Name: Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a identificar eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón mediante Southern blot y PCR. Este protocolo preciso permite generar modelos genéticos como el reemplazo de miosina II no muscular.

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Este trabajo recibió apoyo del Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (subvenciones no. 31571432), el humano Provincial Ciencias naturales Fundación de China (Grant No. 2015JC3097) y la investigación Fundación de Educación Oficina de Hunan Provincia, China (Grant no. 15 K 054).

1. diseño de la focalización Construct(s), puntas de prueba de Southern Blot y cebadores para PCR
<ol><li>Seleccione el primer exón (exón 2) codificación del gen Myh9 de inserción o interrupción en la aplicación del nocaut/knock-in divulgado aquí.</li>
	<li>Recuperar las 5 kb aguas arriba y 5 kb abajo secuencias de ADN que rodea el Myh9 exón 2 de la Página Web genome.ucsc.edu .</li>
	<li>Analizar patrones de digestión de la restricción de enzimas (REs) con cortes de 1-2 en esta región de 10 kb, utilizando el software de pDRAW para determinar RE(s) conveniente para digerir el ADN genómico para borrar meridional. Nota: Dra cumple este requisito y se selecciona para el propósito.</li>
	<li>Seleccione un fragmento de 4 kb inmediato aguas arriba del exón Myh9 2 como el brazo izquierdo de homología (LHA) y una secuencia descendente inmediata de 1,7 kb fragmento como el brazo derecho de homología (RHA); elegir un fragmento de 1 kb 5' aguas arriba de la LHA como la sonda de izquierda (LP) para borrar meridional y un fragmento de 1,2 kb 3' aguas abajo de la RHA como la punta de prueba derecho (RP), basado en el análisis anterior.</li>
	<li>Utilice un programa primer3 para diseñar los cebadores de avance y retroceso para amplificar los cuatro fragmentos de DNA por PCR. Diseño de un par de primers con el primer avance residido cerca de la terminal 3' de un gen de resistencia del neomyocin del marcador de la selección (P1) y la cartilla reversa ubicado a las afueras de la RHA (P2). Nota: Este par de imprimación se utilizará para la identificación de clones ES dirigidas por PCR29.</li>
	<li>Encontrar un clon de BAC 129Sv cubriendo el lugar geométrico del gene de ratón Myh9 visitando el sitio web de bacpac.chori.org (Nota: ADN isogénicas es preferido). Aislar ADN BAC utilizando un kit adecuado para purificar los pedazos grandes de ADN siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Nota: Se utilizará como plantilla de ADN purificado de BAC para amplificación por PCR.</li>
	<li>Dibujar una representación esquemática del targeting construcciones, sondas y primers para resumir esta información.</li>
</ol>2. generación de apuntar Construct(s) y puntas de prueba de Southern Blot y la preparación de los Primers para PCR
<ol><li>Ordenar los cebadores PCR descritos anteriormente y disolverlos en una concentración de 20 μm.</li>
	<li>Amplificar los brazos de homología y las puntas de prueba por PCR en una solución de reacción incluye 1 μl μl hacia adelante y 1 reversa imprimaciones, 1 μl de ADN BAC (50 ng) como la plantilla, 5 μl de tampón de Pfu y 1 μl de Pfu ultra como la ADN polimerasa , y H2O hasta 50 μl. llevar a cabo la polimerización en cadena en una máquina PCR bajo las siguientes condiciones: 95 ° C por 3 min; 95 ° C por 30 s; 60 ° C por 30 s; 72 ° C y a 1 kb/min; 30 ciclos; por último, 72 ° C 10 minutos.</li>
	<li>Purificar productos PCR utilizando un kit de limpieza PCR según el protocolo proporcionado por el fabricante y eluir los fragmentos de ADN con 40 μl de H2O. Resumen de los productos PCR purificados con REs prediseñados en una solución de reacción que contiene 5 μl de tampón de x 10 para la REs , 2.5 μl de RE1 y 2,5 μl de RE2 y el ADN eluído, a 37 ° C por 2 h. correr un gel de DNA 1% separar bandas de ADN blanco, suprimir el gel que contiene el ADN bajo luz UV, Diana purificar los fragmentos de DNA de la blanco del gel con una extracción de gel de DNA kit según en el protocolo proporcionado por el fabricante y eluir los fragmentos de ADN con 40 μl de H2O.</li>
	<li>Clonar los brazos de homología y casetes de expresión de reemplazo en el vector de mpNTKV-LoxP según el orden de los amplificados y purificados RHA, LHA y reemplazo expresión casetes de otros vectores para obtener el objetivo final Construct(s). Clonar fragmentos de ADN de las sondas amplificadas y purificadas en el vector T-fácil.</li>
	<li>Las secuencias de nucleótidos de todos los fragmentos de ADN clonados para confirmar la secuencia27,28.</li>
</ol>3. preparación de apuntar el Construct(s), la electroporación de células madre embrionarias y la amplificación de los Clones ES
<ol><li>Preparar cada dirigida a construir usando un plásmido maxiprep kit según el protocolo proporcionado por el fabricante. Alinear cada plásmido construcción por digerir no i en una reacción de 400 μL incluyendo 40 μl de buffer 10 x para no I, 10 μl de no, 100 μg de DNA y H2O hasta 400 μL, a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Purificar el construct(s) segmentación lineal.<ol>
<li>Extraer la solución de reacción digerido 1 x con un volumen igual de Alcohol de fenol: cloroformo: isoamílico (25:24:1) y centrifugar a una fuerza de 2.000 x g por 10 min.</li>
		<li>Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL, precipitar el ADN con 2.5 x etanol y 0.1 x 3M acetato de sodio (pH 5,2) (cociente del volumen) y centrifugar a una fuerza de 2.000 x g por 10 min.</li>
		<li>Eliminar el sobrenadante, lavado el ADN 1 x con 1 mL de etanol al 75% de pellets y centrifugar a una fuerza de 2.000 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y secar el pellet de ADN durante 5 minutos.</li>
		<li>Disolver el precipitado de DNA lineal en estéril buffer Tris-EDTA (TE) a una concentración final de 1 μg/μl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mezclar 50 μg de cada construcción segmentación lineal con 0,5 x 107 ES células. Realizar la electroporación en 320 V y 250 μF. placa las células electroporated ES en platos con alimentadores MEF neo-resistente.</li>
	<li>Después de 24 h, cambie a medio de celular ES con 400 μg/mL G418 y 200 μm ganciclovir y continúan cultura de 4 – 5 días con un cambio medio diario. Recoger resistente a los medicamentos ES clones en placas de 48 pocillos. Nota: Normalmente, se utilizan cuatro placas de 48 pocillos por construir.</li>
	<li>Duplicar las placas 48-bien. Nota: Un sistema de las placas es criopreservado, y el otro sistema se utiliza para la preparación de ADN genómico.</li>
</ol>4. preparación de DNAs Genomic y la digestión con Restriction Enzyme(s)
<ol><li>Preparar gDNAs de células madre embrionarias utilizando un kit comercial (kit de purificación de ADN genómico) con modificaciones menores.<ol>
<li>Quitar los medios de comunicación de la cultura de célula ES y agregar 500 μl de solución de lisis de núcleos, incluyendo RNaseA, directamente a los pozos para lisar las células. Nota: El lisado celular puede ser almacenada a-80 ° C o tratada inmediatamente.</li>
		<li>Pipeta de arriba y abajo varias veces para lisar las células completamente y transferirlos a un tubo limpio de 1,5 mL.</li>
		<li>Añadir un tercio del volumen de la solución de precipitación de la proteína en el tubo de 1,5 mL, vortex vigorosamente durante 20 s, enfriar las muestras en hielo durante 5 minutos y luego centrifugar a una fuerza de 2.000 x g durante 5 min transferencia el sobrenadante a otro limpio de 1,5 mL tubo contai Ning un volumen igual de isopropanol; mezclar suavemente la solución. (Nótese que blancas hebras de hilo-como pueden verse en este momento). Centrifugar a una fuerza de 2.000 x g durante 1 min; a continuación, descartar el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar el sedimento gDNA con 1 mL de etanol al 70% a temperatura ambiente, centrifugar a una fuerza de 2.000 x g durante 1 min, aspirar el sobrenadante con cuidado y luego, secar el pellet gDNA por 3 min.</li>
		<li>Disolver el gDNAs con 100 μl de solución de rehidratación de ADN y, luego, incubar a 65 ° C por 1 h o a 4 ° C durante la noche.</li>
		<li>Tienda el gDNAs a 2 – 8 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resumen de la gDNAs con prediseñados RE Dra I. situado encima de una reacción de digestión 30 μL mezclando 3 μl de 10 x tampón para Dra I, 3 μl de Dra I, 10 μg de muestra de gDNAs y H2O hasta 30 μl e incubar a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Comprobar la integridad de la digestión por el gel de ADN, análisis de 5 μl de la reacción digerida y luego agregar 3 μl de 10 x buffer de carga de ADN para el paso posterior.</li>
</ol>5. Southern blot y PCR identificación
<ol><li>Southern blot proyección<ol>
<li>Separar la gDNAs digerido por electroforesis y transferencia a una membrana.<ol>
<li>Preparar un gel de electroforesis de agarosa al 1% con bromuro de etidio (EB), cargar las muestras de paso 4.3 y una escalera de 1 kb y correr el gel con una tensión baja (30-40 V) durante la noche.</li>
			<li>Sacar el gel y tomar una foto con un sistema de proyección de imagen de gel de ADN después de la electroforesis. Compruebe si el digerido y separados gDNAs mostrar una borrón de transferencia de imagen.</li>
			<li>Remojo el gel en una bandeja con solución de ácido clorhídrico N 0.2 y agitar suavemente durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Transferir el gel a la solución de desnaturalización de DNA y agitar suavemente durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Cambiar el gel en la solución de ADN neutralizando y agitar suavemente durante 20 min a temperatura ambiente. Nota: El gel es propenso a la rotura después de este paso, por lo que debe ser manipulado con cuidado.</li>
			<li>Utilice el sistema de transferencia hacia abajo rápido para transferir el ADN del gel a la membrana. Monte la TurboBlotter y Blot pila según las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Nota: 10 x o 20 x solución de citrato de sodio solución salina (SSC) se utiliza como un buffer de transferencia. En general, 3 h de transferencia es bastante para transferir el 95% de gDNAs de gel a la membrana; sin embargo, un tiempo de transferencia es inofensivo.</li>
			<li>Sacar la membrana y lavar con 2 x SSC de 1 minuto, absorber el líquido con los tejidos y luego reaccione el ADN con la membrana usando un crosslinker UV. Nota: La membrana puede almacenarse a 4 ° C durante una semana.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Etiqueta de las sondas de ADN con radiactividad.<ol>
<li>Purificar la plásmidos de la sonda utilizando un miniprep kit según el protocolo proporcionado por el fabricante.</li>
			<li>Liberación del ADN fragmentos de las sondas del vector plásmido por EcoR digestión en una solución de reacción incluyendo 5 μl de tampón de EcoR I, 2 μl de EcoR I enzima, 20 μg de plásmido ADN y H2O hasta 50 μl , por 2 h.</li>
			<li>Ejecutar un 1% gel de DNA para separar los fragmentos de ADN de la sonda desde el vector y purificar los fragmentos de ADN de las sondas con un kit de extracción de gel de ADN según el protocolo proporcionado por el fabricante.</li>
			<li>Utilizando 1 μl de solución de ADN, medir la concentración de ADN de los fragmentos de ADN de la sonda con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260/280 nm.</li>
			<li>Preparar 40 ng de sonda de ADN en un tubo de 1,5 mL con 45 μl de tampón TE, hervir durante 3 minutos, girar brevemente y luego, coloque los tubos en hielo durante 2 minutos.</li>
			<li>Añadir el ADN sonda desnaturalizada por el calor al tubo que contiene granos de etiquetado ADN listo a (-dCTP), pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar, añadir 5 μl de [α32P] dCTP y luego, incubar a 37 ° C durante 15 minutos.</li>
			<li>Purificar las puntas de prueba etiquetadas usando microcolumns G-50 según las instrucciones proporcionadas por el fabricante y, luego, medir la radiactividad de un contador de centelleo (opcional).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hibridar el membrane(s) con las puntas de prueba etiquetadas.<ol>
<li>Prehybridize la membrana.<ol>
<li>Precaliente la solución de hibridación a 42 ° C para 30 min mezclar 20 mL de solución de hibridación precalentado con 200 μg de esperma de salmón hervida ADN en un tubo de 50 mL.</li>
				<li>Colocar la membrana en el tubo de hibridación. Agregar la solución prehybridization mezclada al tubo de hibridación. Coloque en el horno de hibridación (sistema del balanceo y la temperatura a 42 ° C) y dejar que la prehybridization durante 30 minutos.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Hibridar la membrana con la sonda marcada.<ol>
<li>Sacar el tubo de hibridación y verter la solución prehybridization en un tubo de 50 mL; Añadir la sonda desnaturalizada (calentada a 100 ° C por 3 min) de paso 5.1.2.7 a este tubo y mezcla suavemente. Nota: Reducir cualquier inducir burbujas.</li>
				<li>Devolver la solución mezclada al tubo de hibridación y efectuar la hibridación a 42 ° C durante la noche.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lavar la membrane(s) para quitar las puntas de prueba nonhybridized.<ol>
<li>Coloque el membrane(s) en una bandeja con 1 x SSC + 0.1% SDS y agitar suavemente en el 55 – 60 ° C durante 10 minutos.</li>
			<li>Transferir el membrane(s) a una bandeja con 0,5 x SSC + SDS 0.1% y agitar suavemente en el 55 – 60 ° C durante 10 minutos.</li>
			<li>Comprobar la radiactividad en el membrane(s) mediante un contador Geiger portátil para decidir si un tercer lavado es necesario.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Exponga la radiactividad en la membrana a películas de rayos x.<ol>
<li>Retire el líquido de los lavados membrane(s).</li>
			<li>Envuelven la membrane(s) con envoltura de plástico y fijar it/ellos en el cassette de la exposición.</li>
			<li>Exponer la membrana dos hojas de película de rayos x en un cuarto oscuro.</li>
			<li>Coloque el cartucho de la exposición a-80 ° C durante la noche o más.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Desarrollar las películas para visualizar los resultados. Evaluar si un clon ES correspondiente es la deseada con la recombinación específica o no, según los tamaños de las bandas de ADN detectados por las sondas.</li>
		<li>Rehybridize la misma membrana por otra sonda después de la extracción de la sonda usada según el siguiente procedimiento: sacar la membrana utilizada, lavar 1 x con limpiar el H2O y luego, la incubar en la solución de bandas (55% de formamida, 2% PES, 1% SDS, H 2 O) a 65 ° C con agitación suave durante 1 – 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Identificación de la PCR
	<ol>
<li>Realizar la identificación de la polimerización en cadena de los clones ES deseados en una solución de reacción de 50 μl incluyendo 5 μl de buffer de x PCR 10, 2 μl de 50 mM MgSO4, 1 μl de dNTP 10 mM, 1 μl de cebador forward 20 μm, 1 μl de cebador inverso de 20 μm , 1 μl de Taq platinum de alta fidelidad, gDNAs (~ 100 ng) y H2O hasta 50 μl.</li>
		<li>Utilice las siguientes condiciones de reacción de PCR: una desnaturalización inicial a 94° C por 3 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94° C por 30 s, recocido a 60° C por 30 s y una extensión a 68° C 132 s y un paso final de 68° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Analizar los productos PCR por electroforesis en agarosa al 1.0%.</li>
		<li>Clonar los fragmentos PCR con el tamaño esperado en el vector T-easy y la secuencia para confirmar la presencia de una secuencia parcial del vector objetivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+combining+homologous+recombination+and+site-specific+recombination+for+targeted+mutagenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).</li>
<li>Skarnes, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).</li>
<li>Vogel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nobel+Prizes.+A+knockout+award+in+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nobel Prizes. A knockout award in medicine.</a> Science. 318 (5848), 178-179 (2007).</li>
<li>Salsman, J., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+genome+editing+in+the+CRISPR+era%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry.+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Precision genome editing in the CRISPR era.</a> Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).</li>
<li>Capecchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).</li>
<li>Van, dW. L., Adams, D. J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+targeted+manipulation+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Tools for targeted manipulation of the mouse genome.</a> Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).</li>
<li>Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+issues+in+mouse+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Current issues in mouse genome engineering.</a> Nature Genetics. 37 (11), 1187(2005).</li>
<li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).</li>
<li>Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+genes+introduced+into+cultured+pluripotential+cells+by+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector.</a> Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).</li>
<li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51 (3), 503-512 (1987).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474 (7351), 337(2011).</li>
<li>Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+for+all+reasons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mouse for all reasons.</a> Cell. 128 (1), 9-13 (2007).</li>
<li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).</li>
<li>Pettitt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agouti+C57BL%2F6N+embryonic+stem+cells+for+mouse+genetic+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.</a> Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).</li>
<li>Gertsenstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Germ+Line+Transmitting+Chimeras+from+C57BL%2F6N+ES+Cells+by+Aggregation+with+Outbred+Host+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos.</a> PLoS One. 5 (6), 11260(2012).</li>
<li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+%7C%5Bbeta%5D%7C-globin+locus+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).</li>
<li>Deng, C., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexamination+of+gene+targeting+frequency+as+a+function+of+the+extent+of+homology+between+the+targeting+vector+and+the+target+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus.</a> Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365(1992).</li>
<li>Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+confirmation+of+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells+using+two+long-range+PCR+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques.</a> Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).</li>
<li>Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+quantitative+detection+of+homologous+and+non-homologous+recombination+events+using+three+oligonucleotide+MLPA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA.</a> Nucleic Acids Research. 33 (22), 188(2005).</li>
<li>Gómezrodríguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+q-PCR+as+a+method+of+screening+for+gene+targeting+in+mammalian+cells+using+conventional+and+whole+BAC-based+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs.</a> Nucleic Acids Research. 36 (18), 117(2008).</li>
<li>Kim, H. S., Smithies, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+fragment+assay+for+gene+targeting+based+on+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction.</a> Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).</li>
<li>Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+mutation+in+mouse+En-2+gene+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).</li>
<li>Ma, X., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+vertebrate+nonmuscle+Myosin+II+in+development+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease.</a> Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).</li>
<li>Malonek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+the+dynamics+of+cortical+blood+flow%2C+oxygenation%2C+and+volume+changes+following+sensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).</li>
<li>Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+and+mutation+of+nonmuscle+myosin+heavy+chain+II-B+results+in+a+defect+in+cardiac+myocyte+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis.</a> Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).</li>
<li>Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+cell+adhesion+and+the+visceral+endoderm+following+ablation+of+nonmuscle+myosin+heavy+chain+II-A+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).</li>
<li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+II+isoform+and+domain+specificity+during+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease%3A+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238(2012).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+MYH9+locus+for+high+efficient+gene+knock-in+and+stable+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 13 (2), 0192641(2018).</li>
<li>Saito, S., Adachi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+Development+of+Gene-Targeting+Vectors+to+Increase+the+Efficiency+of+Genetic+Modification%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).</li>
<li>Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+quantitative+detection+of+homologous+and+non-homologous+recombination+events+using+three+oligonucleotide+MLPA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA.</a> Nucleic Acids Research. 33 (22), 188(2005).</li>
<li>Martin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+ORF1+dramatically+decreases+L1+retrotransposition+and+provides+insight+into+nucleic+acid+chaperone+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity.</a> Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Research. 33 (19), 173(2005).</li>
<li>Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pig+gene+knockout+by+rAAV-mediated+homologous+recombination%3A+comparison+of+BRCA1+gene+knockout+efficiency+in+Yucatan+and+G%C3%B6ttingen+fibroblasts+with+slightly+different+target+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences.</a> Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).</li>
<li>Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+design+of+genomic+Southern+blot+probes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Automated design of genomic Southern blot probes.</a> BMC Genomics. 11 (1), 74(2010).</li>
<li>Zimmer, A., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+chimaeric+mice+containing+embryonic+stem+%28ES%29+cells+carrying+a+homoeobox+Hox+1.1+allele+mutated+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination.</a> Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En la actualidad, diseñador nucleasas para la edición del genoma todavía no pueden reemplazar ES célula gene targeting tecnología debido a sus problemas de efectos off-target y dificultad en la inserción de un ADN largo fragmento30,31. Como los métodos de oro para identificar eventos de HR que se producido en células de ratón ES, este informe proporciona un protocolo detallado de Southern blot y de PCR para el campo. Validamos la fiabilidad de estos métodos media...

La tecnología del gene targeting por HR en células de madre embrionarias murinas proporciona una poderosa herramienta para disecar las consecuencias celulares de mutaciones genéticas específicas1,2. La importancia y el significado de esta tecnología se reflejan en su reconocimiento por el Premio 2007 Nobel en la fisiología o la medicina3,4; mientras tanto, representa el advenimiento de la era moderna de la ingeniería gen5. Gene targeting por hora puede ser utilizado para diseñar prácticamente cualquier alteración que van desde mutaciones puntuales a grandes cambios cromosómicos en el genoma del ratón ES células6,7. Es bien sabido que, antes de la aparición de herramientas de edición llamado genoma, la generación de un ratón knockout de genes requiere la aplicación de tecnología gene targeting en ES las células8,9,10. Durante las últimas dos décadas, más de 5.000 ratones dirigidos por gene fueron producidos por este enfoque para modelar enfermedades humanas o el estudio de las funciones del gen11. Un esfuerzo de nocaut en el genoma se ha establecido para la distribución de vectores gene targeting objetivos clones de células ES y ratones vivos a la comunidad científica2,12,13,14 , 15. sin duda, ES celular tecnología basada en HR-mediated gene targeting ha avanzado grandemente nuestra comprensión de las funciones de los genes en el contexto fisiológico o patológico.
Debido a que HR es un evento relativamente infrecuente en mamíferos células16,17, la importante y siguiente paso después de gene targeting en células de madre embrionarias murinas es analizar numerosas colonias ES para la identificación de algunos clones con mutaciones resultantes de Recursos humanos con el objetivo de vectores18. Los métodos del oro para la identificación de eventos de recursos humanos incluyen Southern blot y PCR19,20. Las ventajas de los enfoques incluyen que borrar meridional puede identificar clones ES correctamente dirigidas y permite a los investigadores a analizar la estructura del evento dirigido de genes, como una verificación de una inserción de copia única de la construcción, mientras que un Estrategia basada en la PCR permite la detección más rápida de HR eventos21,22. Aunque estos métodos tienen inconvenientes, como que son lentos y pueden tener falsos positivos, el uso de la combinatoria de ellos es ampliamente aceptados y aplicados por los laboratorios más en la identificación de eventos de recursos humanos, particularmente en células madre embrionarias, para generar genéticamente modificado animales.
Tres isoformas de la miosina UROLOGICAL II (NM II) en los mamíferos, cada uno con dos IIs NMHC idénticos que son codificadas por tres genes diferentes (llamado Myh9 Myh10 y Myh14) y dos pares de cadenas ligeras, se denominan NM II-A, II B y II-C23. Estudios previos han indicado que al menos las isoformas de NM II-A y II-B son esenciales para el desarrollo del ratón debido a la ablación en vivo de estas isoformas en mortalidad embrionaria24,25,26. Para evitar este problema y obtener nuevos conocimientos sobre las funciones específicas de la isoforma de NM II-A y II-B en las últimas etapas del desarrollo del ratón, un reemplazo genético estrategia tecnología ES celular HR-mediated gene targeting se adoptó para generar una serie de modelos de ratón27. En el curso de identificación de los clones ES deseados, borrar meridional y los métodos de PCR fueron utilizados, y estas demostraron para ser eficiente y confiable27,28.
Este documento pretende proporcionar una descripción detallada de Southern blotting y PCR, incluyendo el diseño de la focalización vector(s), sonda y cartillas y la ejecución de los experimentos, así como el análisis de resultados ejemplificados mediante la identificación de eventos de recursos humanos ocurrencia en células madre embrionarias para la creación de ratón de recambio genético NM II modelos y datos representativos. Los protocolos de estos dos métodos presentados aquí también pueden ser adoptados para la identificación de los genotipos de células genéticamente modificadas o los animales.

<table><tbody><tr><td>CLON DE BAC</td><td>Centro de Recursos de BACPAC (BPRC)</td><td>BMQ-330E21</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Kit de construcción grande</td><td>QIAGEN</td><td>12462</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purificación de PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra Alta Fidelidad ADN Polimerasa</td><td>Agilent</td><td>600382</td><td></td></tr><tr><td>Vector T-easy</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Solución de lisis de núcleos</td><td>Promega</td><td>A7941</td><td></td></tr><tr><td>Solución de precipitación de proteínas</td><td>Promega</td><td>A7951</td><td></td></tr><tr><td>Solución desnaturalizante de ADN</td><td>VWR</td><td>351-013-131</td><td></td></tr><tr><td>Solución neutralizante de ADN</td><td>VWR</td><td>351-014-131</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de etiquetado de ADN listas para usar (-dCTP)</td><td>VWR</td><td>27-9240-01</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPur Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1, v/v)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15593031</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Thermo Fisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>Solución de ADN de esperma de salmón</td><td>Thermo Fisher</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>Platinu Taq ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>Thermo Fisher</td><td>11304029</td><td></td></tr><tr><td>Not I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0592</td><td></td></tr><tr><td>Dra I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0221</td><td></td></tr><tr><td>EcoR I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td></td></tr><tr><td>Ganciclovir</td><td>Sigma</td><td>G2536</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; Sistema de Transferencia TurboBlotter, Kits Grandes</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-301-188</td><td></td></tr><tr><td>[&alpha; 32P]dCTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG013H100UC</td><td></td></tr><tr><td>ProbeQuan G-50 Micro Columnas</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9034-08</td><td></td></tr><tr><td>Hybrisol I Solución de hibridación</td><td>Millipore</td><td>S4040</td><td></td></tr><tr><td>Kodak Película de rayos X</td><td>Z& Z Médico</td><td>844 5702</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante southern blot y reacción en cadena de polimerasa

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Relativo a las cuestiones de efectos off-target y la dificultad de insertar un largo fragmento de ADN en la aplicación de diseño nucleasas para edición tallo genoma embrionario (ES) de la célula gene targeting tecnología no tiene estas deficiencias y es ampliamente utilizado para modificar el genoma del animal y el ratón que van desde grandes deleciones/inserciones a sustituciones de un solo nucleótido. En particular, identificando los relativamente pocos eventos de recombinación homóloga (HR) necesarios para obtener el deseado ES clones es un paso fundamental, que exige métodos precisos y fiables. Southern blot y/o PCR convencional se utiliza a menudo para este propósito. Aquí, describimos los procedimientos detallados de la utilización de estos dos métodos para identificar eventos de recursos humanos que ocurrieron en células ES de ratón que el gen Myh9 endógeno pretende ser interrumpida y reemplazada por cDNAs codifican otros cadena pesada del myosin UROLOGICAL IIs (IIs de NMHC). Todo el procedimiento de borrar meridional incluye la construcción de objetivos vector(s), electroporación, selección de drogas, la expansión y el almacenamiento de las células ES/clones, preparación, digestión y blot de DNA genómico (gDNA), la hibridación y lavado de sonda y un paso final de la autorradiografía en las películas de rayos x. PCR se puede realizar directamente con gDNA preparada y diluida. Para obtener resultados ideales, las sondas y la enzima de la restricción (RE) sitios de corte para borrar meridional y los cebadores para PCR deben ser cuidadosamente planificadas. Si la ejecución de borrar meridional es desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva y PCR resultados falsos positivos, la correcta identificación por borrar meridional y el cribado rápido por PCR permite la aplicación única o en combinación de estos métodos descritos en este documento para ser ampliamente utilizado y consultado por los laboratorios más en la identificación de genotipos de células madre embrionarias y genéticamente modificados animales.

En este trabajo se describe un protocolo detallado de Southern blot y de PCR, que se utiliza para identificar eventos de HR que se produjeron en las células ES de ratón para la generación de modelos de ratón de recambio genético NM II, tecnología ES basada en células mediada por recursos humanos dirigidos a. Aunque borrar meridional y PCR, así como técnica de gene targeting tradicional, ha sido ampliamente utilizado desde hace varias décadas, la aplicación exitosa de ellos debe ser planea...

Aquí, presentamos un protocolo detallado para la identificación de eventos de recombinación homóloga que se produjeron en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot o PCR. Este método es ejemplificado por la generación de modelos UROLOGICAL miosina II reemplazo genético ratón tecnología tradicional embrionario basada en células madre homólogo mediada por la recombinación dirigida a.

Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular y celular, como la identificación de eventos de recombinación homóloba en células madre embrionarias de ratón. La principal ventaja de esta técnica es que es precisa, fiable y ampliamente utilizada. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la identificación de eventos de recombinación homóloba en células madre embrionarias de ratón.También se puede aplicar a otros sistemas, como células modificadas genéticamente o animales. Generalmente, lo nuevo individual en este método tendrá problemas porque toma mucho tiempo e implica varios pasos. Para cada gDNA, mezcle 30 microlitros de 10 x tampón para DRA uno, tres microlitros de DRA uno y 10 microgramos de gDNAs por muestra.Agregue agua hasta que el volumen final sea de 30 microlitros, e incubar a 37 grados centígrados durante la noche para digerir los gDNAs. Preparar un gel de electroforesis de 1% de agarosa con bromuro de etidio. Cargue las muestras adquiridas previamente junto con una escalera de un KB en el gel y ejecútela a 30 a 40 voltios durante la noche.Al día siguiente, remoje el gel en una bandeja que contenga una solución de ácido clorhídrico de 0,2 newton. Use una coctelera para agitar suavemente la bandeja durante 20 minutos a temperatura ambiente. Transfiera el gel a una bandeja que contenga una solución de desnaturalamiento del ADN.Agitar suavemente durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera el gel a una bandeja que contenga una solución neutralizante del ADN. Y agítalo suavemente durante 20 minutos a temperatura ambiente.Usando un sistema de transferencia rápida hacia abajo, transfiera los DNAs del gel a la membrana. A continuación, montar la hinchazón y la pila de hinchazón como se describe en las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Después de esto, sacar la membrana y lavarla con dos citrato de sodio salino X durante un minuto.Absorber el líquido con tejidos, y luego utilizar un reticulante UV para cruzar vincular el ADN con la membrana. Para comenzar a etiquetar las sondas de ADN con radiactividad, agregue la sonda desnaturalada por calor DNA al tubo que contiene las perlas de etiquetado de ADN listas para ir. Pipetear arriba y abajo para mezclar.Y añadir cinco microlitros de trifosfato de desoxitodina radioactivamente etiquetado. Incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Purifique las sondas etiquetadas utilizando micro columnas G 50 de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.Utilice un contador de centelleo para medir la radiactividad. Para comenzar a hibridar las membranas con las sondas etiquetadas, coloque la membrana en el tubo de hibridación. Agregue la solución de pre hibridación mixta.Coloque el tubo en el horno de hibridación y deje que la pre hibridación proceda a 42 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, retire el tubo del horno y vierta la solución de pre hibridación en un tubo de 50 mililitros. Agregue la sonda desnaturalizado y mezcle suavemente.Para extraer las sondas no hibridas, coloque la membrana en una bandeja que contenga un citrato de sodio salino X con 0,1%SDS y agite suavemente a 55 a 60 grados centígrados durante 10 minutos. Después de esto, envuelva la membrana con una envoltura de plástico y fíjela en el cassette de exposición. En una habitación oscura, exponga la membrana a dos hojas de película de rayos X.Desarrollar la película para visualizar los resultados. Determinar si un clon ES correspondiente es el deseado con el objetivo de recombinación o no, de acuerdo con los tamaños de las bandas de ADN detectadas por las sondas. En este estudio, la hinchazón del sur y la PCR se utilizan para identificar los eventos de RRHH que se producen en las células ES del ratón para la generación de dos modelos de ratón de reemplazo genético DE NM utilizando la tecnología de focalización mediada por HR basada en células ES.Debido a que los ADN genómicos se cortan en muchos fragmentos con diferentes longitudes, muestran un frotis como el estado en el gel de ADN. Esto sugiere una digestión completa de los ADN genómicos. Como último paso de la hinchazón del sur, las señales de una sonda etiquetada por radiactividad hibridando con un fragmento de ADN objetivo se muestran en la película.La aparición de bandas esperadas refleja la ocurrencia de eventos de RRHH en los clones DE. Según el prediseño en el estudio, los clones ES con alelo mutado tienen dos bandas de tamaño distinto. Mientras que los clones ES de tipo salvaje sólo tienen una banda, lo que sugiere que los clones ES deseados son heterocigotos.Después de la reacción pcR, los productos PCR se pueden analizar en el gel de ADN. Si se observa una banda NPCR específica del tamaño correcto, esto sugiere la ocurrencia de eventos de RRHH que pueden ser confirmados aún más por la secuenciación de esa banda PCR. La implicación de esta técnica se extendió a la terapia de identificación de la mutación puntual porque la base es idéntica.Al intentar este procedimiento es importante recordar ser paciente y cuidadoso. Después de este procedimiento, se puede realizar otro método como la microinyección de la célula ES en blastocistos con el fin de responder a preguntas adicionales como la formación de animales quiméricos. Aft su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que el investigador en su campo de la biología molecular y celular explorara la función de un gen específico o la consecuencia de un gen mutado en ratones o más allá.No olvide que trabajar con el etiquetador de radiactividad P32 DCTB puede ser extremadamente peligroso y las precauciones como el blindaje con la placa de protección siempre deben estar tomando mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

En este video, describimos la técnica de Southern blot para identificar eventos de recombinación homólogos en el genoma de células madre embrionarias de ratón utilizando sondas radiomarcadas. Las regiones de ADN que contienen eventos de recombinación homólogos aparecen como bandas distintas cuando la membrana que contiene el ADN unido a la sonda se expone a los rayos X.

Southern Blotting para detectar recombinaciones homólogas en el genoma de células madre embrionarias de ratón

El fibroblasto embrionario de ratón puede ser reprogramado en células madre pluripotentes inducidas con baja eficiencia mediante la expresión forzada de los factores de transcripción Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Los raros intermediarios de la reacción de reprogramación son los FACS aislados mediante marcaje con anticuerpos contra los fabricantes de superficie celular Thy-1.2, Ssea-1 y Epcam.

Marcador de superficie celular mediada Purificación de iPS intermedios célula de un modelo reprogramable Ratón

Las proteínas a menudo contienen varios dominios que pueden ejercer diferentes funciones celulares. Genes knock-out (KO) no tienen en cuenta esta diversidad funcional. Aquí, se presenta un enfoque basado en la estructura-función de intercambio de casete de recombinación mediada (RMCE) en células madre embrionarias de KO que permite la disección molecular de varios dominios funcionales o variantes de una proteína.

Los estudios de estructura-función en las células madre embrionarias de ratón Usando mediada por recombinasa Cambio de Cassette

Aquí, describimos los métodos para realizar ChIP-Seq y mapas de CARIP-Seq, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación, generar global epigenómica y RNA asociada a la cromatina en células madre embrionarias.

CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias

Informamos de la aplicación de la captura cuantitativa de conformación cromosómica seguida de la secuenciación de alto rendimiento en cuerpos embrionarios generados a partir de células madre embrionarias. Esta técnica permite identificar y cuantificar los contactos entre potenciadores putativos y regiones promotoras de un gen dado durante la diferenciación de células madre embrionarias.

Identificación de contactos potenciadores-promotores en cuerpos embrionarios por captura cuantitativa de conformación cromosómica (4C)

Este artículo tiene como objetivo demostrar el uso de células madre embrionarias heploideas partefenogenéticas como sustituto de los espermatozoides para la construcción de embriones semi-clonados.

Aplicación de células madre embrionarias haploides partegenéticas del ratón como sustituto de los espermatozoides

Los ensayos de captura de bucle D (DLC) y extensión de bucle D (DLE) utilizan el principio de ligadura de proximidad junto con PCR cuantitativa para cuantificar la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos en el sitio de una ruptura ducible de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae.

Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

Mantener la integridad del genoma del ovocito es necesario para asegurar la fidelidad genética en el embrión resultante. Aquí, presentamos un protocolo preciso para detectar roturas de doble cadena de ADN en células germinales femeninas de mamíferos.

Detección de roturas de ADN bicatenario en ovocitos de ratón

El presente protocolo describe un método para la poli-transfección inversa de células madre embrionarias de ratón durante el cultivo con medios 2i y LIF. Este método produce una mayor viabilidad y eficiencia que los protocolos tradicionales de transfección directa, al tiempo que permite la optimización de las proporciones de plásmidos en un solo recipiente.

Una técnica optimizada de politransfección inversa basada en células madre embrionarias de ratón para la exploración rápida de las proporciones de ácidos nucleicos

Este artículo establece una línea para suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad de embriones de ratón gastrulados para la secuenciación de células individuales y núcleos.

Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

Los errores meióticos en las sinapsis y la recombinación son comunes en los ovocitos de mamíferos. El análisis riguroso de las proteínas involucradas en estos procesos es esencial para comprender cómo y por qué la ovogénesis a menudo sale mal. Las técnicas aquí presentadas permiten un seguimiento exhaustivo de la recombinación y las sinapsis para evaluar la calidad de los ovocitos en ratones.

Preparación de distribuciones de cromosomas meióticos de ovocitos de ratón para la evaluación de la sinapsis y la recombinación

Aprende a identificar eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón mediante Southern blot y PCR. Este protocolo preciso permite generar modelos genéticos como el reemplazo de miosina II no muscular.

Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa (Video) | JoVE Journal

Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa

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