</li>
		<li>Incubar por 20 min 37 ° C en un baño de agua.</li>
		<li>Coloque las muestras en hielo y cargarlos en un tubo capilar. Ejecute el EPR en RT (ajustes de utilizado en paso 2.1.13).</li>
		<li>Para comprobar la contribución de fuentes utilizando diferentes inhibidores y especie específica, tratamiento previo 88 μl de homogenado de pulmón +-inhibidor, ajustar con KHB para alcanzar un volumen final de 98 μl. En este experimento, los inhibidores incluyen 10 μl de SOD (100 U/mL), 4 μL de deferoxamina (DFO; concentración final = 800 μm), o 4 μL de cloruro de diphenyliodonium (DIP; concentración final = 100 μm). Incubar por 20 min a 37 ° C en un baño de agua.</li>
		<li>Añadir 2 μl de CMH e incubar durante otros 20 minutos a 37 ° C, seguido por medidas de EPR como se describió anteriormente. Incluyen una única muestra en blanco emparejada con CMH KHB con tampón de sacarosa. Como alternativa, guardar alícuotas de los homogenados de pulmón restante (paso 3.1.2) a-80 ° C para futuras mediciones. Nota: El volumen total puede adaptarse según sea necesario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mediciones de EPR en tejido pulmonar de los ratones inyectados con spin sondas en vivo (a temperatura ambiente utilizando células de tejido)
	<ol>
<li>Preparar solución stock CPH disolviendo 4,9 mg de CPH en 1 mL de filtrado y desoxigenada 50 mM de tampón fosfato.</li>
		<li>Anestesiar ratones con isoflurano inhalado (1.5-4%) durante 20-30 segundos hasta que no responde al dedo del pie sujetador. Inyectar 100 μl de la sonda de spin CPH para un peso de 25 g ratón ruta de ratones vía retroorbital (dosis final = 20 mg/kg) y permitir que la sonda se circule durante 1 h. inmediatamente después de la inyección de retroorbital, añadir una gota de 0.5% proparacaine HCl en el área del ojo para preve sequedad y dolor en los ojos NT. Ratones por 1 h de monitor y proceda a tejidos.</li>
		<li>Cosechar el tejido pulmonar como se describió anteriormente y la congelación de flash los pulmones.</li>
		<li>Cortar 20-30 mg de tejido congelado en hielo seco y registrar el peso exacto.</li>
		<li>Limpie suavemente el tejido con paños para absorber cualquier agua superficial.</li>
		<li>Coloque el tejido dentro de la ventana de la célula de tejido (un accesorio permite realizar mediciones de EPR para muestras de tejido) y ejecute el EPR para determinar el total de giros. Los datos se pueden expresar como total giros por mg de tejido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>Simulación de los espectros EPR con SpinFit módulo incorporado en el software de xenón del espectrómetro EPR EMXnano de mesa. Determinar la concentración de nitróxido por el módulo de SpinCount. Alternativamente, puede realizarse una curva de calibración de un nitróxido estable como TEMPOL 4-hidroxi-TEMPO y la concentración puede obtenerse comparando la intensidad de la señal con la muestra y el patrón.</li>
	<li>Para los datos recogidos a 77 K, utilizar doble integración seguida por SpinCount.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La evaluación de la producción de radicales libres en entornos biológicos es importante en redox entendimiento reglamentado en salud y la enfermedad, pero la medida de estas especies es muy difícil debido a la corta vida media de las especies de radicales libres y técnicas limitaciones de los métodos comúnmente utilizados. EPR es una herramienta valiosa y poderosa en biología redox, ya que es el método sólo inequívoco para detectar radicales libres. En este proyecto demostramos métodos prácticos de EPR para diseñar exper...

Mientras que las medidas de estrés oxidativo y especies reactivas del oxígeno son importantes para el estudio de diversas enfermedades a través de todos los sistemas del órgano, la detección de especies de oxígeno reactivo (ROS) es un reto debido a la corta vida media y alta reactividad. Una técnica de resonancia paramagnética (EPR) del electrón es el método más claro para la detección de radicales libres. Puntas de prueba de giro tienen ventajas sobre las sondas fluorescentes más comúnmente utilizadas. Aunque sondas fluorescentes son relativamente baratas y fáciles de usar y proporcionar una detección rápida, sensible de ROS, tienen serias limitaciones debido a señales artifactual, la incapacidad para calcular concentraciones de ROS y una falta general de especificidad1 .
Para facilitar el uso de EPR para estudios biológicos, una variedad de sondas se han sintetizado de la vuelta que puede medir una gama de especies de radicales libres biológicamente relevantes como pO2, pH y redox indica2,3, 4,5,6,7. Las trampas de la vuelta también se han desarrollado para capturar a los radicales de breve duración y larga vida forma aductos, que facilita la detección por APE8. Ambas clases (sondas de spin y spin trampas) tienen ventajas y limitaciones. Una clase comúnmente usada de puntas de prueba de giro son hydroxylamines cíclicas, EPR-silencioso y reaccionan con los radicales de breve duración para formar un nitróxido estable. Hydroxylamines cíclicos reaccionan con el superóxido 100 veces más rápido que las trampas de la vuelta, permitiéndoles competir con antioxidantes celulares, pero carecen de especificidad y requiere el uso de controles apropiados y los inhibidores para identificar la especie radical o fuente responsable de la señal de nitróxido. Mientras que spin trampas exhiben especificidad, con distintas espectral patrones dependiendo de la especie atrapada, tienen cinética lenta para superóxido spin reventado y son susceptibles a la biodegradación de la radical aductos. Aplicaciones para la captura de vuelta han sido bien documentados en la investigación biomédica9,10,11,12,13.
El objetivo de este proyecto es demostrar métodos prácticos de EPR para el diseño de experimentos y preparación de muestras para detectar superóxido usando puntas de prueba en diferentes compartimentos celulares in vitro y en compartimientos de tejido diferente en vivo. Varios manuscritos han publicado protocolos pertinentes a estos objetivos, usando puntas de prueba de giro objetivo permeable a la célula, célula impermeable y mitocondrial al tejido distintos compartimentos celulares in vitro y proceso para el análisis en modelos de ratón 14 , 15. construir sobre este cuerpo de literatura mediante la validación de un método para medir superóxido usando una sonda de spin 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) en diferentes compartimentos celulares en vitro para asegurar precisa medidas, destacando posibles problemas técnicos que pueden sesgar los resultados. También ofrecemos métodos para realizar mediciones de APE en sangre, lavado broncoalveolar y tejido pulmonar utilizando la punta de prueba de giro CMH. Estos estudios comparan diferentes métodos para procesar los tejidos, así como presentar un método para inyectar otra sonda de spin, CPH, en ratones antes de la cosecha de tejido. Finalmente, desarrollamos un método práctico para almacenar las muestras en tubos de politetrafluoretileno (PTFE) para permitir el almacenamiento y transferencia de muestras antes de las mediciones de EPR a 77 K.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTech</td><td>10566-016</td><td>medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>Dietilentriaminoácido pentaacético (DTPA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6518-5G</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de sodio (NaCl)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; BP358-212</td><td>utilizado para preparar 50 mM de tampón salino de fosfato &nbsp; según Sigma aldrish &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>fosfato de potasio dibásico (HK2PO4 )</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; BP363-500</td><td>utilizado para preparar 50 mM de tampón salino de fosfato&nbsp; según Sigma aldrish&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>fosfato de potasio monobásico (KH2PO4 )</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-5379</td><td>utilizado para preparar 50 mM de tampón salino de fosfato &nbsp; según Sigma aldrish &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón Krebs-Henseleit (KHB)&nbsp;</td><td>(Alfa Aesar, Hill)</td><td>J67820</td><td></td></tr><tr><td>Superóxido dismutasa de eritrocitos bovinos (SOD)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; S7571-30KU</td><td></td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>Disolver en DMSO</td></tr><tr><td>Antimicina A (AA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674-25MG</td><td>Disolver en etanol y almacenar en viales de vidrio (MW utilizado es el peso molecular promedio para cuatro lotes)</td></tr> <tr><td>1-Hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina . HCl (CMH)</td><td>Enzo Ciencias de la Vida</td><td>ALX-430-117-M050</td><td></td></tr><tr><td>1-hidroxi-3-carboxi-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina . HCl (CPH)</td><td>Enzo Ciencias de la Vida</td><td>ALX-430-078-M250</td><td></td></tr><tr><td>1-Hidroxi-4-[2-trifenilfosfonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1-Hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-4-[2-(trifenilfosfonio)acetamido]dicloruro de piperidinio ( mito-TEMPO-H)</td><td>Enzo Ciencias de la Vida</td><td>ALX-430-171-M005</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de 1-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-4-il-trimetilamonio . HCl (CAT1H)</td><td>Enzo Ciencias de la Vida</td><td>ALX-430-131-M250</td><td></td></tr><tr><td>Heparina&nbsp;</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de difeniliodonio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43088</td><td></td></tr><tr><td>Sal de mesilato de deferoxamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9533-1G</td><td></td></tr><tr><td>Critoseal</td><td>Leica</td><td>39215003</td><td></td></tr><tr><td>MARCA desechable BLAUBRAND&nbsp; micropipetas, intraMark</td><td>Sigma Aldrich</td><td>708733</td><td>capilares</td></tr><tr><td>TUBO FRACCIONADO DE FLUOROPOLÍMERO DE PTFE 3/16" Diámetro exterior x 1/8" ID</td><td>NORELL</td><td>1598774A</td><td>Tubo de teflón&nbsp;</td></tr><tr><td>TAPONES DE CAUCHO DE SILICONA PARA TUBOS DE MUESTRA DE RMN&nbsp; PARA TUBOS DE PARED DELGADA CON UN DIÁMETRO EXTERIOR DE 4 mm-5 mm (3,2 mm A 4,2 mm DE DIÁMETRO INTERIOR) TS-4-5-SR</td><td>NORELL</td><td>94987</td><td></td></tr><tr><td>EMXnano Espectrómetro EPR de sobremesa&nbsp;</td><td>Bruker BioSpin GmbH</td><td>E7004002</td><td></td></tr><tr><td>CÉLULA DE TEJIDO NANO EMX</td><td>Bruker BioSpin GmbH</td><td>E7004542</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 k

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

La detección precisa y específica de especies reactivas del oxígeno (ROS) en diferentes compartimentos celulares y tejido es esencial para el estudio de la regulación de redox señalización en configuración biológica. Espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR) es el método directo sólo para evaluar inequívocamente los radicales libres. Su ventaja es que detecta los niveles fisiológicos de especies específicas con una alta especificidad, pero que requiere de tecnología especializada, preparación de la muestra cuidado y controles adecuados para asegurar la correcta interpretación de los datos. Sondas de vuelta cíclica hidroxilamina reaccionan selectivamente con superóxido u otros radicales para generar una señal de nitróxido que puede cuantificarse por espectroscopia de EPR. Permeable a la célula spin sondas y puntas de prueba de giro diseñados para acumular rápidamente en la mitocondria permiten la determinación de la concentración de superóxido en diferentes compartimentos celulares.
En cultivos de células, el uso de 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine permeable de la célula (CMH) a lo largo de con y sin pretratamiento de células impermeables de la superóxido dismutasa (SOD) o uso de PEG-SOD permeable a la célula, permite el diferenciación de extracelular de citosólica superóxido. La 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitocondrial] piperidinium dicloruro (mito-TEMPO-H) permite la medición de ROS mitocondriales (predominante superóxido).
Puntas de prueba de giro y espectroscopia del EPR pueden aplicarse también a los modelos en vivo . Superóxido puede detectarse en los fluidos extracelulares como la sangre y el líquido alveolar, así como los tejidos como el tejido pulmonar. Se presentan varios métodos para procesar y almacenar el tejido para las mediciones del APE y entregar 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine intravenosa (CPH) spin sonda en vivo. Mientras que las mediciones pueden realizarse a temperatura ambiente, muestras obtenidas de modelos in vitro e in vivo también pueden ser almacenadas a-80 ° C y analizadas por EPR en 77 K. Las muestras pueden almacenarse en el establo de tubería especializada a-80 ° C y corren de 77 K para permitir un práctico, eficiente y el método reproducible que facilita el almacenamiento y transferencia de muestras.

Detección de superóxido con CMH fue validada utilizando la X / superóxido XO genera el sistema para demostrar que la señal nitróxido (CM.) fue completamente inhibida por césped, mientras que la catalasa no tuvo ningún efecto (figura 1A). El superóxido extracelular, total luego fue evaluado en células RAW 264.7 células de incubación con la sonda de spin CMH permeable a la célula +-pretratamiento de SOD. Se midió la concentración de nitróxido en la s...

Espectroscopia de resonancia paramagnética (EPR) del electrón es un método inequívoco para medir a los radicales libres. El uso de puntas de prueba de giro selectivo permite la detección de radicales libres en diferentes compartimentos celulares. Se presenta un método práctico y eficiente para recolectar muestras biológicas que facilitan el tratamiento, almacenamiento y transferencia de muestras para mediciones de EPR.

Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

La señalización de redox desregulada está implicada en la patogénesis de diversas enfermedades. El estudio de la biología redox requiere la detección precisa de especies reactivas de oxígeno en diferentes compartimentos celulares y tisulares. La espectroscopia EPR es el único método que mide los radicales libres de forma inequívoca.Este protocolo demuestra un método práctico para la manipulación y almacenamiento de muestras biológicas para espectroscopia EPR. Estos protocolos ilustran el uso de sondas EPR y spin en dos modelos representativos. Aunque se pueden adaptar para evaluar las especies activas en otros entornos biológicos.El diseño del experimento y el manejo de la muestra son críticos para su reproducibilidad. Recomendamos considerar la densidad de celdas y garantizar controles adecuados que coincidan con el tiempo. Comience lavando suavemente 264,7 células crudas con un mililitro de Krebs-Henseleit Buffer o KHB, por pozo.Y tratar las células con 500 microlitros de KHB, complementados con 100 micromil de DTPA por pozo. Para pretratar con superóxido dismutasa, agregue 15 microlitros de material de superóxido dismutasa, o vehículo, a cada pozo, y coloque la placa a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Al final del pretratamiento de superóxido dismutasa, añadir 12,5 microlitros de 10 CMH mililolares y 40 microlitros de 125 micromolares PMA solución de trabajo a los pozos adecuados, e incubar a 37 grados Celsius durante 50 minutos.Coloque inmediatamente las placas sobre hielo y recoja el tampón de cada pozo en tubos individuales de 1,5 mililitros sobre hielo. A continuación, agregue 100 microlitros de KHB fresco más DTPA a cada pozo y raspe suavemente las células de la parte inferior de cada pozo. Luego resuspendir las suspensiones celulares con pipeteo y transferir las células a tubos individuales de 1,5 mililitros sobre hielo.Para la detección de superóxido a temperatura ambiente, primero cargue 50 microlitros de un tampón o muestra de célula en un tubo capilar y selle el tubo. Coloque inmediatamente el tubo en la resonancia paramagnética de electrones, o EPR, espectrómetro y establezca los parámetros de adquisición de EPR para las mediciones de temperatura ambiente. Pruebe siempre una muestra en blanco de búfer que contenga la misma concentración de sonda tratada en las mismas condiciones experimentales que un control.Para la detección de superóxido a 77 grados Kelvin, cargue 150 microlitros de una muestra en una pieza de una a dos pulgadas de politetrafluoroetileno recto, o PTFE, tubo, con un tapón de goma en un extremo. Selle el otro extremo del tubo con un segundo tapón y congele la muestra en nitrógeno líquido. A continuación, retire rápidamente los tapones y coloque el tubo de PTFE en un criotubo etiquetado para el almacenamiento de nitrógeno líquido.Para las mediciones de EPR, llene la dewar del dewar del espectrómetro EPR con nitrógeno líquido y coloque el tubo de PTFE que contiene la muestra en el nitrógeno líquido. Coloque la dewar del dedo en el espectrómetro EPR y establezca los parámetros de adquisición de EPR para las mediciones en 77 grados Kelvin. Para la detección de ROS en el tejido pulmonar congelado, coloque el tejido sobre hielo seco y use pinzas para estabilizar el tejido congelado por el flash en hielo seco.Cortar la muestra en cinco trozos de 15 miligramos, y pesar las piezas en un tubo de tarado de 1,5 mililitros. Añadir 196 microlitros de KHB más DTPA y cuatro microlitros de CMH a la muestra, e incubar la muestra pulmonar durante una hora en un baño de agua de 37 grados Celsius antes de peletizar los fragmentos de tejido con una breve centrifugación. A continuación, coloque la muestra sobre hielo antes de transferir 150 microlitros del sobrenadante en un pedazo de tubo de PTFE para la congelación de flash en la preparación de la medición de EPR como se acaba de demostrar.La evaluación de la producción total de superóxido en células crudas 264,7 estimuladas con PMA como se ha demostrado, revela que la concentración de nitroxida tanto en la suspensión celular como en el tampón de las células tratadas con PMA es similar, debido a la naturaleza permeable y al rápido equilibrio de la sonda de espín. La señal de los radicales de nitroxida aumenta en células crudas 264,7 estimuladas con PMA, en comparación con las células de control, pero no en células pretratadas con superóxido impermeable celular dismutasa. La concentración de nitroxida obtenida a bajas temperaturas en células crudas 264,7 después de la estimulación con PMA también se atenúa en presencia de superóxido dismutasa consistente con los datos de temperatura ambiente.La concentración de nitroxida aumenta en la sangre y el líquido de lavado broncoalveolar de ratones bleo y ratones tratados, así como dentro de los sobrenadantes de piezas de tejido pulmonar cosechadas de ratones bleo y animales heridos, en comparación con los controles tratados con PBS. Además, después de la inyección retro-orbital de la sonda de espín, los ratones bleo y los animales tratados demuestran una señal de sonda de espín más alta en comparación con los controles. Estos protocolos prácticos permitirán a los investigadores probar la producción de radicales libres en diferentes compartimentos celulares y muestras biológicas por EPR, incluidas las mediciones de baja temperatura.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo describe un método de tres dimensiones escala micrométrica imágenes de la concentración de oxígeno en el entorno inmediato de las células vivas por microscopía electrónica de resonancia de spin.

Resonancia de spin electrónico micro imágenes en vivo de las especies para la asignación de oxígeno

Este video describe la técnica de espectroscopia de resonancia magnética nuclear para estudiar las interacciones proteína-proteína entre 15proteínas envoplakina mutantes y de tipo salvaje marcadas con N y la proteína vimentina no marcada. La interacción exitosa entre la envoplaquina de tipo salvaje y la vimentina conduce a un amplio ensanchamiento de la línea y a la desaparición de picos en los espectros de RMN, mientras que la ausencia de una interacción entre la envoplaquina mutada y la...

Resonancia magnética nuclear para estudiar las interacciones proteína-proteína a nivel atómico

Un método nuevo de resonancia paramagnética electrónica (EPR), rápidos de escaneo de EPR (RS-EPR), se demuestra para la imagen espacial espectral 2D que es superior a la técnica tradicional de onda continua (CW) y abre nuevos lugares para formación de imágenes in vivo. Los resultados se demostraron a 250 MHz, pero la técnica es aplicable a cualquier frecuencia.

El rápido escaneo de electrones resonancia paramagnética abre nuevas vías para Imaging fisiológicamente parámetros importantes<em&gt; En Vivo</em

Se presenta un protocolo para la monitorización in situ de la difusión de moléculas huésped en medios porosos mediante imágenes de resonancia paramagnética electrónica (EPR).

Monitoreo in situ de la difusión de las moléculas huéspedes en medios porosos Usando Resonancia paramagnética de electrones

Estructuras de conjuntos supramoleculares proteína a resolución atómica son de alta relevancia debido a su papel crucial en una variedad de fenómenos biológicos. Adjunto, presentamos un protocolo para llevar a cabo estudios estructurales de alta resolución en asambleas de proteína macromolecular insoluble y no-cristalino magic-angle spinning estado sólido de resonancia magnética nuclear espectroscopia (MAS SSNMR).

Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear

Aquí, presentamos un protocolo para la producción y purificación de proteínas que están marcados con isótopos estables y posterior caracterización de las interacciones de la proteína-proteína usando la espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Los experimentos de Thermophoresis (MST).

Medición de las interacciones de las proteínas globulares y filamentosas por espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Thermophoresis (MST)

Este protocolo presenta un procedimiento detallado para preparar criomuestras biológicas para experimentos de espectroscopia de absorción de rayos X basados en sincrotrón. Describimos todos los pasos necesarios para optimizar la preparación y criopreservación de muestras con ejemplos del protocolo con células de cáncer y fitoplancton. Este método proporciona un estándar universal de criopreparación de muestras.

Preparación de muestras biológicas para la especiación a temperatura criogénica mediante espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución

Aquí se presenta un protocolo para la transferencia criogénica de muestras congeladas a la sonda de resonancia magnética nuclear (RMN) de ángulo mágico de polarización nuclear (DNP) de giro mágico (MAS). El protocolo incluye instrucciones para el almacenamiento del rotor antes del experimento e instrucciones para las mediciones de viabilidad antes y después del experimento.

Carga criogénica de muestras en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear de ángulo mágico que preserva la viabilidad celular

Las estructuras moleculares y la dinámica de sólidos, líquidos, gases y mezclas son de interés crítico para diversos campos científicos. Mas NMR in situ de alta temperatura y alta presión permite la detección del entorno químico de los componentes en sistemas de fase mixta en entornos químicos estrictamente controlados.

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear giratoria en ángulo mágico in situ de alta temperatura y alta presión

Se presenta un protocolo para la aplicación de espectroscopía de RMN de mejora de la relajación paramagnética para detectar interacciones inter e intramoleculares débiles y transitorias en proteínas intrínsecamente desordenadas.

Mejora de la relajación paramagnética para detectar y caracterizar las autoasociaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Aprende a manejar y almacenar muestras biológicas para espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica a temperatura ambiente y 77 K. Este protocolo permite detectar radicales libres en modelos celulares y tejidos con sondas de espín selectivas.

Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K

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