Name: Separación de espinacas tilacoides complejos de proteínas por electroforesis en Gel verde nativo y caracterización de banda utilizando conteo de fotones solo Time-Correlated (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende a separar complejos de tilacoides de espinacas mediante electroforesis en gel verde nativo y caracterizarlos con TCSPC. Este protocolo rápido permite analizar conexiones energéticas en un solo día.

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Financiación y apoyo fueron proporcionados por el Departamento de química de la Universidad Estatal de Michigan.

1. soluciones preparación para verter el gel verde nativo
<ol><li>Preparar 4 x solución amortiguadora concentrada para resolver geles consisten en glicerol al 40%, glicina de 200 mM y 100 mM Tris amortiguada a pH 8.3.</li>
	<li>Preparar 4 x solución amortiguadora concentrada para apilar los geles consisten en glicerol al 40%, glicina de 200 mM y 100 mM Tris amortiguada a pH 6,3.</li>
	<li>Almacenar estos búferes a 4 ° C para evitar el crecimiento de moho. Nota: Los topes son estables durante meses a 4 ° C, por lo que se recomienda la preparación de 100-200 mL de cada amortiguador para uso continuado.</li>
	<li>Preparar 1 L de 10 x funcionamiento tampón que contiene 250 mM Tris HCl, pH 8.3, 1,92 M de glicina y 1% SDS. Tienda el 10 x corriente buffer en el Banco.</li>
</ol>2. solución preparación para aislamiento y solubilización de tilacoides
<ol><li>Preparar 100 mL de buffer de homogenización de TMK que contiene 50 mM de tampón Tris (pH 7), 10 mM de MgCl2y 10 mM de KCl y almacenar a 4 ° C. Nota: Este es el principal buffer de homogeneización y la manipulación de las muestras de tilacoides. Alternativamente, soluciones madre concentradas pueden preparadas y diluidas según sea necesario (tampón Tris, MgCl2y KCl pueden todos ser fácilmente almacenada en el Banco 1 M se concentra).</li>
	<li>Preparar las soluciones madre de los tilacoides detergentes solubilización, maltoside B-decyl (DM) y n-octilo B-d-glucósido (OG), mediante la disolución de cada detergente en buffer TMK 20% w / v. congelación a-20 ° C en alícuotas de 1 mL.</li>
	<li>Preparar el tampón de solubilización de tilacoides (SB), que también es el tampón de carga de la muestra.<ol>
<li>En primer lugar, hacer TMK-glicerol búfer mediante la combinación de 7 ml de tampón TMK y 3 ml de glicerol.</li>
		<li>A 800 μL de tampón de TMK-glicerol, añadir 100 μL de solución stock de DM y 100 μL de la solución madre de OG. Almacenar esta solución de trabajo de SB, que contiene 2% DM y 2% OG, congelado a-20 ° C en alícuotas de 1 mL. Nota: Cada alícuota puede ser descongelado y a congelar como sea necesario.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. verter verdes Mini geles para uso posterior
<ol><li>Preparar separado apilado y resolver soluciones de gel en tubos de ensayo desechables de 15 mL. Nota: Los volúmenes proporcionados son suficientes para un solo gel mini usando a separadores de placa de 1,5 mm.<ol>
<li>Para hacer la solución gel de apilamiento, combinan 1,25 mL de 4 x buffer gel de apilamiento, 0,5 mL de solución stock acrilamida al 40% (39:1 C) y 3,25 mL de agua para darle 5 mL de acrilamida de 4% en el 1 x de tampón de apilamiento. Para hacer el gel de resolución solución combinan 1,875 mL de 4 x resolución de 4,7 mL de agua a 7,5 mL de acrilamida 5% 1 x solución de tampón, buffer y 0,94 mL de solución stock acrilamida al 40% (39:1 C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verter el gel de resolución.<ol>
<li>Añadir 50 μL de persulfato de amonio 10% (APS) a la solución de gel de resolución, luego añada 10 μL de TEMED, cerrar el tubo e invertir suavemente varias veces para mezclar. Inmediatamente verter la solución de gel entre las placas de gel, dejando aproximadamente 1 cm entre la parte superior del gel de resolución y parte inferior de los dientes de peine para el gel de apilamiento.</li>
		<li>Pipetee suavemente 100% de etanol en la parte superior del gel de resolución a nivel del gel. Nota: Si el gel no establece dentro de 15 min, solución fresca de APS debe hacerse o TEMED nuevo debe utilizarse.</li>
		<li>Después de que el gel ha polimerizado (la interfaz entre el gel y el etanol será fácilmente visible y no se mueve cuando se inclina el gel), vierte el etanol y la mancha con un papel absorbente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verter el gel de apilamiento.<ol>
<li>Añadir 25 μL de 10% APS a la solución de gel de apilamiento, añadir 5 μL de TEMED, luego tapa e invertir para mezclar en la misma forma que el gel de resolución. Vierta la solución en gel en la parte superior del gel de resolución hasta llenar completamente el espacio entre las placas y colocar un peine de 10 pozos. Nota: Cuando esté listo para ser usado, retire el peine del gel y enjuague los pozos con agua, asegurándose de que los pozos estén rectas y sin obstáculos por el gel. El gel puede guardarse con el peine en su lugar a 4 ° C durante al menos varios días.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. aislamiento de tilacoides crudo de espinaca hojas
Nota: Todos los pasos deben llevarse a cabo sobre el hielo usando tampones y equipo previamente enfriada. También se recomienda la iluminación tenue. Dependiendo del criterio del experimentador y los procesos biológicos en estudio, los inhibidores de la proteasa y fosfatasa deben añadirse fresco a búferes TMK antes de homogeneización.
<ol><li>Homogeneizar completamente hojas de espinaca en tampón de TMK con un homogeneizador de vidrio Dounce. Nota: Aproximadamente 1 a 2 mL de tampón es normalmente suficiente para una hoja de espinaca bebé pequeño. Una hoja de espinaca bebé único general puede proporcionar suficiente material para cargar varios pozos en gel mini de 1,5 mm.</li>
	<li>Filtrar el homogeneizado crudo de la hoja para eliminar la suciedad insoluble.<ol>
<li>Para hacer un simple dispositivo de filtrado, corte una tarea delicada limpie en mitad y doblar en cuartos. Pack el paño tarea delicada en la parte inferior de una jeringa desechable de 5 mL y pre-moje el paño con tampón de TMK.</li>
		<li>Utilice el émbolo de la jeringa para Pulsa el exceso de tampón de la limpieza de la delicada tarea y asegúrese de que el filtro Limpie se presiona firmemente a la parte inferior de la jeringa después de retira el émbolo.</li>
		<li>Pipeta el homogeneizado de la hoja en el centro del paño filtro y utilizar el émbolo para pasar el homogeneizado a través del filtro. Recoger el filtrado homogeneizado en un tubo de centrífuga de 1.5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar el homogeneizado a 5.000 x g durante 10 min a 4° C para que sedimenten los materiales insolubles, incluyendo membranas tilacoides. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de tampón TMK.</li>
	<li>Normalizar la cantidad de clorofila en cada muestra ajustando el volumen de cada muestra de tilacoides resuspendido para que cada muestra contiene la misma cantidad total de clorofila, como se describe a continuación. Nota: Esto permitirá que cada muestra a ser solubilizado en el mismo volumen de detergente y reduce al mínimo la variabilidad en la solubilización debido a diferencias en el volumen de pellets.<ol>
<li>Para extraer la clorofila de cada muestra de tilacoides resuspendidos, tomar 50 μL alícuota en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y añadirle 950 μL de metanol. Tapa el tubo y mezclar invirtiéndolo varias veces.</li>
		<li>Centrifugue el extracto de metanol/clorofila a 10.000 x g durante 10 minutos para que sedimenten los precipitados proteínas.</li>
		<li>Determinar la concentración de clorofila, el pigmento que contienen sobrenadante según Porra et al. 23. tomar lecturas de absorbancia a 652 y 665 nm usando un espectrofotómetro y una cubeta de 1 cm. Determinar la concentración de clorofila total usando la siguiente ecuación: Chls un + b (μg/mL) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2,71 (Abs 665 nm)</li>
		<li>Utilizando las mediciones de concentración de clorofila como guía, retire y deseche algo de volumen de cada muestra, si es necesario, para que cada tubo contiene la misma cantidad total de clorofila.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Volver a pellets tilacoides por centrifugación a 5.000 x g durante 10 minutos, retire y descarte el sobrenadante. Tenga cuidado de eliminar sobrenadante todos sin aspiración alguna de la pelotilla.</li>
</ol>5. solubilización de las membranas de los tilacoides para carga en geles nativos
<ol><li>Descongelar una alícuota de la solución de detergente glicerina (SB) de TMK 30% e invertir varias veces para mezclar. Mantener en hielo.</li>
	<li>Disolver el precipitado de tilacoides añadiendo el volumen adecuado de SB para dar una concentración de 1 mg/mL de clorofila. Nota: Esta concentración es un punto de partida para encontrar las condiciones óptimas de solubilización, que deben determinarse empíricamente. La concentración de clorofila debe mantenerse iguales entre muestras para permitir comparaciones válidas para hacerse.</li>
	<li>Pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces teniendo cuidado de no espumar de la muestra. Mantenga en hielo para permitir que las muestras de los tilacoides solubilizar. Nota: Solubilizar por al menos 10 minutos. Tiempo de solubilización debe ser lo suficientemente largos que se minimiza la diferencia en tiempo de solubilización entre muestras. Ejemplo: Si se requiere 3 minutos para solubilizar todas las muestras, luego aproximadamente 30 minutos deben de solubilización.</li>
	<li>De centrífuga tilacoides solubilizado a 10.000 x g a 4 ° C para pellets de material insoluble. Nota: Solubilizado tilacoides muestras son estables en el hielo durante horas, pero a-70 ° C se debe guardar, como ciclos de congelación y descongelación pueden resultar en una pérdida de megacomplex bandas.</li>
</ol>6. separación de proteínas solubilizadas tilacoides por electroforesis nativa
<ol><li>El sobrenadante de tilacoides solubilizado preparado en el paso 5.4 directamente sobre el gel nativo preparado antes de la carga. Para un gel de 1,5 mm, carga 15 μL de tilacoides solubilizado por pozo.</li>
	<li>Correr el gel verde nativo en esencialmente la misma manera que los geles de SDS-PAGE con 1 x buffer de corriente. Correr el gel a 100 V y colocar el tanque del gel todo en hielo húmedo para la duración de la carrera para mitigar resistente calefacción del gel. Nota: El gel debe requerir aproximadamente 2 horas para el pigmento libre en el frente de migración para llegar a la parte inferior del gel (figura 1).</li>
</ol>7. supresión de tilacoides complejo bandas de geles verdes nativos
Nota: Suprimir la banda específica de interés del gel es necesario para permitir que la banda para colocarse en la trayectoria de la viga y para impedir que se recogen callejero fluorescencia de complejos cercanos.
<ol><li>Retirar el gel de la célula de electroforesis y enjuague corriente buffer de las placas de gel con agua destilada. Retire la placa superior del gel y el gel con agua destilada de enjuague.</li>
	<li>Mantener el gel en la placa inferior de vidrio y coloque el gel y la placa de hielo. Cuando no esté en uso, mantenga el gel en la oscuridad y cubierta con una envoltura de plástico para evitar que se resequen.</li>
	<li>Con el gel queda en la placa de vidrio, suprimir cada grupo de interés cuando esté listo para el análisis TCSPC. Impuestos especiales bandas limpiamente con un bisturí afilado o una cuchilla de afeitar y cuidar que la banda suprimida no contiene ningún material contaminante de la banda.</li>
</ol>8. colección de espectros de fluorescencia de estado estacionario de temperatura
<ol><li>Para cada complejo que será analizada por TCSPC, se toma un espectro de fluorescencia de la temperatura entre 600 y 800 nm, utilizando un espectrómetro de fluorescencia. Nota: La longitud de onda de excitación utilizada para recoger este espectro debe coincidir con la longitud de onda utilizada para TCSPC.</li>
</ol>9. TCSPC de bandas de Gel verde
Nota: Refiérase a la figura 2 para una descripción de la configuración TCSPC.
<ol><li>Emparedado de la rebanada de gel entre dos portaobjetos de microscopía. Utilice cinta de enmascarar, coloca en cada extremo de uno de los portaobjetos de microscopía y doblada varias veces, para crear a separadores para que las diapositivas pueden llevar a cabo juntos firmemente sin comprimir el trozo de gel. Nota: Esto crea un camino para que el láser pase entre el microscopio y a través de la rebanada de gel.</li>
	<li>Añadir una pequeña cantidad de agua a la rebanada de gel en el borde de las diapositivas de cristal para crear una interfaz suave que reduzca la dispersión de la señal.</li>
	<li>Abrazadera de gel o diapositiva de emparedado en la trayectoria de la viga para que el rayo golpea el trozo de gel a través del borde libre de las placas, lo que permite la emisión de fluorescencia que a través del lado de los portaobjetos de vidrio en la que se encuentra el gel, perpendicular a la trayectoria de viga. Nota: Dependerá de la longitud de onda de excitación utilizado en el experimento. Longitud de onda de 435 nm excitará clorofila a y clorofila b, y 465 nm preferencial excitará clorofila b. En este caso, 435 nm fue utilizada como la longitud de onda de excitación.</li>
	<li>Recoge 10.000 puntos del total de datos a intervalos regulares en todo el espectro de emisión de fluorescencia de cada complejo. Por ejemplo, recoger datos cada 10 nm, a partir de 680 nm y terminando en 750 nm. Nota: Preparar múltiples bandas de gel para cada complejo a estudiar así muestra fresca está disponible en caso de que el fotoblanqueo previene la colección de señal adecuada.</li>
</ol>10. TCSPC (análisis de datos)
<ol><li>Para un determinado complejo, primero normalizar la altura máxima de cada curva de decaimiento para longitudes de onda todos recogidos. Nota: Este paso no es necesario para la construcción del DAS pero permite curvas de decaimiento se sobrepuso y comparar visualmente como una primera inspección de los datos.</li>
	<li>Partido de cola cada curva de decaimiento para el espectro de fluorescencia de estado estacionario del complejo como se describe a continuación.<ol>
<li>Elija un punto después de que la señal de decaimiento ha aplanado hacia fuera, generalmente después de unos pocos nanosegundos.</li>
		<li>Para cada longitud de onda, normalizar la curva de decaimiento por lo que la intensidad de señal en el punto seleccionado es igual al valor del espectro de fluorescencia de estado estacionario en esa longitud de onda (es decir, los valores de todas las longitudes de onda en el punto seleccionado volverá a crear el espectro de fluorescencia de estado estacionario).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construir espectros de caries asociado (DAS) de las curvas de decaimiento comparable de cola, como se describe a continuación.<ol>
<li>Utilizando datos de puntos de las curvas de decaimiento comparable cola construcción una serie de diagramas gráficos de intensidad de fluorescencia frente a longitud de onda en intervalos regulares de tiempo (por ejemplo, cada 10 ps). Por ejemplo, el DAS al 50 ps se construye trazando el valor de cada curva de decaimiento en 50 ps vs longitud de onda.</li>
		<li>Superposición de los espectros de caries asociado para crear una trama de estilo de cascada que muestra la decadencia del espectro de fluorescencia con el tiempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

Un éxito tilacoides solubilización y gel nativo ejecutar resultará en la resolución de múltiples bandas verdes visibles distintas sobre el gel sin la distorsión significativa o mancharse de las bandas. Sobrecargar el gel, una alta concentración de detergente, un pH de muestra incorrecta, disuelta material, correr el gel a temperatura demasiado elevada o demasiado rápidamente y un gel incorrectamente vertido son factores que pueden contribuir a complejos de tilacoides mal resuelto. Y optimizar las condiciones del gel sí m...

Organismos fotosintéticos constantemente deben ajustar su fisiología a las cambiantes condiciones ambientales para maximizar su productividad y competir con éxito con vecinos1. Esto es especialmente cierto de la maquinaria responsable de las reacciones de luz de la fotosíntesis, como luz ambiental condiciones pueden fluctuar por tres órdenes de magnitud entre las sombras y a plena luz del sol. Además, factores ambientales tales como sequía, frío o estrés por calor pueden reducir la disponibilidad de dióxido de carbono para la fijación de carbono, que es el fregadero del electrón natural para los productos de las reacciones de luz. Plantas deben, por lo tanto, cosechar y utilizar radiación solar tan eficientemente como sea posible sin perder la capacidad de disipar el exceso de energía luz según sea necesario. Mientras que photooxidative daño todavía ocurre rutinariamente bajo todas las condiciones de luz2,3, falta lograr excitación absorbe energía con éxito puede conducir al daño catastrófico celular y muerte. Varios mecanismos adaptativos existen que permiten que el aparato fotosintético a ajustarse a los cambios en las condiciones ambientales prevalecientes y a las fluctuaciones transitorias (es decir, en plazos cortos y largos)4. Estos incluyen la respuesta a largo plazo (LTR) y Temple no fotoquímica (NPQ). NPQ es en sí mismo considerado para abarcar por lo menos tres otros fenómenos de componente, incluyendo las transiciones de estado (qT), amortiguamiento de energía rápidamente inducible (qE) y fotoinhibición (qI)5.
Estos procesos fueron originalmente observados y define en gran medida en términos de fenómenos espectroscópicos [e.g., NPQ se refiere a una gota en observada fluorescencia (quenching de fluorescencia de la clorofila) que no es debido a un aumento en la tasa de fotoquímica]6. El término "las transiciones de estado" se refiere igualmente al cambio observado en la cantidad relativa de la fluorescencia de PSI y PSII7. Mientras que las técnicas espectroscópicas que han posibilitado la enumeración de estos fenómenos [en particular, la amplitud de pulso modulada de espectroscopia de fluorescencia (PAM)] y siguen siendo un medio vital para observar y diseccionar los procesos fotosintéticos en vivo, mucho de la bioquímica es necesaria para aclarar los mecanismos subyacentes a estas observaciones espectroscópicas. Transiciones de estado, por ejemplo, implica un ciclo de la fosforilación/desfosforilación de las proteínas LHCII por la STN7 cinasa y la fosfatasa TAP38/PPH1, respectivamente8,9,10. Este ciclo ajusta la distribución física de la antena LHCII entre los dos fotosistemas moviendo una porción de trimers LHCII de PSII a PSI, cambiando así la absorción de la sección transversal de los fotosistemas11,12. El componente FC de NPQ rápidamente convierte la energía de exceso de excitación en calor a través de las acciones del ciclo de epoxidación/de-epoxidación de violaxantina/zeaxantina y la proteína de subsidiarios. El papel exacto de subsidiarios en este proceso es aún no comprendido del todo13. El componente de qI de NPQ, fotoinhibición, generalmente se atribuye al daño a la proteína D1 del PSII. Restauración de competencia fotosintética total requiere un proceso de reparación elaborados para solucionar dañado PSII photocenters. El ciclo de reparación PSII implica la migración de complejos PSII de la pilas granal, desmantelamiento de los complejos, recambio de proteínas dañadas de la D1, rearmado de los complejos PSII y el movimiento de complejos PSII en el granal pilas14. La naturaleza exacta de la fotoinhibición y PSII fotodaño sigue siendo objeto de intenso escrutinio15.
La dificultad en el estudio de fenómenos como el estado de las transiciones o reparación PSII surge en parte del hecho de que hay no una forma simple de visualizar la mecánica de sistemas bioquímicos complejos. El enfoque clásico de la bioquímico para entender un proceso es primero separar sus componentes por lo que puede ser caracterizados en aislamiento. Electroforesis nativa surgieron de los esfuerzos exitosos en la década de 1980 para separar y caracterizar los complejos del fotosistema de los tilacoides con más métodos de preparación (es decir, centrifugación de gradiente de sacarosa y cromatografía)16. Los sistemas detergentes para solubilizar suavemente los conjuntos nativos de las membranas tilacoides pronto fueron adaptados a los métodos de separación electroforética, en particular por Allen y Staehelin17 y y Peter y Thornber18, dando lugar a electroforesis en gel verde nativo. Mientras que representan sólo uno de una variedad de técnicas en el arsenal experimental, página nativa tiene un número de características atractivas que han hecho un método ampliamente empleado en la investigación de la fotosíntesis. Página nativa es relativamente rápida y sencilla, requiriendo equipo poco especializado, ofreciendo al mismo tiempo la separación de alta resolución de un gran número de complejos de tilacoides. Esto hace que página nativa una herramienta conveniente para estudiar la dinámica de los tilacoides y, cuando se combina con la página estándar de la segunda dimensión, así como una variedad de sistemas de tampón y detergente, un versátil sistema para la búsqueda y caracterización de nuevos complejos de tilacoides.
Dicho esto, los geles verdes nativos han tenido una reputación de ser una técnica poco fiable, especialmente en manos inexpertas, ya que es fácil producir resultados pobres consisten en geles borrosos, graso con pocas bandas. Este problema fue solucionado, en parte, con la introducción del azul natural página19. El uso de tinte coommassie en el sistema BN hace separación de las proteínas más robusto. Por lo tanto, BN-página suele ser una técnica más fiable y más fácil para un novato relativa configurar y puede proporcionar separaciones de alta resolución de los complejos de tilacoides. Por estas razones, BN-PAGE se ha convertido en el método de elección para la mayoría de los trabajos de este campo. BN-PAGE es generalmente más lento correr de electroforesis en gel verde, su principal inconveniente es que la coloración de tinte de coommassie interfiere con la identificación de bandas débiles que contiene clorofila, además de hacer aguas abajo espectroscópicas Caracterización problemática.
La información bioquímica proporcionada por geles nativos y 2D SDS-PAGE puede fortalecerse enormemente cuando se combina con los datos de técnicas espectroscópicas. Independientemente del sistema empleado, un problema central con el uso de geles nativos para identificar complejos es que la identificación siempre puede ser impugnada (es decir, las proteínas se encuentran en una banda podría siempre representan complejos comigrating o componentes, sino de un solo complejo fisiológico auténtico). Caracterización espectroscópica proporciona información biofísica sobre los pigmentos en las bandas de gel verde y puede utilizarse para determinar qué tipo de complejos son capaces de contener. Fluorescencia de la clorofila es especialmente útil en este sentido debido a la a menudo dramáticamente diversos espectros y cursos de la vida de la fluorescencia que son característicos de complejos pigmento fotosintéticos diferentes proteínas. Mientras que los espectros de fluorescencia de estado estacionario simple 77K históricamente han sido útiles para confirmar las identidades de los complejos de gel nativo, moderno tiempo-correlacionada fotón contando (TCSPC) puede proporcionar mucha más información. TCSPC permite no sólo la caracterización de los complejos basados en cursos de la vida de la fluorescencia, pero también hace posible la descripción detallada de la transferencia de energía entre componentes espectrales dentro de un complejo. Este tipo de caracterización se está convirtiendo en cada vez más necesaria como el uso de varias extensiones de sistemas de gel nativo y se descubren nuevos supuestos complejos, permitiendo la identificación de complejos de la proteína para ser mejor autenticados y proporcionar nuevos información biofísica sobre el funcionamiento de estos complejos.
En este trabajo ofrecemos un método que permite a los que tienen poca o ninguna experiencia con electroforesis nativa para lograr alta calidad de resolución de los complejos de tilacoides nativo con el fin de investigar los mecanismos de las reacciones de luz de fotosíntesis. Esta técnica básica entonces se puede aumentar a criterio del experimentador para mejorar resultados o ampliar la aplicabilidad a otras especies. Luego Describimos el proceso para sujetar vendas de gel verde nativo TCSPC, así como algunos pasos para el análisis básico y presentación de los datos proporcionados por la técnica. El acoplamiento de electroforesis nativa con análisis TCSPC amplía la utilidad de estos sistemas de gel proporciona autenticación y caracterización biofísica de complejos de proteína dentro de las bandas. El sistema de gel verde descrito aquí se basa en que desarrollado por Allen y Staehelin17 con algunas modificaciones y es el mismo que el utilizado en Schwarz et al. 20. este sistema es uno de los muchos pero tiene características específicas que son útiles para esta metodología. Es lo suficientemente rápida para que aislamiento de tilacoides, electroforesis y análisis TCSPC conveniente se pueden realizar en un día, evitando posibles problemas de almacenamiento de la muestra y degradación. También encontramos que este método es robusto en las manos de usuarios inexpertos, sin dejar de ofrecer resultados que van de bueno a superior, dependiendo del grado de optimización.
Es importante tener en cuenta que los complejos visualizados en un gel nativo en el detergente y el buffer sistemas utilizados, así como sobre la biología del organismo bajo investigación. Diferentes sistemas de tampón y detergente preferentemente separan diferentes tipos de complejos, y un organismo fotosintético determinado tendrá diferentes complejos de otros organismos, no todos los cuales estarán presentes en cualquier circunstancia dada. El sistema descrito aquí es particularmente adecuado para el estudio de megacomplexes PSI, como se describe en Schwarz et al. 20, pero cae en el extremo más desestabilizador del espectro para quienes estudian megacomplexes PSII. Para un estudio exhaustivo de los diversos sistemas de tampón y detergente usados en electroforesis nativa de tilacoides proteínas, se recomienda revisar Järvi et al. 21 y Rantala et al. 22.

<table><tbody><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>#648310</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Decyl Maltoside</td><td>Sigma</td><td>D7658</td><td>n-decyl beta d maltopyranoside, no dodecyl maltósido o alfa decil maltósido</td></tr><tr><td>Octyl Glucoside</td><td>Sigma</td><td>O8001</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamida</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>37.5/1 C Solución al 40%</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr></tbody></table>

separación de espinacas tilacoides complejos de proteínas por electroforesis en gel verde nativo y caracterización de banda utilizando conteo de fotones solo time-correlated

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

Las reacciones de luz de la fotosíntesis se llevan a cabo por una serie de complejos de proteína pigmentada en las membranas tilacoides. La estequiometría y la organización de estos complejos es altamente dinámica en el largo y corto plazos debido a los procesos que se adaptan la fotosíntesis a las cambiantes condiciones ambientales (es decir, el amortiguamiento no fotoquímica, las transiciones de estado y la respuesta a largo plazo). Históricamente, estos procesos se han descrito espectroscópico en términos de cambios en la fluorescencia de la clorofila y espectroscopia sigue siendo un método esencial para el monitoreo de parámetros de fotosíntesis. Hay un número limitado de formas en que se puede visualizar la compleja dinámica de la proteína subyacente. Aquí describimos un método rápido y simple para la separación de alta resolución y visualización de complejos de tilacoides, electroforesis en gel verde nativo. Este método se combina con tiempo-correlacionada fotón contando para la caracterización detallada de las propiedades de fluorescencia de clorofila de bandas separadas en el gel verde.

Resultados representativos para la electroforesis del gel verde se presentan en la figura 1. Carril 1 proporciona un ejemplo de resultados ideales para electroforesis en gel verde de espinaca tilacoides, en el que un número máximo de bandas verdes claro, agudos es accesibles. Estos resultados son un tanto atípicos, en parte porque no todas las bandas en el carril 1 normalmente están presentes en una muestra determinada. Limpieza adicional de la muestra, en fo...

Aquí presentamos un protocolo para separar complejos de tilacoides solubilizado por electroforesis nativa en verde. Bandas de gel verde posteriormente se caracterizan por tiempo correlacionó solo fotón contando (TCSPC) y pasos básicos para el análisis de los datos se proporcionan.

Separación de espinacas tilacoides complejos de proteínas por electroforesis en Gel verde nativo y caracterización de banda utilizando conteo de fotones solo Time-Correlated

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Este método es útil para responder a ciertas preguntas clave en el campo de la investigación de fotosíntesis como son complejos tilakoid putativos fisiológicamente complejos reales con componentes energéticamente conectados? La principal ventaja del gel verde y el protocolo TCSPC descrito aquí es que es rápido y robusto. Las muestras se pueden procesar y analizar fácilmente en un solo día, lo que hace que los problemas de almacenamiento y estabilidad sean menos preocupantes.Aunque TCSPC puede proporcionar información sobre los sistemas fotosintéticos que hemos estudiado aquí, también se puede aplicar a otros sistemas que van desde productos químicos a través de productos físicos y biológicos, como estudios de movimiento molecular fluorescente en líquidos, células o motivos nuevos-estructurales como capas monomoleculares y líquidos iónicos. Para comenzar este procedimiento, prepare las soluciones de stock necesarias y mini geles verdes como se describe en el protocolo de texto. A continuación, obtenga un poco de hielo y atenúe las luces.Usando un homogeneizador Dounce de vidrio, homogeneizar completamente las hojas de espinaca en aproximadamente uno a dos mililitros de tampón TMK. Para crear un dispositivo de filtrado simple, corte una delicada limpieza de tareas por la mitad y dóblela en cuartos. Retire el émbolo de una jeringa y, a continuación, empaquete la toallita de tarea plegada en la parte inferior de la jeringa.Pipetear la hoja homogeneizar en el centro del filtro de limpieza de tareas, a continuación, utilice el émbolo para pasar el homogeneizar a través del filtro y recogerlo en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Centrifugar el homogeneización a 5.000 g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para peletizar el material insoluble, incluidas las membranas tilakoideas. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en un mililitro de tampón TMK.Para extraer la clorofila de cada muestra, tome una alícuota de 50 microlitros y transfiérala a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Añadir 950 microlitros de metanol, tapar el tubo, y mezclar invirándolo varias veces. Centrifugar a 10.000 g durante 10 minutos para peletizar las proteínas precipitadas.Utilizando las mediciones de concentración de clorofila como guía, retire y deseche un poco de volumen de cada muestra según sea necesario hasta que cada tubo contenga la misma cantidad total de clorofila. Centrifugar a 5.000 g durante 10 minutos para re-pellet las membranas tilakoide. Retire y deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de quitar todo el sobrenadante sin alterar el pellet.En primer lugar, descongelar una alícuota de solución de detergente TMK 30%glicerol. Invertir varias veces para mezclar y mantener la solución en hielo. Añadir un volumen adecuado de la solución detergente para disolver el pellet y dar lugar a una concentración final de clorofila de un miligramo por mililitro.Pipetear hacia arriba y hacia abajo repetidamente mientras tiene cuidado de evitar la espuma en la muestra. Luego, mantenga la muestra sobre hielo para permitir que las muestras de tilakoide se solubilien. Una vez completada la solubilización, centrifuga la muestra a 10.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos para peletizar el material insoluble, lo que resulta en un sobrenadante de color verde claro y oscuro.Después de esto, cargue 15 microlitros de sobrenadante de tilakoide solubilizado directamente en cada pozo de un gel nativo de 1,5 milímetros previamente preparado. Usando el búfer de funcionamiento 1X, comience a ejecutar el gel verde nativo a 100 voltios. Coloque todo el tanque de gel sobre hielo húmedo durante la carrera para mitigar el calentamiento resistivo.Cuando el gel haya terminado de funcionar, retírelo de la célula de electroforesis y enjuague el tampón de funcionamiento de las placas de gel con agua destilada. Retire la placa superior del gel y luego enjuague el gel con agua destilada. Coloque el gel, que todavía está en la placa de vidrio inferior, sobre hielo;cuando el gel no esté en uso, cúbralo con una envoltura de plástico y manténgalo en la oscuridad para evitar que se seque.A continuación, utilice un bisturí afilado o una cuchilla de afeitar para extirpar cada banda de interés cuando esté lista para continuar con el análisis de la TCSPC. Asegúrese de que la banda excómoda no contenga material de banda contaminante. Para cada complejo que se está analizando, utilice un espectrómetro fluorescente para crear un espectro fluorescente de temperatura ambiente entre 600 y 800 nanómetros.Coloque la cinta de enmascaramiento en cada extremo de las diapositivas y dóblela varias veces para crear espaciadores, lo que permitirá que las diapositivas se sostengan juntas firmemente sin comprimir el espacio entre, luego empareje la rebanada de gel entre dos diapositivas de microscopía de vidrio. Añade una pequeña cantidad de agua a la rebanada de gel en el borde de los portaobjetos de vidrio para crear una interfaz suave que reducirá la dispersión de la señal. A continuación, sujeta el sándwich de gel en la trayectoria de la viga para que la viga golpee la rebanada de gel a través del borde abierto de las placas.Para cada complejo, recopile 10.000 puntos de datos totales a intervalos regulares en todo el espectro de emisión de fluorescencia. Para analizar los datos de un complejo determinado, primero normalice la altura máxima de cada curva de decaimiento para todas las longitudes de onda recopiladas, luego la cola haga coincidir cada curva de decaimiento con el espectro de fluorescencia de estado estacionario del complejo como se describe en el protocolo de texto. Los resultados representativos de la electroforesis de gel verde proporcionan un ejemplo de un resultado ideal para el análisis de tilakoides de espinacas, donde una serie de bandas verdes claras y nítidas son visibles.Los carriles 2 y 3 presentan resultados más típicos del aislamiento simple de tilakoide y electroforesis en un gel de acrilamida 5% no gradiente. Los carriles 4, 5 y 6 proporcionan un ejemplo de malos resultados debido al aumento de los grados de bajo solubilización de la muestra de tilakoide, mientras que el carril 7 demuestra los resultados que se pueden lograr cuando se utilizan tilakoidos de Arabidopsis en lugar de espinacas. Una vez que las curvas de datos de los datos TCSPC se han establecido en el mismo registro de tiempo, se pueden normalizar a la misma altura máxima, lo que permite comparar las curvas como un primer análisis de los datos.Las curvas de decaimiento normalizadas por picos de diferentes complejos se pueden superponer entre sí en una longitud de onda determinada, lo que permite visualizar las diferencias de comportamiento entre los complejos. La cola que coincide con las curvas de descomposición permite la construcción de espectros asociados a la decadencia. Como se ve aquí, los espectros asociados a la descomposición para el LHCII son notables por la falta de características dinámicas y la forma del espectro de fluorescencia LHCII sigue siendo la misma que la señal decae con el tiempo.La descomposición del espectro de fluorescencia también se retrasa, requiriendo 100 picosegundos para alcanzar la fluorescencia máxima. Esto sugiere que la energía no se transfiere entre pigmentos energéticamente distintos dentro del complejo a medida que la fluorescencia se descompone. A continuación, se construyen los espectros asociados a la descomposición para el complejo Band 5.En comparación con el LHCII, la fluorescencia de la Banda 5 decae mucho más rápidamente, alcanzando la intensidad máxima en sólo 30 picosegundos y luego decayéndose a menos del 20% de la intensidad inicial después de 500 picosegundos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la interpretación de los datos de la TCSPC se basará en información bioquímica adicional que identifique los componentes de los complejos en estudio, por ejemplo, por 2 DSDS-PAGE y Western Blotting o espectrometría de masas.

separation-spinach-thylakoid-protein-complexes-native-green-gel

Research

Investigación

JoVE Journal

Environment

Entorno

Se describe aquí un protocolo para la purificación y caracterización de complejos de proteínas vegetales. Demostramos que por immunoprecipitating una sola proteína dentro de un complejo, para que podamos identificar sus modificaciones posteriores a la traducción y sus socios que interactúan.

Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

El enfoque descrito comparativa, cuantitativa proteómica tiene por objeto la obtención de conocimientos sobre la composición de los complejos multiproteicos bajo diferentes condiciones y se demuestra comparando genéticamente diferentes cepas. Para el análisis cuantitativo volúmenes iguales de diferentes fracciones de un gradiente de densidad de sacarosa se mezclan y se analizaron por espectrometría de masas.

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas

Este protocolo detalla la reconstitución in vitro de complejos de recolección de luz. Estas proteínas integrales de membrana coordinan las clorofilas y los carotenoides y son responsables de recolectar luz en las plantas superiores y las algas verdes.

En Vitro Reconstitución de complejos captadores de luz de Plantas y Algas

Este protocolo describe cómo preparar y realizar la electroforesis de atrapamiento de fracción líquida clara nativa eluida en gel (CN-GELFrEE), una técnica de separación nativa para ensamblajes biomoleculares no covalentes y proteínas de muestras heterogéneas que es compatible con varias técnicas de análisis de proteínas posteriores.

CN-GELFrEE - eluida-gel transparente nativo fracción líquida atrapamiento de electroforesis

Un protocolo para la aclaración de planta tilacoides proteína compleja organización y composición con poliacrilamida nativa azul gel electroforesis (BN-PAGE) y 2D-SDS-PAGE se describe. El protocolo está optimizado para Arabidopsis thaliana, , pero puede ser utilizado para otras especies de plantas con modificaciones menores.

Análisis de los complejos de la proteína de membrana de tilacoides por electroforesis nativa azul

Presentamos aquí protocolos de aislamiento de alto rendimiento de tilacoides fisiológicamente activos y análisis de transporte de proteínas para el cloroplasto doble arginina desplazamiento (cpTat), secretoras (cpSec1) y vías de partícula (cpSRP) de reconocimiento de señal.

Aislamiento de tilacoides fisiológicamente activos y su uso en ensayos de transporte dependiente de energía

Aquí presentamos un protocolo para extraer, resolver e identificar los supercomplejos mitocondriales que minimizan la exposición a los detergentes y al azul de Coomassie. Este protocolo ofrece un equilibrio óptimo entre la resolución y la preservación de las actividades enzimáticas, al tiempo que minimiza el riesgo de pérdida de interacciones entre proteínas y proteínas del lábil.

Híbrido claro/azul electroforesis nativa para la separación y análisis de Supercomplejos de cadenas respiratorias mitocondriales

El protocolo actual detalla el aislamiento de los ficobilisomas de las cianobacterias por centrifugación a través de un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo. Las fracciones de ficobilisomas intactos se confirman mediante el espectro de emisión fluorescente de 77K y el análisis SDS-PAGE. Las fracciones de ficobilisoma resultantes son adecuadas para la tinción negativa de TEM y el análisis de espectrometría de masas.

Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias

Más de la mitad de las proteínas son proteínas pequeñas (masa molecular &lt;200 kDa) que son difíciles tanto para formación de imágenes de microscopio electrónico y reconstrucciones tridimensionales. Tinción negativa optimizado es un protocolo robusto y de alto rendimiento para obtener imágenes de alto contraste y de pequeñas proteínas o complejos asimétricos en diferentes condiciones fisiológicas relativamente alta resolución (~ 1 nm).

Optimizado tinción negativa: un protocolo de alto rendimiento para el examen de Estructura Pequeña y asimétrica de proteínas por Microscopía Electrónica

Se presenta un protocolo sobre la caracterización y aplicación de cinco dispositivos de muestreo pasivo diferentes.

Caracterización y Aplicación de muestreadores pasivos para la vigilancia de plaguicidas en el agua

Aprende a separar complejos de tilacoides de espinacas mediante electroforesis en gel verde nativo y caracterizarlos con TCSPC. Este protocolo rápido permite analizar conexiones energéticas en un solo día.

Separación de espinacas tilacoides complejos de proteínas por electroforesis en Gel verde nativo y caracterización de banda utilizando conteo de fotones solo Time-Correlated (Video) | JoVE Journal

Separación de espinacas tilacoides complejos de proteínas por electroforesis en Gel verde nativo y caracterización de banda utilizando conteo de fotones solo Time-Correlated

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