Name: Combinado de modificaciones genéticas y químicas cápside de vectores basados en Adenovirus la transferencia de genes para blindar y dirigidos a (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprende a modificar cápsides de adenovirus mediante química simple para terapia génica y vacunación. Este método permite alterar interacciones vector-huésped con eficiencia superior al 90% en la modificación de monómeros.

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<ol><li>Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-05597-7_1">Molecular evolution of adenoviruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).</li>
<li>Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+content+and+evolution+of+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic content and evolution of adenoviruses.</a> Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).</li>
<li>Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+cytopathogenic+agent+from+human+adenoids+undergoing+spontaneous+degeneration+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).</li>
<li>van Oostrum, J., Burnett, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+composition+of+the+adenovirus+type+2+virion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular composition of the adenovirus type 2 virion.</a> Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).</li>
<li>Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+imaging+of+adenovirus%3A+bridging+the+resolution+gap+between+X-ray+crystallography+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22TheEMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy.</a> TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).</li>
<li>Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+reconstruction+reveals+the+complex+molecular+organization+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus.</a> Cell. 67, 145-154 (1991).</li>
<li>Meier, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+triggers+macropinocytosis+and+endosomal+leakage+together+with+its+clathrin-mediated+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake.</a> Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factor+X+shields+adenovirus+type+5+from+attack+by+natural+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement.</a> Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).</li>
<li>Qiu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+natural+IgM+concentration+on+gene+therapy+with+adenovirus+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors.</a> Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).</li>
<li>Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+clearance+rates+of+adenovirus+type+5+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Virology%22%5BJournal%5D)">Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice.</a> Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).</li>
<li>Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+systemically+delivered+adenovirus+vectors+with+Kupffer+cells+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver.</a> Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).</li>
<li>Schiedner, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hemodynamic+response+to+intravenous+adenovirus+vector+particles+is+caused+by+systemic+Kupffer+cell-mediated+activation+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells.</a> Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).</li>
<li>Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+adenovirus+by+Kupffer+cells+is+mediated+by+scavenger+receptors%2C+natural+antibodies%2C+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement.</a> Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).</li>
<li>Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adenovirus+serotype+5+hexon+regions+that+interact+with+scavenger+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors.</a> Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).</li>
<li>Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SR-A+and+SREC-I+binding+peptides+increase+HDAd-mediated+liver+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction.</a> Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).</li>
<li>Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+scavenger+receptors+and+host-derived+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands.</a> Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).</li>
<li>Ganesan, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clearance+of+blood-borne+virus+by+liver+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium.</a> PLoS Pathogen. 7, e1002281(2011).</li>
<li>Cichon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titer+determination+of+Ad5+in+blood%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note.</a> Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).</li>
<li>Carlisle, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+erythrocytes+bind+and+inactivate+type+5+adenovirus+by+presenting+Coxsackie+virus-adenovirus+receptor+and+complement+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1.</a> Blood. 113, 1909-1918 (2009).</li>
<li>Waddington, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+serotype+5+hexon+mediates+liver+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer.</a> Cell. 132, 397-409 (2008).</li>
<li>Kalyuzhniy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+serotype+5+hexon+is+critical+for+virus+infection+of+hepatocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).</li>
<li>Vigant, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616322833">Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).</li>
<li>Jonsson, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factors+IX+and+X+enhance+binding+and+infection+of+adenovirus+types+5+and+31+in+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells.</a> Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).</li>
<li>Bradshaw, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+receptor+engagement+during+infection+by+adenovirus+complexed+with+blood+coagulation+factor+X%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X.</a> PLoS Pathogen. 6, e1001142(2010).</li>
<li>Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+basic+amino+acids+in+the+factor+X+serine+protease+mediates+surface+attachment+of+adenovirus%2FFX+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes.</a> Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factor+X+shields+adenovirus+type+5+from+attack+by+natural+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement.</a> Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+adenovirus+hexon+allow+for+either+hepatocyte+detargeting+or+targeting+with+potential+evasion+from+Kupffer+cells.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).</li>
<li>Zaiss, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+Heparan+Sulfate+Is+Required+for+Adeno-Associated+Virus+2+but+Dispensable+for+Adenovirus+5+Liver+Transduction+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo.</a> Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).</li>
<li>Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uses+and+properties+of+PEG-linked+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Therapeutic+Drug+Carrier+Systems%22%5BJournal%5D)">The uses and properties of PEG-linked proteins.</a> Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).</li>
<li>Parveen, S., Sahoo, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine%3A+clinical+applications+of+polyethylene+glycol+conjugated+proteins+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs.</a> Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).</li>
<li>O'Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylation+of+adenovirus+with+retention+of+infectivity+and+protection+from+neutralizing+antibody+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo.</a> Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).</li>
<li>Subr, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coating+of+adenovirus+type+5+with+polymers+containing+quaternary+amines+prevents+binding+to+blood+components%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components.</a> Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).</li>
<li>Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001605001012">Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).</li>
<li>Corjon, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S152500161632679X">Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+adenovirus+hexon+allow+for+either+hepatocyte+detargeting+or+targeting+with+potential+evasion+from+Kupffer+cells.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).</li>
<li>Krutzke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+blood+coagulation+factor+X-binding+to+Ad5+by+position-specific+PEGylation%3A+Preventing+vector+clearance+and+preserving+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity.</a> Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+bioresponsive+shielding+of+adenovirus+hexon+with+HPMA+copolymers+maintains+transduction+capacity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo.</a> PloS One. 9, e82716(2014).</li>
<li>Kratzer, R. F., Kreppel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+Purification%2C+and+Titration+of+First-Generation+Adenovirus+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 377-388 (2017).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La eficiencia por el cual las cisteínas genéticamente introducidas pueden ser modificados químicamente es típicamente 80-99%, y ciertas variables influyen en dicha eficacia. En primer lugar, es primordial que las cisteínas genéticamente introducidas no sufren oxidación prematura. Estando bien protegido en el ambiente reductor de las células del productor, es obligatorio proporcionar un ambiente no-oxidative después de lanzar vector partículas de las células del productor y en la modificación química. Para ello, reduciend...

Adenovirus (Ad), miembros de la familia Adenoviridae, son virus no-envueltos de ADN de los tipos más de 70 hasta ahora han sido identificados (http://hadvwg.gmu.edu). Según hemaglutination propiedades, estructura del genoma y resultados de la secuenciación, los tipos de 70 D.c. pueden dividirse en siete especies (adenovirus humano A G)1,2. El genoma humano de Ad es de 38 kb en tamaño y encapsulado por una nucleocápside icosaédrica3. Debido a su abundancia, el capsid proteína hexon, base del penton y fibra se todos conocen como proteínas de la cápsida principales. El más abundante y más grande capsid proteína hexon forma 20 facetas de cápside, cada uno con 12 del hexon homotrimers4,5. Penton, situado en cada borde icosaédrica (vértice), consiste en pentámeros de una base del penton y representa la base para el punto de vértice que está construido de fibra de glicosilada trimers5,6. La entrada de células nativa de Ad se compone básicamente de dos pasos principales. En primer lugar, la perilla de la fibra se une al receptor primario. Tipos de anuncios de las especies A, C, E y F, es el receptor coxsackie y adenovirus (coche). Esta interacción trae el virión en proximidad espacial de la superficie celular, facilitando así las interacciones entre las integrinas celulares y RGD motivo en la base del penton y consecuentemente inducir respuestas celulares. En segundo lugar, cambios en el citoesqueleto de llevan a la internalización del virión y transporte al endosome7. Sobre desmontaje parcial en el endosome, el virión se libera al citoplasma y en última instancia viaja al núcleo para la replicación.
Mientras que el anuncio puede entregarse localmente (ej., para la vacunación genética), entrega sistémica por el torrente sanguíneo como para onco-viroterapia enfrenta a varios obstáculos. Mientras circulan en el torrente sanguíneo, viriones inyectados encontrarán el sistema de defensa del sistema inmunitario del hospedador hacia la neutralización rápida de los vectores basados en virus y representación vectores basados en Ad extremadamente ineficiente en aplicaciones sistémicas. Además, la natural hepatotropismo de Ad interfiere con entrega sistémica y debe resolverse en redirigir anuncio sus nuevas células blanco.
Codificado del germline natural IgM anticuerpos del sistema inmune innato rápidamente reconocen y enlazar las estructuras altamente repetitivas en la superficie del virión8,9. Estos complejos inmunes luego activan las vías clásicas y no clásica del sistema del complemento, conduciendo a neutralización rápida mediada por el complemento de una gran parte de los viriones8. Una segunda vía dando lugar a mayor eliminación de virions Ad es mediada por macrófagos10 y asociada con aguda tóxica y hemodinámicos efectos secundarios11,12. En el caso de anuncio en particular, Kupffer células residentes en el hígado se unen a y phagocytically toman el anuncio viriones a través de limpiador específico receptores de tal modo eliminándolos de la sangre13,14,15 . También se han identificado receptores scavenger específicos en las células endoteliales sinusoidales hígado (células LSE)16, y LSE células también parecen contribuir al vector eliminación17, sino en qué medida necesita aclaración. Además, algunos tipos de anuncios y sus vectores derivadas son eficientemente secuestrados por eritrocitos humanos18 al que se unen mediante coche o el receptor del complemento CR119. De nota, este mecanismo de secuestro no puede ser estudiado en el sistema de modelo de ratón como en contraste con los eritrocitos humanos, eritrocitos de ratón no expresan el coche.
Anticuerpos específicos anti-anuncios generados por el sistema inmune adaptativo después de la exposición al anuncio debido a infecciones anteriores con Ad o después de la primera entrega en aplicaciones sistémicas levantar una barrera adicional al uso eficaz de los vectores de Ad, y deben ser evadidos en entrega sistémica eficiente.
Por último, el fuerte hepatotropismo de algunos tipos de anuncios (incluyendo Ad5) seriamente dificulta la aplicación de Ad en la terapia sistémica. Este tropismo resultando en la transducción de hepatocitos es debido a la alta afinidad del virión Ad para el factor de la coagulación de sangre X (FX), mediada por la interacción de la FX con el anuncio del hexon proteína20,21,22. FX puentes el virión a glicanos de sulfato de heparina (HSPGs) en la superficie de hepatocitos20,23,24,25. Un factor crucial para esta interacción parece ser la medida específica de N - y O-sulfatación de HSPGs en24de las células del hígado, que es distinto de HSPGs en otros tipos celulares. Además de esta vía mediada por FX, estudios recientes sugieren otras vías aún no identificaron que resultan en la transducción de anuncio de hepatocitos26,27,28.
Recientemente, se ha demostrado que FX no sólo participa en la transducción de hepatocitos de Ad, pero también por enlace, el virión protege la partícula de virus contra la neutralización por el sistema de complemento26. Reducción de transducción del hepatocito por prevención de atascamiento de FX, por lo tanto, crearía el efecto secundario indeseado de aumentar Ad neutralización por el sistema inmune innato.
Un conocimiento profundo de las complejas interacciones entre los vectores y los organismos de acogida por lo tanto es necesario desarrollar vectores más eficientes para aplicaciones sistémicas que eluden las trabas impuestas por el organismo del anfitrión.
Una estrategia que ha utilizado originalmente para proteínas terapéuticas ha sido adaptada para vectores de anuncio por lo menos parcialmente superar las barreras descritas arriba. Antigenicidad y la inmunogenicidad de la proteína terapéutica compuestos podrían reducirse por acoplamiento al polietilenglicol (PEG)29,30. Por lo tanto, el acoplamiento covalente de polímeros tales como PEG o poli [N-(2-hidroxipropil) methacrylamid] (pHPMA) a la cápside superficie protege el vector de las interacciones host vector no deseados. Comúnmente, acoplamiento de polímero está dirigido a grupos ε-amino de residuos de lado de lisina que se distribuyen al azar en la superficie de la cápside. Las partículas vectoriales en la solución, debido a la naturaleza hidrofílica de los polímeros adjuntos, rodeadas de una concha de agua estable que reduce el riesgo de reconocimiento de células inmunitarias o degradación enzimática. Por otra parte, vectores pegilado Ad fueron demostrados para evadir la neutralización por anticuerpos anti hexon en vitro y en ratones previamente inmunizados en vivo31. En contraste con modificaciones genéticas de la cápside, acoplamiento químico de polímeros se realiza después de la producción y purificación, lo que permite no sólo para el uso de células productora convencional y la producción de las poblaciones de vectores de alto título, sino también para simultánea modificación de miles de aminoácidos en la superficie de la cápside. Sin embargo, dirigido por amina blindaje se produce al azar a lo largo de la superficie de la cápside entero, dando por resultado alta heterogeneidades y no permitiendo modificación de capsómeros específicos. Además, las moléculas de polímero grande para efectos beneficiosos afectan virus bioactividad32.
Para superar estas limitaciones, Kreppel et al. 33 introdujo un concepto de geneti-química de vectores re - y la focalización. Cisteínas genéticamente fueron introducidos en la cápside del virus en las posiciones expuestas al solvente como fibra HI-lazo33, proteína IX34y del hexon35,36. Aunque pueden producir vectores de Ad no natural, rodamiento de cisteína en altos títulos en las células normales del productor. Lo importante, inserción de cisteínas en algunos capsómeros y en distintas posiciones dentro de un capsómero solo permite modificaciones muy específicas de moléculas reactivas con el grupo tiol. Este enfoque geneti-química se ha demostrado para superar numerosos obstáculos en el diseño vectorial. La combinación de la pegilación base de aminas para desapuntar y acoplamiento tiol-basado de la transferrina a la perilla de fibra que HI-lazo ha sido probado con éxito Demons modificación vectores anuncio coche deficientes las células33. Dado que hexon participa en interacciones más indeseadas (neutralización de anticuerpos, factor de coagulación de sangre FX), estrategias de modificación de tiol-basado también se aplicaron a hexon. Acoplamiento de pequeñas moléculas de PEG al HVR5 del hexon prevenir partículas de vector Ad para transducir las células SKOV-3 en presencia de FX, mientras que grandes partes de PEG aumentaron hepatocito transducción14,35. Partículas de vector ad llevar mutaciones en la perilla de fibra inhibe la Unión del coche y el HVR7 inhibe Unión de FX (cisteínas rodamiento insertado en HVR1 para posición específica la pegilación) fueron demostradas para evadir la neutralización mediada por anticuerpos y complemento, así como scavenger receptor-medió la absorción sin pérdida de infectividad. Curiosamente, a pesar de la falta del escudo natural de FX, la pegilación nuevamente mejorado transducción de hepatocitos como una función de PEG tamaño36. Sin embargo, fue demostrado que blindar covalentes tienen un impacto en los procesos de tráfico intracelulares. Mero et al. en comparación con irreversible frente a escudos de bioresponsive basado en pHPMA y demostró que ni el modo de carga de protección ni de copolímero tuvo un impacto en la entrada de la célula pero afectó tráfico de partículas en el núcleo. Empleo de un escudo bioresponsive con carga positiva pHPMA copolímeros permitidos para el tráfico de partículas en el núcleo, manteniendo la eficiencia de transducción alta de anuncio vectores in vitro e in vivo37.
En Resumen, estos datos indican que, incluso bajo el supuesto de que todo vector-host-interacciones fueron conocidas y consideradas, cápside excesiva superficie modificaciones son necesarias para superar los obstáculos asociados con la entrega sistémica de vector.
Aquí proporcionamos un protocolo para realizar modificaciones químicas específicas de cápsida de vector de adenovirus para blindar o retargeting de partículas de vector de adenovirus y virus basados en adenovirus oncolíticos. El concepto de esta tecnología se describe en la figura 1. Permite la protección de ciertas regiones de la cápside de interacciones no deseadas por el accesorio covalente de polímeros sintéticos. Al mismo, también proporciona un medio para fijar ligandos y combinar protección y orientación. Usando la simple química, experimentadores podrá modificar covalentemente superficie de vectores de adenovirus con una gran variedad de moléculas incluyendo péptidos/proteínas, carbohidratos, lípidos y otras moléculas pequeñas. Además, el protocolo proporciona un concepto general para la modificación química de vectores derivados de virus biológicamente activos en el mantenimiento de su integridad biológica y la actividad.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Purificación de vectores y modificación química</gas ></td>argón fuerte Distribuidor local de gas líquido Distribuidor local de <td></td><td></td><td></td></tr><tr>nitrógeno<td>líquido</td><td>Aire líquido</td><td>Tubos</td><td></td></tr><tr><td>de centrífuga de 500 ml</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Stericup Express Plus 0,22 y micro;<td></td></tr><tr><td> m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-10g</td><td></td></tr><tr><td>2 mL (3mL) Norm Ject (jeringas)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4020.000V0</td><td></td></tr><tr><td>Agujas Fine-Ject para un solo uso (amarillo 0,9 x 40 mm)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710009040 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de cesio 99.999% Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>8627.1</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de gel de sílice</td><td>Applichem</td><td>A4569.2500</td><td></td></tr><tr><td>Metoxipolietilenglicol maleimida - 750 (PEG mal-750)</td><td>Tienda Iris Biotech</td><td></td><td>en perlas de gel de sílice a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>13.2 mL Tubos de ultracentrífuga ultra transparente</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>344059 solo abierto en campana</td></tr><tr><td>PD-10 columna de cromatografía de exclusión de tamaño</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>tienda a 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A1069.1000</td><td></td></tr><tr><td>SDS Ultrapure</td><td>AppliChem</td><td>A1112,0500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A1123.1000</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td> Material para cultivo celular</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-0231SP</td><td></td></tr><tr><td>FBS Good</td><td>PAN Biotech</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de filtro Biosphere (varios tamaños)</td>Pipetas serológicas <td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(varios tamaños)</td>Tubos de reacción <td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(varios tamaños)</td>Placas <td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC 15cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</ fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Material para el protocolo de tinción de plata</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T.Baker</td><td>8045</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>AppliChem</td><td>1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>AppliChem</td><td>A0820,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído 37%</td><td>AppliChem</td><td>A0877,0250</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>AppliChem</td><td>A1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>Tiosulfato de sodio</td><td>AppliChem</td><td>1,418,791,210</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de plata</td><td>AppliChem</td><td>A3944.0025</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sodio</td><td>AppliChem</td><td>A3900,0500</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Compañía</fuerte><</td><td>fuerte>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipo especial de laboratorio</fuerte></td>Desecador Nalgene 5311-0250 Megafuge 40 Heraeus Roter para Megafuge TX750 + Adaptador y Llids para tubos de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 500 mL Heraeus Baño de agua <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ultracentrífuga convencional</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p. ej. Optima XPN-80</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>adecuado Ultrazentrifuge Rotor p. ej. SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH Convencional</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soporte con abrazaderas</td><td>Convencional</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de cuello de cisne</td><td>Convencional</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor en cabeza</td><td>Bloque térmico convencional</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fotómetro convencional</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(OD 260)</td><td>Convencional</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinado de modificaciones genéticas y químicas cápside de vectores basados en adenovirus la transferencia de genes para blindar y dirigidos a

Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting

Vectores de adenovirus son herramientas potentes para genética vacuna y oncolíticos viroterapia. Sin embargo, son propensos a múltiples interacciones host vectores indeseados, especialmente después de la entrega en vivo . Es un consenso que las limitaciones impuestas por las interacciones indeseadas vector-host sólo pueden superarse si se realizan modificaciones definidas de la superficie del vector. Estas modificaciones incluyen protección de las partículas de las interacciones no deseadas y dirigidas a la introducción de nuevos ligandos. El objetivo del protocolo presentado aquí es que el lector generar blindado y, si lo desea, reorientarse vectores de transferencia génica humana adenovirus o virus oncolíticos. El protocolo permitirá a los investigadores modificar la superficie de la cápsida de vector de adenovirus por fijación química específica de polímeros sintéticos, carbohidratos, lípidos y otras moléculas biológicas o químicas. Describe la tecnología de vanguardia de modificaciones de la cápside genética y química combinada, que se han demostrado para facilitar la comprensión y superación de barreras para la entrega en vivo de los vectores de adenovirus. Se proporciona una descripción detallada y comentada de los pasos cruciales para llevar a cabo las reacciones químicas específicas con virus biológicamente activos o vectores derivados de virus. La tecnología descrita en el protocolo se basa en la introducción genética de cisteína (naturalmente ausente) residuos en lazos expuestos al solvente de vectores derivados de adenovirus. Estos residuos de cisteína proporcionan una reactividad química específica que puede, después de la producción de los vectores a altos títulos, ser explotada para el acoplamiento químico covalente altamente específico y eficiente de moléculas de una amplia variedad de clases de la sustancia al vector partículas. Lo importante, este protocolo se puede adaptar fácilmente para llevar a cabo una amplia variedad de diferentes modificaciones químicas (no basado en tiol) de cápsida de vector de adenovirus. Por último, es probable vectores de transferencia del gene de basada en virus no-envueltos que adenovirus pueden ser modificado de la base de este protocolo.

La figura 2 muestra ejemplos del efecto citopático (CPE) en 293 células (HEK 293) que indica la producción de vectores de éxito. Las células deben presentar morfología (figura 2) 40-48 horas después de la inoculación con el vector de virus. El punto adecuado para la cosecha es crucial para no perder las partículas del virus por lisis celular y previniendo la oxidación de los grupos tiol genéticamente introducidas. Si partículas v...

El protocolo aquí descrito permite a los investigadores modificar específicamente cápsida de adenovirus en sitios seleccionados por simple química. Blindado adenovirus vectores partículas pueden generarse vectores de transferencia génica versión y vector host interacciones pueden ser estudiadas.

Combinado de modificaciones genéticas y químicas cápside de vectores basados en Adenovirus la transferencia de genes para blindar y dirigidos a

Adenovirus vectors are potent tools for genetic vaccination and oncolytic virotherapy. However, they are prone to multiple undesired vector-host ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia génica, la oncolisis y la vacunación genética. Facilita la comprensión y modulación de las interacciones de los hosts vectoriales de vectores de transferencia de genes de adenovirus, el tipo de vector más utilizado en ensayos clínicos actualizados. La principal ventaja de esta técnica es que los capsulados de adenovirus se pueden modificar específicamente de una manera muy definida en posiciones seleccionadas y en extensión variable mediante el uso de química simple.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia porque la modificación del huésped vectorial no sólo puede ser analizada sino también modulada de una manera orientada al paciente. Aunque este método proporciona información sobre interacciones específicas del huésped vectorial, también se puede utilizar para el etiquetado y seguimiento de partículas de virus en organismos vivos, como ratones. Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán con la combinación única de Virología y Cchemistry Orgánica que requiere conocimiento práctico de ambos campos.La demostración especial de esta técnica es fundamental porque aquí los métodos de Química Orgánica cumplen con los métodos de Biología Celular y Virología, incluyendo trucos de manejo específicos sobre el terreno. Para comenzar este procedimiento, prepare todos los búferes como se describe en el protocolo de texto. Pesa un mililitro de cada búfer de gradiente para comprobar su densidad.Después de esterilizar todos los tampones, escupe los tampones que contienen TCEP con gas argón durante unos 30 segundos para evitar la oxidación del TCEP. Almacene los viales que contienen la mitad de acoplamiento en polvo sólido en tubos más grandes, cada uno lleno con un cojín de perlas de gel de sílice, para evitar la acumulación de agua condensada al descongelar los viales. Coloque estos tubos en un desecador.Retire el aire del desecador y sustitúyalo por gas argón. A continuación, cierre cada tubo firmemente y transfiéralo a un recipiente más grande con cuentas de gel de sílice. Una vez que todos los tubos han sido transferidos, cierre el contenedor.Almacene el recipiente a 80 grados centígrados hasta que esté listo para usar. Cuando esté listo para descongelar, coloque el recipiente en una capa de perlas de sílice en un desecador. Deje que el recipiente se caliente lentamente a temperatura ambiente y luego abra el recipiente.Cuando las células alcancen el efecto citopático óptimo, recórrelas raspando las placas y transfiriendo el sobrenadante a tubos centrífugos. Gire la suspensión celular a 400 veces G durante 10 minutos. A continuación, vuelva a suspender el pellet celular en cuatro mililitros de tampón de addlu litro que contengan 10 TCEP mili evolucionadores y transfiera la solución resultante a un tubo estéril de 50 mililitros.Congele la solución en nitrógeno líquido y, a continuación, descongele en un baño de agua a 37 grados centígrados. Repita este ciclo de descongelación de congelación tres veces para rescatar el vector. Centrifugar a 5000 G y cuatro grados centígrados durante diez minutos.Durante la centrifugación estableció dos tubos de centrífuga ultra para comenzar a preparar dos gradientes de paso de cloruro de cesio iguales. Añadir tres mililitros de la fase inferior a cada uno de estos tubos. Marque el nivel de la fase inferior en el tubo antes de cargar la fase superior.Luego apilar cuidadosamente cinco mililitros de la fase superior hasta la fase inferior, pipeteándolo muy lentamente a lo largo de las paredes del tubo. Cuando se preparan los gradientes y la centrifugación es completa, cargue el sobrenadante de la muestra por igual sobre los dos gradientes. Llene el espacio restante en cada tubo de degradado con Ad-buffer que contiene diez TCEP mililarios asegurándose de llenar los tubos hasta la parte superior.Ajuste el peso de los tubos opuestos a una diferencia de peso cero. Y alterar la centrífuga para 176000 veces G y 4 grados Celsius durante dos horas. Después de esto, utilice una abrazadera para fijar un tubo de centrifugación ultra a un soporte.Asegúrese de dejar el área alrededor del nivel de fase inferior marcada como accesible. Coloque la lámpara de cuello de ganso por encima del tubo. Alrededor de la marca, en el borde entre las fases inferior y superior, una banda distinta debe ser visible.Perfore el tubo con una aguja y aspire la banda vectorial en una jeringa para recoger el vector. Transfiera virones vectoriales recogidos a un tubo de 15 mililitros y calcule la cantidad de sustrato de acoplamiento necesaria como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfiera la solución vectorial a un tubo de tamaño adecuado.Y la cantidad calculada de solución de stock de compuestos de acoplamiento. Mezclar suavemente por rotación superior durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, ajuste el volumen total de la solución vectorial a seis mililitros agregando el búfer de anuncios.Purifique el vector de la mitad de acoplamiento no reaccionada utilizando un segundo paso de unión de cloruro de cesio como se describe en el protocolo de texto. Perfore el tubo con una aguja y aspire la banda vectorial en una jeringa. Transfiera los vectores recogidos a un tubo de 15 mililitros.Si la combinación de ambos tubos de gradiente es inferior a 2,5 mililitros, ajuste el volumen a 2,5 mililitros añadiendo Ad buffer. Cargue los virones combinados en una columna Pd mejorada igual y deseche el flujo a través. A continuación, agregue tres mililitros de búfer de anuncio a la columna y recopile el flujo a través.Añadir 333 microlitros de glicerol al flujo recogido a través de para obtener la concentración final del diez por ciento. Divida estos en alícuotas adecuadas. Asegúrese de incluir una alícuota de 20 microlitros para una determinación más estricta mediante la medición OD 260.Almacene la solución vectorial a 80 grados centígrados hasta que esté lista para su uso. Los resultados representativos de los efectos en 293 células indican que la producción vectorial es exitosa. Las células deben mostrar morfología 40-48 horas después de haber sido inoculadas con el vector del virus.El fago SDS teñido de plata se utiliza entonces para evaluar la eficiencia del acoplamiento. Los vectores con Cysteins introducidos en la base de pentone capsomere tanto con el hexon modificado y no modificado se ejecutan. Las bandas Hexon exhiben un cambio que indica una modificación exitosa de más del 90 por ciento de los monómeros por cálsido.Al intentar este procedimiento es importante garantizar un entorno reductor para partículas vectoriales no indomificadas. Después de la modificación, una atmósfera regular es adecuada. Los cálculos documentales precisos tienen que garantizar la modificación cuantitativa de todas las partículas vectoriales.El desarrollo de esta técnica ayuda a la investigación en el campo de la Terapia génica para explorar más a fondo estrategias seguras y deficientes para la entrega de vectores. Siguiendo este procedimiento se pueden realizar otros métodos como el acoplamiento de ligandos para la orientación o colorantes fluorescentes para el etiquetado con el fin de responder a preguntas adicionales como el uso del receptor y la distribución de la bio. Por favor, asegúrese de obedecer su OMG local y las Regulaciones de Seguridad de Trabajo.

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Biología

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Combinado de modificaciones genéticas y químicas cápside de vectores basados en Adenovirus la transferencia de genes para blindar y dirigidos a

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