Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

Aquí, describimos los pasos esenciales para las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) en el segmento de la médula espinal en vitro . Este método permite que las propiedades intrínsecas de la membrana, transmisión sináptica y caracterización morfológica de las neuronas de la SG a estudiar.

Este método puede ayudar a aclarar los mecanismos espinales subyacentes a la transmisión sensorial, la regulación nociceptiva y el desarrollo del dolor crónico o dolor La principal ventaja de esta técnica es que puede permitir la preservación neuronal ideal y puede imitar las condiciones in-vivo hasta cierto punto. Comience tirando de los electrodos de grabación de microcapilar de vidrio de borosilicato utilizando un tirador capilar. Luego, llene un molde con agar fundido para preparar un bloque de agar de 1,2 centímetros por 1,5 centímetros por 2,0 centímetros.

Recorte el bloque para que tenga un canal central si planifica secciones transversales. O una carne de canal con el borde del bloque para secciones parasagitales. Antes de la profusión transcardial y la extracción de la médula espinal, preparar 500 mililitros de SQUI a base de sacarosa.

Enfriar la solución al frío y equilibrar con 95%O2 y 5%CO2. Enfríe todas las herramientas de disección en hielo. Haga una incisión longitudinal de cinco centímetros en la piel posterior de caudal a rostral.

Luego, corte a través de la caja torácica entre la columna vertebral y las costillas a cada lado. Use tijeras para hacer un corte en el extremo caudal de la columna vertebral. Luego corta los tejidos circundantes y aísla rápidamente el segmento lumbosacral de la columna vertebral.

Transfiera el segmento lumbosacral a un plato de vidrio que contenga sacarosa helada a base de ACSF. Con el lado ventral hacia arriba, utilice tijeras finas para cortar a través del pediculo vertebral bilateralmente y exponer la médula espinal cuidadosamente. Aísle una sección de dos centímetros de largo de la médula espinal con el agrandamiento lumbosacral y transfiera la sección espinal a otro plato de vidrio lleno de sacarosa fría ACSF.

Trabaje bajo un microscopio de disección para eliminar las meninges y la membrana aracnoides pia. Corta todas las raíces ventrales y dorsales lo más rápido posible. Tenga cuidado de evitar la lejura en la médula espinal, especialmente el cuerno dorsal al retirar las meninges y las raíces espinales.

Coloque la médula espinal en el bloque de agar previamente recortado. Para preparar rodajas transversales, une el lado ventral de la médula espinal al agar con el lado dorsal hacia la hoja. Para preparar rodajas parasagittales, une el lado ventral con superpegamento al agar en una dirección vertical.

A continuación, monte el bloque de agar en una plataforma de un vibratome con superpegamento. Y prepara rebanadas transversales o parasagitales de 300 a 500 micras con una velocidad avanzada de 0,025 milímetros por segundo y una frecuencia de vibración de 80 hercios. La médula espinal debe ser cortada en rodajas dorso-ventralmente.

Para obtener los mejores resultados, la rebanada debe prepararse en un plazo de 15 a 20 minutos. El grosor de la rodaja espinal no debe ser superior a 600 micras para satisfacer la visibilidad celular. Utilice una pipeta recortada de plástico para transferir las rodajas a la malla de nylon en una cámara de almacenamiento que contenga ACSF continuamente oxigenado a 32 grados centígrados.

Para llevar a cabo grabaciones de abrazaderas de parches de células enteras a partir de neuronas de sustancia gelatinosa o SG, utilice soluciones intracelulares basadas en iones de potasio para el registro mientras aplique una solución basada en cationes de cesio solo para el registro de corrientes postsinápticas inhibitorias. Mueva suavemente la rodaja de la médula espinal a la cámara de grabación. Y luego estabilizarlo firmemente con un alambre de platino en forma de U con hilos de nylon para una estabilidad óptima de la rebanada.

Profusa constantemente la rebanada con ACSF burbujeado a temperatura ambiente y ajuste la velocidad de profusión en dos a cuatro mililitros por minuto para lograr suficiente oxigenación. Luego, usando una lente de microscopio de baja resolución, identifique la región de las neuronas SG como una banda translúcida. Elija una neurona sana, caracterizada por una forma tridimensional con una membrana brillante y lisa como la célula objetivo utilizando el objetivo de alta resolución y ajústela al centro de la pantalla del monitor de vídeo.

Llene una micro pipeta con un volumen adecuado de solución intracelular basada en iones de potasio o iones de cesio. A continuación, inserte la microtutilla en el soporte del electrodo y asegúrese de que la solución intracelular está en contacto con el cable de plata dentro del soporte. Ponga la micro pipeta en el foco y utilice el micromanipulador para sumergirla en el ACSF.

Aplique una presión positiva suave para forzar la eliminación de la suciedad y los escombros. Mueva gradualmente la micro pipeta hacia la neurona objetivo. Una vez que la pipeta se acerca a la neurona y se forma un hoyuelo muy pequeño en la membrana neuronal, libere la presión positiva para formar un gigaseal.

Alterar el potencial de retención a menos 70 milivoltios, que está cerca del potencial de membrana de reposo fisiológico de una célula. A continuación, aplique una succión transitoria y suave a la micro pipeta para romper la membrana y crear una buena configuración de células enteras. Registre las propiedades de disparo probando el patrón de disparo de cada neurona en la abrazadera de corriente con una serie de pulsos de corriente despolarizante de un segundo de 25 a 150 picoamps con 25 incrementos de picoamp en el potencial de membrana en reposo.

Para registrar corrientes somáticas de subtarea, mantenga el potencial de membrana en menos 50 milivoltios en modo de abrazadera de voltaje y luego aplique una serie de pulsos de voltaje hiperpolarising de una segunda duración de menos 60 milivoltios a menos 120 milivoltios con un decremento de 10 milivoltios. Registre corrientes postsinápticas excitatorias con la solución intracelular basada en iones de potasio en modo de abrazadera de voltaje con un potencial de retención de menos 70 milivoltios. Registre ipSC utilizando la solución intracelular basada en ion de cesio para registrar IPSC.

Después de mantener el potencial de membrana en menos 70 milivoltios durante aproximadamente cinco minutos, cambie gradualmente el potencial de retención a cero milivoltios. Espere unos minutos para la estabilización y después comience a registrar los eventos IPSC. Los patrones de disparo determinados mediante la inyección de una serie de pulsos de corriente despolarizante de una segunda en una neurona SG en el potencial de membrana en reposo pueden clasificarse como disparo tónico, disparo retrasado, disparo de huecos, ráfaga inicial, ráfaga fásica, disparo de un solo pico y disparo a regañadientes.

Esta imagen muestra el protocolo de evocación para las corrientes de subtrano en la abrazadera de voltaje. Estos rastros representativos muestran la respuesta a la inyección de corriente hiperpolarizante clasificada como IH, IA y TI. Este es un rastro representativo de SEPSC registrado a partir de neuronas SG a menos 70 milivoltios en ausencia y presencia de 50 micromolares APV y 20 micromolarES CNQX. Esta traza muestra los SEPC registrados antes de la adición de APV y CNQX en una escala de tiempo ampliada.

Siguiendo este procedimiento son los métodos como las grabaciones de abrazaderas de parches emparejados o la optogenética se pueden realizar para responder preguntas adicionales como la caracterización de microcircuitos neuronales específicos en la sustancia gelatinosa.