Análisis de anomalías inducida por β-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina por espectroscopía y microscopía electrónica de barrido
30 de noviembre de 2018
Presentados aquí son dos métodos que pueden utilizarse individualmente o en combinación para analizar el efecto de beta-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina. Incluido es un protocolo para crear un coágulo de fibrina en vitro , y después coágulo turbidez y microscopía electrónica métodos.
La principal ventaja de este ensayo de turbidez basado en placas es que es rápido y permite que varios inhibidores de la interacción amiloide-beta fibrinógeno se torsen a la vez sin una configuración o requisitos sofisticados. Los compuestos de la cabeza que se encuentran en el ensayo de turbidez de la fibrina se pueden evaluar aún más por su capacidad para restaurar la anormalidad estructural inducida por A-beta en los coágulos de fibrina analizados por microscopía electrónica de barrido. La demostración visual de la preparación del coágulo para el análisis de microscopía electrónica de barrido es fundamental, ya que cualquier variación en la preparación puede contribuir a variaciones dentro de los resultados experimentales.
El enfoque de esta demostración aquí es en las interacciones de fibrinógeno A-beta. Este protocolo se puede modificar fácilmente para analizar otras interacciones con otras proteínas y los compuestos con el coágulo de fibrina. Comience añadiendo 1,5 micromolares de fibrinógeno recién preparado en 200 microlitros de tampón de formación de coágulos a cada A-beta negativo 42 que contiene y controla pozos e incubar la placa en una plataforma giratoria a temperatura ambiente.
Después de 30 minutos añadir simultáneamente 30 microlitros de solución de trombina recién preparada directamente en el centro del pozo que contiene fibrinógenos para iniciar la formación de coágulos y leer inmediatamente la absorbancia de los coágulos in vitro a 350 nanómetros, repitiendo la medición cada 30 a 60 segundos en el transcurso de 10 minutos. Para evaluar el efecto de los inhibidores de la interacción con fibrinógeno A-beta en la estructura del coágulo de fibrina, primero utilice fórceps para colocar limpio, la cubierta del círculo de vidrio siliconizado de 12 milímetros se desliza a los pozos individuales de una placa de 12 pozos y añadir 80 microlitros de fibrinógeno en cada resbalón de la cubierta, extendiendo suavemente la solución para que se distribuyan uniformemente. Añadir 20 microlitros de solución de trombina a cada pozo para iniciar la formación de coágulos.
Cubra el plato durante una incubación de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente, luego sumerja suavemente cada coágulo en dos mililitros de tampón de cacodilato de sodio helado durante dos minutos, cubierto, a temperatura ambiente dos veces, usando una pipeta de un mililitro para retirar cuidadosamente el tampón después de cada lavado. Después del último lavado, compruebe el estado de la formación de coágulos en el resbalón de la cubierta y fije los coágulos en dos o tres mililitros de hielo 2%glutaraldehído sobre hielo durante 30 minutos. Al final de la incubación, retire suavemente el glutaraldehído de cada pocópido y lave los coágulos con tampón de cacodilato de sodio fresco como se demuestra en el hielo.
Hidratar los coágulos fijos en una serie de cinco minutos de etanol helado de cinco minutos se lava sobre hielo sin eliminar completamente el etanol entre los lavados para mantener los coágulos protegidos de la exposición al aire. Durante el último lavado de etanol al 100%, transfiera los resbalones de la cubierta a un portacuchillas de secador de puntos críticos, colocando al menos 1 arandela entre cada resbalón de cubierta y coloque el soporte en una cámara de secadora de punto crítico llena de etanol. Después de un ciclo de secado de 30 minutos, utilice cinta de carbono para montar los resbalones de la cubierta en talones de microscopía electrónica de barrido individuales y transfiera las muestras a la cámara de recubrimiento de pulverización de una cinta de vacío.
A continuación, cubra menos de 20 nanómetros de paladio de oro u otros materiales conductores en las muestras durante 25 segundos a cuatro angstroms por segundo e imagine las muestras en un microscopio electrónico de barrido equipado con un detector de electrones secundario tipo dos a cuatro kilovoltas. La formación de coágulos de fibrina provoca la dispersión de la luz que pasa a través de la solución, lo que resulta en un aumento de la turbidez que se al final del período de lectura. Cuando el fibrinógeno se incuba en presencia de A-beta 42 la turbidez de la solución disminuye con la curva alcanzando una altura máxima de aproximadamente la mitad de la de fibrinógeno solo.
En presencia de un bloqueador de interacción A-beta 42 se mejora el efecto de beta-amiloide y la turbidez es mayor que la de A-beta solo. El efecto del bloqueador no aparece debido a la turbidez de fondo, ya que el compuesto no cambia la turbidez del coágulo de fibrina cuando A-beta está ausente. Además, la formación de coágulos en presencia de GPRP, un péptido conocido por interferir con la polimerización de la fibrina, demuestra una turbidez significativamente reducida en comparación con la formación de coágulos de fibrina en ausencia del inhibidor.
El fibrinógeno generado en presencia de trombina y cloruro de calcio sólo forman una malla de fibrina con hilos alargados e intercalados de fibrina, así como haces más grandes. Cuando A-beta está presente, los hilos de fibrina se volvieron más delgados con varios grumos pegajosos en agregados, lo que indica anomalías estructurales inducidas por A-beta. De acuerdo con los resultados del ensayo de turbidez, la formación de coágulos en presencia de un bloqueador de interacción de fibrinógeno A-beta restaura parcialmente la estructura del coágulo de fibrina a partir de los cambios inducidos por A-beta a medida que se observan menos grumos con este tratamiento.
El ensayo de turbidez del coágulo y los protocolos de análisis del microscopio electrónico de barrido se han optimizado para evaluar varios inhibidores de la interacción con fibrinógenos A-beta de una manera rápida y reproducible. Y pronto los datos proporcionarán información valiosa sobre la formación de coágulos de fibrina que se puede aplicar a otros estudios tanto in vitro como in vivo.
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Resumen
Este artículo presenta métodos para analizar el efecto del beta-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina, incluyendo un protocolo de coágulo de fibrina in vitro y métodos para la turbidez del coágulo y la microscopía electrónica de barrido.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Biología celular
Antecedentes
- La beta-amiloide está implicada en enfermedades neurodegenerativas.
- Los coágulos de fibrina desempeñan un papel en diversos procesos biológicos.
- Comprender la estructura de los coágulos de fibrina puede proporcionar información sobre los mecanismos de las enfermedades.
- Estudios previos han mostrado anomalías estructurales en los coágulos de fibrina debidas a la A-beta.
Objetivo del estudio
- Evaluar el efecto de la beta-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina.
- Analizar inhibidores de las interacciones entre la amiloide-beta y el fibrinógeno.
- Mostrar la preparación de coágulos para el análisis mediante microscopía electrónica de barrido.
Métodos Utilizados
- Ensayo de turbidez basado en placas para cribado rápido.
- Preparación de coágulos de fibrina in vitro utilizando fibrinógeno.
- Microscopía electrónica de barrido para analizar la estructura del coágulo.
- Modificación de protocolos para estudiar otras interacciones proteicas.
Resultados Principales
- Identificación de los compuestos principales que restauran la integridad estructural.
- La demostración visual de la preparación del coágulo es fundamental para la consistencia.
- Las variaciones en la preparación pueden afectar los resultados experimentales.
- Potencial para aplicaciones más amplias en el estudio de interacciones proteicas.
Conclusiones
- Los métodos presentados son efectivos para analizar la estructura del coágulo de fibrina.
- El cribado de inhibidores puede proporcionar información sobre estrategias terapéuticas.
- Investigaciones futuras pueden ampliar el conocimiento sobre las interacciones de otras proteínas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la detección rápida y reproducible de inhibidores de la interacción entre beta-amiloide y fibrinógeno mediante un ensayo de turbidez basado en placas, lo que apoya la validación temprana de dianas en el desarrollo de terapias para la enfermedad de Alzheimer. El método proporciona datos cuantitativos sobre la formación de coágulos y confirmación estructural mediante microscopía electrónica de barrido, facilitando el avance de compuestos activos hacia fases preclínicas en aquellos que mejoran las anomalías del coágulo de fibrina inducidas por A-beta. Al integrar las mediciones de turbidez con imágenes de ME, este enfoque ofrece desacople mecanicista y confianza predictiva para programas de descubrimiento dirigidos al sistema neurovascular.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Analiza la hipótesis terapéutica de que la interacción entre A-beta y fibrinógeno impulsa la formación de coágulos patológicos en la enfermedad de Alzheimer.
- Valor operativo: Permite la validación funcional del blanco al medir la turbidez del coágulo como una lectura directa de la inhibición de la unión entre A-beta y fibrinógeno.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar compuestos que restauran la estructura normal del coágulo de fibrina, lo que indica la interacción con el blanco y la reducción del riesgo biológico.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: El ensayo de turbidez optimizado es rápido, altamente reproducible y compatible con formatos de placas de múltiples pocillos para el cribado de grandes bibliotecas de compuestos.
- Resultado cuantitativo: Mide la absorbancia a 350 nm a lo largo del tiempo, proporcionando datos cinéticos sobre la formación de coágulos que permiten distinguir la eficacia del inhibidor de los efectos de fondo.
- Confirmación estructural: Los compuestos activos identificados mediante el cribado de turbidez se validan utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM) para visualizar la restauración de la arquitectura del coágulo de fibrina, asegurando que los resultados positivos no sean artefactos del ensayo.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela un mecanismo cerebrovascular de la patología del Alzheimer, vinculando el péptido A-beta con anomalías en los coágulos de fibrina asociadas a microinfartos y angiopatía amiloidea cerebral.
- Continuidad traslacional: Conecta el acoplamiento al blanco in vitro (turbidez) con la estructura fenotípica del coágulo (MEB), apoyando la reducción del riesgo mecanicista antes de la validación in vivo.
- Avance ajustado al riesgo: Permite tomar decisiones de avance o interrupción basadas en dos criterios: la inhibición del retraso en la formación del coágulo y la reversión de las anomalías estructurales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, permitiendo la comprobación de la hipótesis sobre la interacción entre A-beta y el fibrinógeno como un objetivo farmacológico, cuyos resultados alimentan los flujos de trabajo de identificación de compuestos activos y validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación de cómo la beta-amiloide altera la turbidez y la estructura del coágulo de fibrina, aclarando la participación de vías en la disfunción neurovascular.
- Selección: Ofrece disponibilidad y reproducibilidad del ensayo para la evaluación de alto rendimiento de inhibidores de la interacción entre beta-amiloide y fibrinógeno en formato de placa de 96 pocillos.
- Análisis: Proporciona cinética de turbidez y mediciones estructurales basadas en MEB que permiten el análisis comparativo de los efectos de compuestos sobre la formación y arquitectura del coágulo.
- Investigación Traducional: Conecta la inhibición del blanco con la restauración fenotípica del coágulo, alineándose con la continuidad preclínica para modelos de Alzheimer neurovasculares.
- Reutilización Empresarial: El flujo de trabajo de turbidez y MEB es una plataforma reutilizable aplicable a otras interacciones proteína-fibrinógeno más allá de la beta-amiloide, apoyando esfuerzos amplios de validación de blancos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva al vincular la inhibición bioquímica con la recuperación estructural del coágulo, reduciendo la ambigüedad mecanicista en la validación del objetivo.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante protocolos optimizados de preparación, lavado, fijación e imagen del coágulo.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción del proyecto al exigir validación funcional (turbidez) y estructural (SEM), reduciendo el riesgo biológico en etapas avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de inhibidores que demuestran corrección dual del retraso en la formación del coágulo y de la patología estructural.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la preparación de proteínas, ensayos de formación de coágulos y preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido.
- Depende del acceso a un lector de placas capaz de realizar mediciones cinéticas de absorbancia a 350 nm y a un equipo de pulverización al vacío con capacidad de imagen de MEB.
- Necesita la estandarización de los pasos de fijación, deshidratación y secado del coágulo para evitar artefactos estructurales que podrían dificultar la interpretación mediante MEB.
- Implica consideraciones de adaptación al extender el protocolo a otras interacciones proteína-fibrinógeno, particularmente en la composición del tampón y los tiempos de incubación.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de preparar reactivos frescos y un manejo cuidadoso para prevenir la variabilidad del coágulo debido a la exposición al aire o a lavados inconsistentes.
