Visualización en tiempo real y análisis de la lesión de condrocitos debido a cargas mecánicas en explantes de cartílago murino intacta

Este método permite investigar los efectos de diferentes regímenes de carga mecánica, condiciones ambientales o etapas de degeneración del cartílago en la vulnerabilidad de los condrocitos articulares in situ. Las fuerzas físicas. A diferencia de otras técnicas, estas mediciones se realizan en tiempo real y en cartílago totalmente intacto sin comprometer las condiciones límite nativas.

Otra ventaja de esta técnica es que utiliza un modelo de ratón, permitiendo probar cómo genes específicos afectan la susceptibilidad de los condrocitos in situ en lesiones mecánicas. Para la disección del fémur distal, coloque el ratón en la posición supina y haga una incisión cutánea de cinco milímetros en la parte anterior de la rodilla. Extienda la incisión alrededor de la rodilla.

Y tire hacia atrás de la piel para exponer la articulación de la rodilla y los músculos de las piernas. A partir del extremo proximal del fémur, utilice una hoja de bisturí número once para cortar a lo largo del hueso en la dirección distal. Colocación de la hoja entre la unidad del tendón muscular del cuádriceps y el lado anterior del eje femoral.

Extiende la incisión más allá de la rótula. Cortar a través de la mitad del tendón rotulista para eliminar la unidad del tendón muscular del cuádriceps. A continuación, a partir del extremo proximal del fémur, coloque la hoja del bisturí entre la unidad del tendón muscular isquiotibial y el lado posterior del eje femoral y corte a lo largo del hueso en la dirección distal.

Cuando la incisión se acerque a la articulación de la rodilla, corte el tejido blando y termine el corte más allá de la articulación de la rodilla. Tire hacia atrás los cuádriceps y los músculos isquiotibiales para exponer el fémur. Y cortar cualquier exceso de músculo en los lados lateral y medial del hueso.

Corte el músculo de la pantorrilla en el lado posterior de la tibia proximal. Y voltea la pierna para visualizar el lado posterior del fémur. Retire el exceso de tejido alrededor de la articulación de la rodilla para exponer los cónciles distales del fémur y la superficie posterior de la tibia proximal.

Corte los ligamentos cruzados anteriores y posteriores lejos de los cónciles femorales. Y tire de la tibia del fémur, cortando todos los ligamentos para separar la pierna inferior del fémur. Usando tijeras de disección estándar, corte a través del fémur en el extremo proximal del hueso unos ocho milímetros por encima de la articulación tibiofemoral desde el lado lateral.

Y usa los fórceps del joyero para eliminar los tejidos blandos circundantes del fémur. Luego exponga el cartílago en ambos cónciles en el extremo distal del fémur. Hidratar periódicamente la superficie articular con HBSS.

Para la disección del húmero, coloque el ratón en la posición supina. Y usa micro tijeras para hacer una incisión de cinco milímetros en el lado posterior del codo. Extender la incisión alrededor del codo y tirar hacia atrás de la piel para exponer los músculos del brazo y el hombro.

A partir del extremo proximal del húmero, coloque la hoja de un bisturí número once entre la unidad del tendón muscular del tríceps y el lado posterior del húmero. Y cortar a lo largo del hueso en la dirección distal. Extiende la incisión hacia el extremo distal del húmero, a través del tendón del tríceps y tira hacia atrás los tríceps hacia el extremo proximal del húmero hasta que la cabeza del húmero esté expuesta.

Corte el tejido conectivo alrededor de la cabeza del húmero sin tocar la superficie articular. Y quita la extremidad del cuerpo. Hidratar la superficie articular de la cabeza humeral con HBSS.

Para desconectar el húmero del brazo, utilice fórceps para romper el extremo proximal del cúbito en el lado posterior del brazo. Y corta el tejido conectivo alrededor del extremo distal del húmero, eliminando cualquier exceso de tejido en el hueso. A continuación, utilice tijeras disección estándar para eliminar la tuberosidad deltoides en el lado posterior del húmero.

Y coloque la muestra diseccionada en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga HBSS. Para la tinción de Calcein AM de las muestras, transfiera los huesos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de 10,05 micro molares de Calcein en HBSS. Y coloque el tubo en un mezclador térmico a 37 grados Celsius a 800 rpm, protegido de la luz.

Después de treinta minutos, lave el espécimen en HBSS fresco durante diez minutos. Y transfiera la muestra a la diapositiva de vidrio de un dispositivo de prueba mecánica montado en un microscopio personalizado, de modo que la superficie articular de los cónciles femorales posteriores o la cabeza del húmero esté sentada en el vidrio. Hidratar la muestra con HBSS y colocar el dispositivo con la muestra en una etapa del microscopio de fluorescencia.

Imagen de los condrocitos articulares manchados con Calcein AM antes de la aplicación de carga bajo un aumento de 4x. Ajuste la configuración de adquisición para optimizar la calidad de la imagen. Para aplicar la carga mecánica estática, sostenga una carga estática prescrita en la parte superior de la muestra de forma que el cartílago articular se comprima contra el cristal de la cubierta durante cinco minutos antes de retirar la carga.

Para aplicar una carga mecánica de impacto, suelte un impactador cilíndrico de peso conocido sobre la muestra desde una altura prescrita, liberando la carga cinco segundos después del impacto. Inmediatamente después de que se haya eliminado cualquiera de las cargas, incubar el espécimen en yoduro de propridio micro molar 60 recién preparado en un mililitro de HBSS. Durante cinco minutos a temperatura ambiente, vuelva a examinar los condrocitos articulares por microscopía de fluorescencia como se acaba de demostrar.

Para cuantificar el área de células lesionadas y muertas debido al régimen de carga mecánica aplicado, abra primero los micrografías de la superficie articular adquiridas antes y después de la aplicación de la carga mecánica en ImageJ. Combine las imágenes en una pila. Establezca la escala de las imágenes en función de la resolución de la imagen.

A continuación, defina el área donde las células se convirtieron en Calcein negativo y PI positivo. Estas células se consideran heridas o muertas. A continuación, determine el área de las células muertas lesionadas utilizando la herramienta de medición.

Al menos seis probados aplicaron los protocolos de carga inducidos de forma reproducible áreas localizadas cuantificables de lesión celular en cartílagos femorales y humerales obtenidos de ratones de válvula C de ocho a diez semanas de edad. En todos los protocolos de carga probados, las magnitudes de carga más altas y las intensidades de impacto más altas exacerbaron significativamente la extensión espacial de la lesión celular tanto en fémures como en humeri. Al realizar las disecciones es importante recordar no ponerse en contacto con el cartílago articular con las herramientas quirúrgicas, ya que esto puede comprometer la línea de base por la capacidad de las muestras.

El uso de este modelo de espejado puede facilitar la investigación en osteoartritis, ya que la enfermedad se induce fácilmente en ratones a través de manipulaciones genéticas, dietéticas o quirúrgicas. Nuestra plataforma también proporciona una herramienta para interrogar cuestiones científicas básicas y para detectar intervenciones terapéuticas dirigidas a la vulnerabilidad mecánica de los condrocitos.