Name: Un modelo In Vitro de un sistema de placas paralelas de la perfusión para el estudio de adherencia bacteriana a los tejidos de injerto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprende a estudiar la adherencia bacteriana a tejidos de injerto mediante un modelo de cámara de flujo in vitro con placas paralelas. Este método permite investigar la patogénesis de la endocarditis infecciosa bajo condiciones de flujo estandarizadas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudio fue patrocinado por una beca de la investigación fondo KU Leuven (OT/14/097) a RH. TRV fue Becario Postdoctoral de la Fundación de investigación FWO - Flandes (Bélgica; Concesión número - 12K0916N) y RH es apoyado por el fondo de investigación clínica de UZ Lovaina.

1. preparación de tejidos de injerto In Vitro estudios
Nota: Se utilizaron tres tipos de tejidos: parche de pericardio bovino (BP), injertos de homoinjerto criopreservado (CH) y la vena yugular bovina (BJV). En caso de conducto BJV y CH (tejido por el Banco Europeo de homoinjerto (EHB) y almacenado en nitrógeno líquido antes de usar), la pared y valvas valvulares fueron utilizados. Parche de BP y conducto BJV fueron comprados a los fabricantes. Antes de utilizar, descongele CH siguiendo las instrucciones de EHB12.
<ol><li>Lavar todos los tejidos con 0.9% NaCl antes del uso.</li>
	<li>Preparar las biopsias de tejido mediante una biopsia de piel desechable punzón para cortar piezas de tejido circular (diámetro 10 mm).</li>
	<li>Corte todos los parches de tejido a la misma altura utilizando bisturís estériles desechables.</li>
	<li>Para los tejidos fijados con glutaraldehído (por ejemplo conducto BJV), incubar pedazos del injerto durante la noche a 4 ° C con 200 g/L de albúmina humana para neutralizar el fijador.</li>
	<li>Lave a residuos de glutaraldehído con 0.9% NaCl en una placa de microtitulación.  Repita 3 veces en 1 minuto.</li>
</ol>2. preparación de las bacterias para los experimentos de perfusión
Nota: Se utilizaron tres cepas bacterianas: Cowan (ATCC 12598) de S. aureus , S. epidermidis ATCC 149900 y S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus y S. epidermidis fueron cultivadas a 37 º C en caldo de soja tríptica (TSB) y S. sanguinis fue aumentado a 37 ° C con 5% CO2 en caldo de infusión cerebro corazón (BHI).
<ol><li>Preparar una noche cultura de bacterias en una placa de agar sangre sólida.<ol>
<li>Utilizar un bucle estéril raspe las bacterias congeladas y sembrar sobre una placa de Mueller-Hinton agar sangre para el cultivo durante la noche a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizar un asa de inoculación estéril para recoger una sola Colonia de la cultura de agar sangre durante la noche e inocular en 10 mL de TSB o BHI en un tubo de 14 mL y cultura durante la noche a 37 ° C.</li>
	<li>Culturas durante la noche (3000 x g, 4 ° C, 10 min) de centrifugar y resuspender el pellet en 10 mL de tampón fosfato salino (PBS). Colocar tubos de 14 mL en hielo.</li>
	<li>Preparar una alícuota de la solución de 3,7 mg/mL de 5 (6) - carboxi - fluoresceína N-hidroxi-succinimidyl-éster (CF) en etanol y almacenar a-20 ° C. Diluir más el stock de la FQ a 150 μg/mL utilizando agua "ultrapura". Nota: Proteger los tubos de la luz con papel aluminio y almacenar a-20 ° C.</li>
	<li>Centrifugue las bacterias (3000 x g, 4 ° C, 10 min) y resuspender el pellet en 800 μl de PBS y añadir 200 μL de la solución de CF de 150 μg/mL (concentración final de 30 μg/mL utilizados para experimentos de perfusión). Proteger los tubos de la luz con papel de aluminio e incubar durante 30 min utilizando un agitador orbital.</li>
	<li>Después de etiquetar, bloque con el 2% de solución de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS y spin (3000 x g, 4 ° C, 10 minutos). Seguir con un paso de lavado con 10 mL de PBS y pellet de bacterias por centrifugación (3000 x g, 4 ° C, 10 minutos).</li>
	<li>Diluir las bacterias con PBS para obtener 107 las unidades formadoras de colonias (UFC) /mL (verificado por UFC recuento en placas de Mueller-Hinton agar sangre), que corresponde a un OD600 (densidad óptica) de 0.65. Mantener los tubos en la oscuridad en el hielo antes de experimentos de perfusión. Tenga en cuenta. Tenga en cuenta que las mediciones de600 OD reflejan el número aproximado de bacterias. Para contar la dosis de inoculación efectiva, el método de dilución seriada es un paso adicional es necesario para verificar la do números tal como se describe en la sección 3.8.</li>
</ol>3. in vitro experimentos de perfusión usando una cámara de flujo de placas paralelas
<ol><li>Biopsias de 10 mm de diámetro y del mismo grosor (preparada en los pasos 1.1-1.5) el montaje en un sistema de cámaras de flujo con la superficie interna hacia arriba para ponerse en contacto con la suspensión bacteriana. Nota: El mismo grosor de tejido a través de varios injertos garantiza que se alcanza la misma altura de tejido en el canal que permite el flujo laminar en todas las condiciones. Todos los elementos de la cámara de flujo se presentan y describen en la figura 1.<ol>
<li>Para comenzar el protocolo, coloque la pieza de tejido redondo entre un portaobjetos con una perforación circular de 8 mm y una Junta de goma. Nota: La diapositiva del microscopio posee la película ultra delgada inferior para permitir la generación del agujero de 8 mm. Junto con la hoja de goma, fija el tejido para permitir el contacto directo entre la muestra y el medio que fluye y también previene la dislocación de la biopsia durante el experimento. La superficie de los tejidos investigados, que se exposición al flujo (menor diámetro) no puede ser manipulada por el fórceps.</li>
		<li>Inserte el soporte con el tejido en la hoja de la Junta que está incrustada en la estructura metálica de la parte inferior de la cámara.</li>
		<li>Coloque el marco superior del metal con la correspondiente hoja de la Junta en la parte inferior de la cámara con el soporte de tejido previamente insertado. Posteriormente montar toda la cámara con ocho tornillos y tuercas de tornillo. Asegúrese de que la altura de la cámara es siempre la misma a través de injertos. Nota: La altura de la cámara debe determinarse siempre con los tornillos. Utilice un calibrador o la regla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conecte la cámara de flujo con una bomba peristáltica y el depósito del líquido de los tubos.</li>
	<li>Perfusión de los tejidos con suspensiones de 107 CFU/mL (verificado por UFC cuenta y relacionados con la medición de OD600 ) marcada con fluorescencia bacterias en PBS con una tensión de cizalla de 3 Dina/cm2 (Dina por centímetro cuadrado la unidad de presión) por medio de la bomba peristáltica (flujo 4 mL/min) durante 1 h con un reservorio bacteriano 400 mL (diseño, figura 1) condicionado a 37 ° C con un termostato de la placa (Tabla de materiales).</li>
	<li>Recirculan continuamente la suspensión bacteriana de 100 mL con el mismo depósito de recolección.</li>
	<li>Después de la perfusión, desmontar la cámara para liberar el injerto y lavar la pieza de tejido dos veces con 4 mL de PBS en una placa de 12 pozos usando el agitador orbital de laboratorio por 3 minutos. Posteriormente cortar la parte interna de la prótesis mediante una biopsia de piel punch de un diámetro más pequeño.</li>
	<li>Coloque cada biopsia de tejido en un tubo separado 14 mL que contiene 1 mL de estéril 0,9% NaCl. Etiquetar el tubo # 1.</li>
	<li>Separar las bacterias de los tejidos mediante un baño de sonicación durante 10 min (amplitud = 100% y la frecuencia = 45 kHz). Nota: En comparación con desprendimiento completo de la bacteria de los tejidos los injertos deben ser evaluados sobre la incubación de los parches durante la noche a 37 ° C en medio líquido TSB seguido por medidas de OD600 para controlar manchas tratadas con una solución libre de bacterias.</li>
	<li>Use un método de dilución seriada en placas de Mueller-Hinton agar sangre para contar unidades formadoras de colonias.<ol>
<li>Preparar un tubo de solo 14 mL con 10 mL de solución salina estéril para hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana obtenida después de la sonicación. Etiquetar este tubo como #2. Nota: Para cada uno un tubo de tejido experimento con 10 mL de 0.9% NaCl es necesario.</li>
		<li>Preparar tres tubos de 14 mL con 10 mL de estéril 0,9% NaCl para diluciones seriadas de la suspensión bacteriana inicial del paso 2.7. Etiquetar los tubos de la siguiente manera #3, #4, #5. Nota: Este paso es necesario conocer el real número de UFC en la suspensión bacteriana utilizado para el experimento de la perfusión.</li>
		<li>Vórtice mezcle cada tubo de vórtice s. 15 los tubos con la biopsia de tejido, así como la suspensión bacteriana inicial para hacer diluciones seriadas.</li>
		<li>Preparar tres placas de agar, dos para el experimento de tejido (perfusión de bacterias y control de la perfusión de PBS) y el tercero de la suspensión bacteriana inicial utilizada para perfusiones.</li>
		<li>Etiqueta de tres sectores por placa para el experimento de tejido de la siguiente manera 10-1, 10-3 y 10-4. Para contar el número de unidades formadoras de colonias en la perfusates bacteriana, etiqueta de la placa como sigue: 10-1, 10-3, 10-5 y 10-7. Nota: Todas las indicaciones en el agar de las placas tales como 10-1, 10-3 consulte el número final de UFC/mL calculado en el día siguiente. Placa de control no requiere de cualquier sector. Antes del uso, placas de agar sangre deben ser colocadas debajo de la campana laminar y abiertas para eliminar el exceso de humedad.</li>
		<li>Para continuar la preparación de las diluciones seriadas, transfiera 100 μl del tubo #1 al tubo #2 y mezcla vigorosamente con vortex.</li>
		<li>Extensión 100 μl de los contenidos del tubo #1 y #2 en los correspondientes sectores 10-1 y 10-3 de la placa de agar. Asimismo, difundir 10 μl del tubo #2 en el sector 10-4, repetir este paso 4 veces para obtener 4 masas separadas de cada volumen de 10 μl. Nota: Debido al pequeño volumen utilizado para la galjanoplastia en el sector 10-4, se aconseja tener múltiples número de gotitas para hacer un número medio de UFC cultivadas.</li>
		<li>Para preparar las diluciones seriadas de la cultura inicial, transferir 100 μl de suspensión bacteriana de paso 2.7 al tubo #3 y mezcla vigorosamente con vortex. Añada 100 μl del tubo #3 al tubo #4 y mezclar bien, repita el procedimiento para el posterior tubo #5.</li>
		<li>Extensión 100 μl de los contenidos de los tubos #3, #4, #5 y la suspensión bacteriana ajustada (paso 2.7), respectivamente, en sectores 10-3, 10-5, 10-7 y 10-1 de la placa de agar sangre.</li>
		<li>Dejar las placas de agar sangre en la campana laminar de aire seco las extensiones bacterianas, normalmente durante 10 minutos. Luego, coloque las placas a 37 ° C para la incubación de noche.</li>
		<li>Después de la incubación durante la noche, contar las colonias de bacterias para obtener el número de unidades formadoras de colonias resultantes de la adhesión a las biopsias de tejido así como UFC/mL en la suspensión bacteriana inicial utilizada para la perfusión. Expresar resultados en ufc/cm2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. fluorescencia microscopía de bacterias adheridas a los tejidos con perfusión de injerto
<ol><li>Después de la perfusión, lavar piezas de tejido con PBS (ver paso 3.5) y corte la parte interior de un injerto con un punzón de un diámetro más pequeño.</li>
	<li>Preparar una placa de 6 pozos y ponga gotas de medio de montaje (Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque cada pieza de tejido con su superficie inundada hacia abajo en una sola gota de medio de montaje.</li>
	<li>Leer un plato utilizando un escáner de fluorescencia (Tabla de materiales). Establecer los parámetros de excitación y emisión de longitudes de onda según un fluoróforo que se utiliza para el etiquetado bacteriana.</li>
</ol>

<ol><li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li>
<li>Werdan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+infective+endocarditis%3A+pathogen-host+interaction+and+risk+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).</li>
<li>Moreillon, P., Que, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).</li>
<li>Jalal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+propensity+of+bovine+jugular+vein+material+to+bacterial+adhesions%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study.</a> International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).</li>
<li>Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+Review+of+Infective+Endocarditis+in+Patients+With+Bovine+Jugular+Vein+Valves+Compared+With+Other+Valve+Types%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovascular+Interventions%22%5BJournal%5D)">A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types.</a> JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).</li>
<li>Malekzadeh-Milani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+predictors+of+Melody%28R%29+valve+endocarditis%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Cardiovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study.</a> Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).</li>
<li>Hill, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+prosthetic+valve+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Management of prosthetic valve infective endocarditis.</a> American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).</li>
<li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clumping+factor+A%2C+von+Willebrand+factor-binding+protein+and+von+Willebrand+factor+anchor+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).</li>
<li>Fowler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+invasion+by+Staphylococcus+aureus+involves+a+fibronectin+bridge+between+the+bacterial+fibronectin-binding+MSCRAMMs+and+host+cell+beta1+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins.</a> European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).</li>
<li>Patti, J. M., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+adhesins+recognizing+extracellular+matrix+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).</li>
<li>Massey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-binding+protein+A+of+Staphylococcus+aureus+has+multiple%2C+substituting%2C+binding+regions+that+mediate+adherence+to+fibronectin+and+invasion+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).</li>
<li>Jashari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Belgian+and+European+experience+with+the+European+Homograft+Bank+%28EHB%29+cryopreserved+allograft+valves--assessment+of+a+20+year+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chirurgica+Belgica%22%5BJournal%5D)">Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity.</a> Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).</li>
<li>Cheatham, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+hemodynamic+outcomes+up+to+7+years+after+transcatheter+pulmonary+valve+replacement+in+the+US+melody+valve+investigational+device+exemption+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial.</a> Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).</li>
<li>Que, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibronectin+binding+cooperate+for+valve+infection+and+invasion+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).</li>
<li>Veloso, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adherence+to+graft+tissues+in+static+and+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).</li>
<li>Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%2C+master+manipulator+of+the+human+hemostatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).</li>
<li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-%5Balpha%5D+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artheriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li>
<li>Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+tissue+engineering%3A+a+new+laminar+flow+chamber+for+in+vitro+improvement+of+mechanical+tissue+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties.</a> ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).</li>
<li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li>
</ol>

Observaciones clínicas recientes dan especial sensibilización a IE como complicación en pacientes sometido a reemplazo de la válvula del TSVD6,13. Disfunción de la válvula implantada en IE es el resultado de la interacción bacteriana con el injerto endovascular conduce a extenso inflamatorios y procoagulantes reacciones1,14. El modelo presenta novela en vitro nos permitió investigar si las difere...

Staphylococcus aureus (S. aureus) emplea una variedad de estrategias de virulencia para eludir el sistema de defensa inmune huésped colonizar superficies biológicas o no biológicas implantadas en la circulación humana, que conduce a infecciones intravasculares graves como sepsis y IE1,2,3,4,5. Restos de IE un importante tratamiento asociado de complicación en los pacientes después de la implantación de válvulas cardíacas protésicas y factores individuales que contribuyen a la aparición de IEare no todavía completamente entendido6,7. Bajo condiciones de flujo, las bacterias encuentran fuerzas de esquileo, que necesitan vencer para adherirse a la pared de vaso8. Modelos, que permiten estudiar la interacción entre bacterias y tejido de válvula protésica o endotelio bajo flujo, son de interés ya que reflejan la situación en vivo más.
Varios mecanismos específicos facilitan la adherencia bacteriana a las células endoteliales (ECs) y la matriz subendothelial expuestas (ECM) hacia la colonización de tejidos y la maduración de la vegetación, siendo los primeros pasos esenciales en IE9. Diversas proteínas superficiales Estafilocócicas o MSCRAMMs (componentes superficiales microbianos reconociendo las moléculas adhesivas de la matriz) han sido descritos como mediadores de adherencia a las células del huésped y las proteínas de la ECM interactuando con moléculas como la fibronectina, fibrinógeno, colágeno y von Willebrand factor (FvW)8,10,11. Sin embargo, en vista de plegamiento intra moleculares de algunos factores de virulencia, sobre todo estudiados en condiciones estáticas, muchas de estas interacciones pueden tener diferente importancia en infecciones endovasculares en la sangre circulante.
Por lo tanto, presentamos un casa diseñada en vitro placas paralelas cámara modelo de flujo, que permite la evaluación de la adherencia bacteriana a diferentes componentes de la ECM y ECs en el contexto de los injertos de tejido implantado en la posición del TSVD. El propósito general del método descrito en este trabajo es estudiar los mecanismos de interacción entre las bacterias y los tejidos subyacentes de endovascular en condiciones de flujo, que están estrechamente relacionadas con el medio ambiente en vivo de los agentes patógenos de la sangre tales como S. aureus. Este nuevo enfoque se centra en la susceptibilidad de las superficies de tejido de injerto a la adherencia bacteriana para identificar posibles factores de riesgo para el desarrollo de la IE.

<table><tbody><tr><td>Parche de pericardio bovino (BP), Supple Peri-Guard Pericardium</td><td>Synovis Surgical Innovations, EE. UU</td><td>. PC-0404SN</td><td></td></tr><tr><td>Conductos de vena yugular bovina (BJV)</td><td>Conducto de Contegra; Medtronic Inc, EE. UU.</td><td>M333105D001</td><td></td></tr><tr><td>CH homoinjerto criopreservado</td><td>European Homograft Bank (EHB)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc, EE. UU</td>. <td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td><td></td></tr><tr><td>albúmina humana</td><td>Flexbumin; Baxter, Bélgica</td><td>BE171464 LOTE:16G12C</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tríptico (TSB)</td><td>Fluka, Steinheim, Alemania</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de infusión cardíaca (BHI)</td><td>Fluka</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS).</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-Carboxifluoresceína N-hidroxisuccinimida éster (CF)</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>21878-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica (MODELO ISM444B)</td><td>Ismatec BVP-Z Estándar; Cole Parmer, Wertheim, Alemania</td><td>631942-2</td><td></td></tr><tr><td>Baño de sonicación</td><td>Limpiador ultrasónico VWR; VWR, Radnor, PA</td><td>142-6044</td><td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen by ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2000 (escáner de fluorescencia)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Arium Pro VF - agua ultrapura - H2O MilliQ</td><td>Millipore</td><td>87206462</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos microscópicos - Cámaras de cultivo de tejidos (1 pocillo)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td></td></tr><tr><td>1 pocillo en Lumox desmontable</td><td>Sarstedt</td><td>94.6150.101</td><td></td></tr><tr><td>Acero inoxidable - quirúrgico Cuchillas</td><td>Swann-Morton</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubo de silicona, 1/8" de diámetro interno x 1/4" de diámetro exterior</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-06 Rango de</td><td>temperatura: &ndash; 80 a 200 grados; C Esterilizar: Con óxido de etileno, irradiación gamma o autoclave durante 30 min, 15 psi de presión</td></tr><tr><td>PharMed BPT Tubing</td><td>Saint-Gobain AY242012</td><td></td><td>esterilizable en autoclave 30 min a 121 grados; C</td></tr><tr><td>Tygon LMT-55 Tubo</td><td>Saint Gobain Performance Plastics&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termostato</td> 15312022 <td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td><td>300-0042</td><td>230V, 90VA, 50Hz</td></tr></tbody></table>

un modelo in vitro de un sistema de placas paralelas de la perfusión para el estudio de adherencia bacteriana a los tejidos de injerto

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Varios conductos de válvulas y válvulas montada en stent se utilizan para reemplazo de la válvula de salida de ventrículo derecho (TSVD) de la zona en pacientes con enfermedad cardíaca congénita. Al utilizar materiales protésicos sin embargo, estos injertos son susceptibles a infecciones bacterianas y varias respuestas de host.
Es la identificación de factores bacterianos y host que juegan un papel vital en endovascular adherencia de microorganismos de importancia para comprender mejor la fisiopatología de la aparición de infecciones como la endocarditis infecciosa (EI) y desarrollar la prevención estrategias. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de modelos competentes para investigar adherencia bacteriana bajo condiciones fisiológicas del esquileo. Aquí, describimos el uso de un nuevo diseño en vitro perfusión cámara basado en placas paralelas que permite que el estudio de la adherencia bacteriana a diferentes componentes de los tejidos del injerto expuso como matriz extracelular, las células endoteliales y áreas inertes . Este método combinado con la formación de Colonia unidad (UFC) de conteo es adecuada para evaluar la propensión de los materiales de injerto hacia adherencia bacteriana bajo flujo. Además, podría utilizarse el sistema de cámara de flujo para investigar el papel de los componentes de la sangre en la adhesión bacteriana bajo condiciones de corte. Hemos demostrado que el origen del tejido, su morfología superficial y la especificidad de especies bacterianas no son los principales factores determinantes en la adhesión bacteriana a tejidos de injerto utilizando nuestro modelo interno diseñado en vitro de la perfusión.

Para comprender mejor los mecanismos detrás de IE desarrollo, este modelo permite la evaluación de bacterias y factores asociado del tejido presentan en la situación en vivo del inicio de la infección.
En detalle, el enfoque novedoso en vitro permite para cuantificar la adherencia bacteriana en condiciones de flujo a los tejidos de injerto diferentes por perfundiendo fluorescencia etiquetada bacteria s...

Describimos un interno diseñado en vitro cámara modelo de flujo, que permite la investigación de la adherencia bacteriana a los tejidos de injerto.

Un modelo In Vitro de un sistema de placas paralelas de la perfusión para el estudio de adherencia bacteriana a los tejidos de injerto

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la patogénesis de la endocarditis infecciosa y los patobiogramas a través de campos como la interacción entre bacterias, células sanguíneas y células endoteliales que recubren la musculatura. La principal ventaja de esta técnica es que los injertos de tejido podrían estar expuestos directamente a interacciones mutuas con varios objetivos, como bacterias, plaquetas y proteínas en condiciones de flujo estandarizadas. La implicación de esta técnica se extiende a nuestra terapia de endocarditis infecciosa, ya que puede desentrañar importantes interacciones moleculares y factores que impulsan la alta infecciosidad de ciertos tejidos.Este método proporciona información sobre la patogénesis de la formación de la vegetación. También puede ser aplicable en estudios que investigan la permeabilidad vascular, la movilidad celular y la expresión de células génicas. Para comenzar el protocolo, coloque una biopsia de tejido previamente preparada de 10 milímetros de diámetro, y el mismo grosor entre un portaobjetos del microscopio y una perforación circular de ocho milímetros, y una junta de goma con la superficie interior hacia arriba, para entrar en contacto con la suspensión bacteriana.Concéntrese en la orientación del injerto de tejido mientras se coloca en el soporte. Asegúrese de que la superficie interna del tejido ya esté expuesta a las caras del torrente sanguíneo hasta ponerse en contacto con el medio experimental. A continuación, inserte el soporte con el tejido en la hoja de la junta que está incrustada en el marco metálico inferior de la cámara.Fije el marco de metal superior con la hoja de junta correspondiente en la parte inferior de la cámara con el soporte de tejido insertado previamente. A continuación, monte toda la cámara con ocho tornillos y tuercas de tornillo. Asegúrese de que la altura de la cámara es siempre la misma en todos los injertos mediante el uso de una pinza o regla.A continuación, conecte la cámara de flujo con una bomba peristáltica. A continuación, conecte el depósito de líquido de 400 mililitros con los tubos. Perfunda los tejidos con suspensiones de 100 mililitros de diez a las siete unidades formadoras de colonias con etiqueta fluorescente en solución salina tamponada con fosfato con el estrés total de tres cenas por centímetro cuadrado y el caudal correspondiente de cuatro mililitros por minuto durante una hora utilizando la bomba peristáltica y el depósito bacteriano.Recircule continuamente la suspensión bacteriana de 100 mililitros utilizando el mismo depósito de recogida. Después de la perfusión, desmonte la cámara para liberar el injerto. Lave la pieza de tejido dos veces con cuatro mililitros de PBS en una placa de 12 pozos usando un agitador orbital durante tres minutos.Luego corte la parte interna del injerto usando un punzón de biopsia de piel con un diámetro más pequeño. Coloque cada biopsia de tejido en un tubo separado de 14 mililitros que contenga un mililitro de cloruro de sodio estéril al 0,9%. Separe las bacterias del tejido usando un baño de sonicación durante 10 minutos.Preparar un solo tubo de 14 mililitros con 10 mililitros de cloruro de sodio estéril al 0,9% para hacer diluciones en serie de la suspensión bacteriana obtenida después de la sonicación. Etiquete el tubo número dos. Preparar tres tubos de 14 mililitros con 10 mililitros de cloruro de sodio estéril al 0,9% para diluciones en serie de la suspensión bacteriana inicial llevada al experimento de profusión.Etiquete los tubos número tres, número cuatro y número cinco. A continuación, asegure tres placas de agar, una para la perfusión bacteriana, otra para la perfusión de control de PBS, y la tercera para la suspensión bacteriana inicial utilizada para las perfusiones. Etiquete tres sectores por placa para el experimento de tejido de la siguiente manera: 10-1, 10-3 y 10-4.Para contar el número de unidades formadoras de colonias en la perfusión bacteriana, etiquete la placa de la siguiente manera:10-1, 10-3, 10-5 y 10-7. Vórtice los tubos que contienen la biopsia de tejido durante 15 segundos cada uno, para hacer diluciones en serie. Para preparar las diluciones en serie, transfiera 100 microlitros del tubo número uno al tubo número dos, y vórtice el tubo para mezclar a fondo la solución.Extienda 100 microlitros del contenido del tubo número uno y el número dos en los sectores correspondientes, 10-1 y 10-3 de la placa de agar. A continuación, esparza 10 microlitros del tubo número dos en el sector 10 cuatro. Repita este paso cuatro veces para obtener cuatro crecimientos separados de cada volumen de 10 microlitros.Para preparar las diluciones en serie del cultivo inicial, primero vórtice la dilución durante 15 segundos y transfiera 100 microlitros de suspensión bacteriana al tubo número tres, y mezcle vigorosamente por vórtice. Agregue 100 microlitros del tubo número tres al tubo número cuatro y mezcle de nuevo. Repita el procedimiento para el tubo número cinco del tubo número cuatro.Extienda 100 microlitros del contenido de los tubos número tres, el número cuatro, el número cinco, y el cultivo inicial etiquetado respectivamente en los sectores 10-3, 10-5, 10-7 y 10-1 de la placa de agar de sangre. Deje que las placas de agar de sangre debajo de la capucha laminar sequen al aire las propagaciones bacterianas, por lo general durante 10 minutos. Después, coloque las placas a 37 grados centígrados para la incubación durante la noche.Después de la incubación durante la noche, cuente las colonias bacterianas para obtener el número de UFC. En condiciones de estrés total, se observó un apego bacteriano similar a través de los diversos tejidos del injerto para la infección por estafilococo aureus y estafiloco epidermidis. Siguiendo los procedimientos, el estreptococo sanguinis mostró una reducción significativa de la adherencia a la pared de la vena yugular bovina, en comparación con el parche de pericardio bovino.Al comparar las tres especies de bacterias, streptococcus sanguinis presenta una adhesión significativamente menor a la pared de la vena yugular bovina en relación con staphylococcus aureus y staphylococcus epidermidis. Al intentar este procedimiento, es importante recordar haber preparado los tejidos correctos de la misma cabeza. Garantizará condiciones similares en todas las muestras de experimentos y minimizará la variabilidad de los datos entre diferentes series de experimentos.Después de su desarrollo, esta técnica permite a los investigadores explorar los complejos sistemas de trastornos de una manera paso a paso mediante el enriquecimiento de sus enfoques modelo in vitro con diferentes elementos para construir una complejidad completa cerca del estado médico.

an-vitro-model-parallel-plate-perfusion-system-to-study-bacterial

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un método para la cultura de una monocapa de células endoteliales en toda la superficie interior en 3D de un dispositivo de microfluidos con microvascular del tamaño de los canales (&lt;30 micras) se describe.

Microfluídica endotelizado para estudiar las interacciones microvasculares en Enfermedades Hematológicas

Fuente: Ditkowski, B., et al. Un modelo in vitro de un sistema de perfusión de placas paralelas para estudiar la adherencia bacteriana a tejidos de injerto. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demuestra el método de utilizar una cámara de flujo de placas paralelas para perfundir bacterias marcadas con fluorescencia sobre tejidos de injertos vasculares, permitiendo un análisis controlado de la adhesión bacteriana y la patogénesis temprana bajo condiciones de flujo cortante.

Modelo in vitro de flujo paralelo de placas para estudiar la adhesión bacteriana en una biopsia tisular

Fuente: Calatayud Arroyo, M., et al. Evaluación de la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz intestino-microbio in vitro. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demuestra un modelo intestino-microbio in vitro para estudiar la viabilidad bacteriana. Se incuba un cocultivo de células Caco-2 y HT29-MTX con bacterias pretratadas bajo condiciones digestivas simuladas. Se evalúa la integridad de la barrera epitelial utilizando resistencia eléctrica transepitelial, y se recogen...

Modelo intestinal in vitro para evaluar la adhesión bacteriana e internalización

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Neisseria meningitidis es un patógeno específico humana que infecta a los vasos sanguíneos. En este protocolo microvasos humanos se introducen en un ratón mediante el injerto de piel humana en ratones inmunodeprimidos. Las bacterias se adhieren ampliamente a los vasos humanos, dando lugar a daño vascular y el desarrollo de la erupción purpúrica típicamente observado en casos humanos.

Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

Para estudiar la interacción de las bacterias con los vasos sanguíneos sometidos a esfuerzo cortante, se describe una cámara de flujo y un modelo de microscopía mesentérica intravital in vivo que permiten diseccionar los factores bacterianos y del huésped que contribuyen a la adhesión vascular.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Este protocolo demuestra métodos para permitir el cultivo in vitro extendido de xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Un paso mejora la viabilidad general de los cultivos de racimos multicelulares en hidrogeles 3D, a través de la eliminación directa de células individuales no viables. Un paso secundario demuestra las mejores prácticas para el cultivo de PDX en una plataforma microfluídica perfundida.

Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida

Este protocolo presenta la configuración y el funcionamiento de un biorreactor impreso en 3D recientemente desarrollado para el cultivo ex vivo de vasos sanguíneos en perfusión. El sistema está diseñado para ser fácilmente adoptado por otros usuarios, práctico, asequible y adaptable a diferentes aplicaciones experimentales, como biología básica y estudios farmacológicos.

Ex Vivo Cultivo de perfusión de grandes vasos sanguíneos en un biorreactor impreso en 3D

Aprende a estudiar la adherencia bacteriana a tejidos de injerto mediante un modelo de cámara de flujo in vitro con placas paralelas. Este método permite investigar la patogénesis de la endocarditis infecciosa bajo condiciones de flujo estandarizadas.

Un modelo In Vitro de un sistema de placas paralelas de la perfusión para el estudio de adherencia bacteriana a los tejidos de injerto (Video) | JoVE Journal

Un modelo In Vitro de un sistema de placas paralelas de la perfusión para el estudio de adherencia bacteriana a los tejidos de injerto

Explorar más videos