Name: Un ensayo de amplificación isotérmica (lámpara) mediada por el lazo para identificación rápida de Bemisia tabaci (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Aprende a identificar rápidamente Bemisia tabaci mediante el ensayo LAMP de amplificación isotérmica mediada por el lazo. Este método permite diagnósticos precisos en puntos de entrada de importaciones vegetales.

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Los autores agradecemos a Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia Studer, Daniel Frei, Elisabeth Razavi, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun y Sven Moeller para participar en la validación de la prueba de la lámpara de B. tabaci .

1. preparaciones
<ol><li>Preparación de alícuotas de solución alcalina de extracción de ADN.<ol>
<li>Producir un stock de solución alcalina de la extracción de ADN usando agua de grado molecular suplementado con 600 μm de hidróxido de potasio (KOH) y 2 μm rojo de Cresol. PRECAUCIÓN: El KOH es una base fuerte disuelta en agua. Evitar derrames y piel y contacto con los ojos.</li>
		<li>Dispensar 30 μl de solución alcalina de la extracción de ADN (preparado en el paso 1.1.1) en tubos de microcentrífuga de 0, 5 mL y almacenar las alícuotas a 4 º C. Nota: Use la solución de extracción alícuotas de ADN dentro de 1 año.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar el control positivo de amplificación de B. tabaci (PAC).<ol>
<li>Generar amplicones de PCR del fragmento de ADN del objetivo lámpara. Nota: Una introducción a los principios generales de la polimerización en cadena y las prácticas se da por Lorenz23.<ol>
<li>Sintetizar u obtener las cartillas C1-J-2195 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3') y TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3 ') amplificando un fragmento de la mitocondrial COI gen24,25.</li>
			<li>Configurar la reacción de PCR como se describe en la tabla 1. Uso de extracto de ADN (véase el paso 2.1) de una muestra de referencia de B. tabaci como plantilla de la DNA. Nota: Opcionalmente, es posible extraer la B. tabaci ADN para la PAC mediante un kit comercial según las instrucciones del fabricante.</li>
			<li>Programa un termociclador con las siguientes condiciones: 15 min a 95 ° C; 45 ciclos de 40 s a 95 ° C, 15 s a 45 ° C, mayores de 60 años en rampa s a 60 ° C, 2 min a 72 ° C; 7 minutos a 72 ° C; mantener a 4 ° C.</li>
			<li>Limpie el producto de amplificación de PCR utilizando un kit comercial de limpieza PCR según protocolo del fabricante y eluir el producto final en agua de grado molecular.</li>
			<li>Utilizar un kit comercial con colorantes intercalantes de ADN para medir la concentración de ADN del producto de amplificación de PCR según las instrucciones del fabricante y diluir con agua grado molecular a una concentración de 1 ng / μl. tienda la amplificación de PCR diluida producto como solución PAC a-20 ° C. Nota: Use la solución PAC dentro de 1 año.</li>
			<li>Complementar la solución madre de PAC (preparada en el paso 1.2.1.5) con 0,6 μm KOH y diluir con agua grado molecular a una concentración de 5 x 10-3 ng / μl. almacenar el producto a 4 ° C. Nota: Utilice la PAC dentro de 5 h para la preparación de la lista para usar B. tabaci lámpara kits se describen en el siguiente paso.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación lista para usar kit de lámpara de B. tabaci (Protocolo para 20 unidades)
	<ol>
<li>Uso de tijeras para cortar tiras de 8 tubos lámpara en dos tiras de la lámpara 4 tubos.</li>
		<li>Etiquetar los tubos de las tiras de la lámpara 4 tubos según el esquema mostrado en la figura 1.</li>
		<li>Preparación de B. tabaci lámpara reacción mastermix (Protocolo para las reacciones de 80).<ol>
<li>Añadir μl 1195.1 listo para su uso GspSSD isotermo master Mix (contiene GspSSD polimerasa, pirofosfatasas, sulfato de magnesio, Deoxynucleótidos, por tinte de filamento doble enlace ADN vinculante) y 717.4 μL de mezcla de primer lámpara de B. tabaci 2 ml tubo de microcentrífuga. Centrifugar brevemente vortex y pulso.</li>
			<li>Dispense 22.5 μl del mastermix de reacción lámpara de B. tabaci (preparado en el paso 1.3.3.1) en cada tubo de las tiras de la lámpara 4 tubos (preparado en paso 1.3.1) y centrifugadora de pulso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vórtice de la B. tabaci lámpara PAC (preparado en el paso 1.2) rápidamente y pulso de centrífuga. Luego, añadir 2,5 μL en el tubo marcado con "PAC" de cada tira de la lámpara 4 tubos (figura 1).</li>
		<li>Tapas de cierre y tienda la lista para usar B. tabaci lámpara kit de unidades a-20 ° C. Nota: Utilizarlos de 1 año.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Análisis de la lámpara en el sitio
<ol><li>Extracción de ADN<ol>
<li>Utilizar mondadientes estériles para transferir a las muestras de insectos en tubos de microcentrífuga de 0, 5 mL conteniendo 30 μl de solución de extracción de ADN (preparado en el paso 1.1.2). Nota: Asegúrese de que los insectos se sumergen en la solución de extracción.</li>
		<li>Incubar las muestras durante 5 min a 95 ° C en un Termomezcladores (300 rpm). Centrifugar brevemente vortex y pulso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensayo de lámpara de B. tabaci<ol>
<li>Kit de deshielo una lista para usar lámpara de B. tabaci preparado en el paso 1.3. Vórtice rápidamente y centrífuga de pulso. Nota: Cada kit, es sea posible probar a dos muestras diferentes o para analizar el extracto de ADN de una muestra por duplicado.</li>
		<li>Añadir 2,5 μl del extracto de la DNA de la muestra (preparado en el paso 2.1) en los tubos rotulados "S1" y "S2" de la lista para usar kit de lámpara de B. tabaci (figura 1).</li>
		<li>Añadir 2,5 μl de puro ADN extracción solución alcalina (preparado en el punto 1.1) en el tubo con la etiqueta "NAC" para el control de amplificación negativa (figura 1).</li>
		<li>Mezclar la lista para usar lámpara de B. tabaci kit rápidamente y centrífuga del pulso.</li>
		<li>Insertar lista-para-usar B. tabaci kits en el dispositivo de análisis de la lámpara (con medición de fluorescencia a tiempo real) o una plataforma PCR en tiempo real y realizar un análisis de amplificación de ADN isotérmico a 65 ° C durante 60 minutos.</li>
		<li>Medir la temperatura de fusión de productos de amplificación de DNA por calentamiento hasta 98 ° C con un posterior enfriamiento paso (tasa de rampa de 0,05 ° C/s) a 75 ° C, durante la medición de la fluorescencia en tiempo real.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lectura del ensayo de lámpara<ol>
<li>Validar manualmente como sigue el lectura de lámpara.<ol>
<li>Si se midieron amplificaciones de ADN de la muestra y el PAC, ninguna amplificación de la DNA se midió para el NAC, y la temperatura de recocido de los productos de amplificación fueron entre 85,5 y 80.0 ° C, considere los resultados de la lámpara como positivo (figura 2).</li>
			<li>Si no hay ninguna amplificación del ADN de las muestras (es decir, los tubos etiquetados S1 y S2) pero para PAC y NAC entonces consideran el resultado de la lámpara como negativo (figura 2).</li>
			<li>Si la amplificación de la DNA fue medida para las muestras, pero las temperaturas de recocido de los correspondientes productos de amplificación fueron fuera de la gama 80.0 \u2012 85,5 ° C, PAC no dio ninguna amplificación de la DNA, o NAC dio una amplificación de la DNA, considerar el resultado de la lámpara que NO válido (figura 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Opcionalmente, validar la lectura de la lámpara mediante la aplicación de validación de la lámpara (archivo adicional 1).<ol>
<li>Definir especies objetivo y definir el número de las muestras. Haga clic en el botón "generar informe" .</li>
			<li>Transferencia de la lectura (amplificación de la DNA sí/no, recocido del producto de amplificación temperatura, resultados de PAC y NAC) desde el dispositivo de análisis de la lámpara en el sitio o plataforma PCR en tiempo real a los campos de entrada correspondientes de la solicitud de validación. El resultado de la validación se muestra inmediatamente después de introducir los datos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bemisia+tabaci%3A+a+statement+of+species+status%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li>
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<li>Cuthbertson, A. G. S., Vänninen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+maintaining+protected+zone+status+against+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci.</a> Insects. 6 (2), 432-441 (2015).</li>
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</ol>

El autor Michael Andreou es accionista de OptiGene limitada que produce reactivos y los instrumentos utilizados en este artículo. Otros autores no tienen nada que revelar.

La capacidad para identificar con precisión los organismos potencialmente nocivos sin retraso de tiempo representa un aspecto crítico para el manejo de plagas especies9,10,26. Además de ser rápida, para productos de importación de vegetales, un método de identificación de plagas ideal debe ser fácil de realizar in situ POEs8,26. Este papel divulga el protocolo de un análisis nuevo de la lámpara para la identificación rápida de B. tabaci, un organismo de cuarentena insectos frecuentemente interceptado en las fronteras europeas (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt _annual Informe _2016.pdf).
La lógica detrás del desarrollo de la prueba de diagnóstico fue diseñar un protocolo fácil de seguir que se puede realizar durante el procedimiento de control de importación de plantas por los inspectores de salud de planta con formación de laboratorio mínimo. Para hacer en el sitio de prueba rápida y simple como sea posible, el protocolo se divide en dos partes, la preparación de un kit listo para su uso y el rendimiento real de la prueba de la lámpara. La primera parte puede hacerse en un laboratorio externo para que el inspector de salud de la planta pueda realizar la extracción de ADN y análisis de la lámpara en el sitio con tan sólo un paso de pipeteo.
Aunque tan sólo un paso, pipetas pequeñas cantidades de líquido pueden ser un reto para los usuarios con poca o ninguna experiencia de laboratorio. Para solucionar este problema, un colorante (rojo de cresol) se agrega a la solución de extracción para que el operador puede confirmar visualmente que la pequeña cantidad (es decir, 2,5 μl) de la DNA se transfiere correctamente al tubo correspondiente. Otra simplificación importante del protocolo es la aplicación de validación como facilita una interpretación fiable de la lectura de la lámpara (archivo adicional 1).
La novela ensayo de lámpara de B. tabaci ha sido validada bajo condiciones in situ y de laboratorio por la prueba insecto muestras interceptadas durante el proceso de control de la importación regular de Suiza8. En total, se analizaron 80 muestras de tres continentes, África, Eurasia y América del norte, por lámpara. De las 80 muestras, sólo tres (3,8%) fueron erróneamente identificados (falsos negativos)8. Al analizar las secuencias de ADN primer objetivo de los especímenes de falsos negativos, se encontró que eran nuevos haplotipos B. tabaci que hasta ahora no se han descrito8. Basado en estos resultados, el conjunto del primer lámpara de B. tabaci ha sido modificado y validado con éxito volver a8.
Una limitación importante de cualquier método basado en la amplificación de ADN incluyendo lámpara es que sólo identificar al destino predefinido DNA secuencias8,27. Un amplio conocimiento de la variación genética en la secuencia de destino de la cartilla, por tanto, es crucial asegurar exactitud diagnóstica8,27. Sin embargo, esa información suele ser muy limitada, especialmente en el caso de plagas especies8emergentes. Aunque rara, causados por mutaciones en la secuencia de destino los resultados falsos negativos son esperados8. En el caso del presente ensayo lámpara de B. tabaci , una solución para este problema es la combinación con una tecnología basada en código de barras del ADN, una estrategia realizada en el curso de la aplicación de esta prueba diagnóstica en el aeropuerto de Zurich POE8. Aquí, todos los resultados negativos de la lámpara vuelve a se analizaron por código de barras de ADN en un laboratorio externo8. En caso de que se encuentra un haplotipo de plagas nuevas aún no descrito, los iniciadores de la lámpara pueden modificarse utilizando la secuencia de ADN generada en el proceso de código de barras8. Por lo tanto, la consiguiente pérdida de velocidad en caso de un resultado negativo de la lámpara se compensa la exactitud diagnóstica máxima asegurada en este proceso de dos etapas8.
Los costos de preparación para el análisis actual de la lámpara en un POE son aproximadamente USD 25.000. Con el creciente número de lámpara pruebas desarrolladas para las plagas de la planta (p. ej., Erwinia amylovora, flavescencia dorada y Guignardia citricarpa), una inversión tan una sola vez aparece justificada13,15, 28. sin embargo, el protocolo podría potencialmente modificarse para reducir estos costes aún más. Por ejemplo, para la extracción de ADN paso a 95 ° C el termo batidora usada aquí podría sustituirse por un baño de agua menos costoso, o mediante la realización de este paso directamente en el dispositivo de la lámpara de tiempo real. Además, los pasos mezclar en el vortex probablemente podrían ser reemplazados por manualmente, agitando los tubos, y en el paso de transferencia de ADN, la pipeta puede sustituirse por loops de inoculación estéril.
Futuras mejoras para una identificación rápida de especies B. tabaci y plagas en general podrían ser una aplicación de un enfoque de secuencia in situ que permita para realizar análisis de código de barras de ADN en el POEs. Un sistema candidato prometedor para una implementación es la tecnología de secuenciación nanopore. De hecho, la tecnología recientemente se ha implementado con éxito en un esfuerzo de código de barras de DNA in situ para evaluar la biodiversidad de un bosque tropical8,29,30. Un sistema de identificación de código de barras de ADN in situ puede sustituir completamente la necesidad para el desarrollo de pruebas de diagnóstico específicas y su validación. También permite recoger información adicional sobre las características de la plaga como de genes de resistencia a plaguicidas8. Sin embargo, hasta que rutinariamente se implementarán tecnologías de secuenciación de novela, el ensayo B. tabaci lámpara representa un rápido (< 1 h) y el método de identificación exacta.

La mosca blanca Bemisia tabaci (Gennadius) es una plaga de insectos invasiva que afectan el rendimiento de muchos cultivos económicamente importantes como plantas ornamentales, hortalizas, leguminosas de grano y algodón1,2. Al lado de daños causados a través de la alimentación directa de líber, la especie homopteran daña plantas indirectamente por la excreción de grandes cantidades de melaza en las superficies de hojas y frutos, así como por la transmisión de numerosos virus patógenos de plantas1 , 3 , 4. los estudios genéticos recientes comparando secuencias de ADN de lo genes mitocondriales citocromo c oxidasa 1 (COI) revelaron que B. tabaci es una especie de complejo de por lo menos 34 especies de morphocryptic3,4. Dos miembros altamente invasivos y dañinos dentro de este complejo, biotipo B procedentes de Oriente Medio y la región de Asia menor, así como biotipo Q originario de la región mediterránea, han sido dispersados globalmente a través de comercio internacional actividades con productos vegetales, particularmente por el transporte de plantas ornamentales1,5,6. Debido a su estatus de plagas en todo el mundo, la Unión Internacional para la conservación de la naturaleza y recursos naturales (UICN) lista de B. tabaci como uno de los "100 del mundo peores especies exóticas invasoras" y miembros de la especie compleja son organismos regulados por muchos países1,3,4.
En la Unión Europea (UE), de B. tabaci se enumera en el 1AI planta salud Directiva 2000/29/CE anexo como un organismo de cuarentena, cuya introducción desde terceros países y su difusión dentro de la UE están prohibidos4. Una medida de prevención fundamental contra la propagación de organismos de cuarentena es la inspección de embarques de la planta en los puntos de entrada (GdE) tales como aeropuertos y puertos marítimos de7,8. En el caso se encuentra un organismo de cuarentena, la organización nacional de protección de planta (ONPF) a cargo toma acción rechazando o tratamiento (incluyendo la destrucción) de los infestados envío9. Sin embargo, oficiales de inspección de las importaciones a menudo no tienen la pericia taxonómica para identificar con precisión la amplia gama de especies de plagas asociadas con el comercio mundial9. Especialmente la identificación de las etapas de la vida inmaduros (p. ej., huevos y larvas) sin claves morfológicas distintas es prácticamente imposible que los taxónomos no8,9,10. Por lo tanto, para habilitar la aplicación de medidas de cuarentena con un retraso mínimo, es necesario para ensayos de identificación en el sitio alternativo, rápido9.
Un método de candidato es el loop-mediated isotermo ADN (lámpara) tecnología de amplificación que recientemente se ha demostrado ser una tecnología adecuada para la identificación de patógenos de plantas11,12,13. LÁMPARA es altamente específica debido a que el método utiliza al menos dos pares de primer reconocimiento seis distintos ADN objetivo secuencias14. Debido a la actividad del desplazamiento de hebra ADN de polimerasa de la DNA de Bst , reacciones de la lámpara se realizan bajo condiciones isotérmicas14. Por lo tanto, en contraste con la reacción en cadena de polimerasa convencional (polimerización en cadena)-análisis basados allí es no hay necesidad de un termociclador13,14. Otra ventaja sobre los ensayos de PCR es su resistencia contra posibles inhibidores en el extracto de ADN, eludir la necesidad de un paso de purificación de ADN13. Debido a la velocidad y la simplicidad del Protocolo, la lámpara puede realizarse incluso bajo condiciones in situ utilizando un portátil, batería impulsada por dispositivos de detección en tiempo real8,15.
Un análisis de la lámpara fue diseñado en respuesta a la demanda de un método rápido de identificación in situ para B. tabaci8. El objetivo general fue desarrollar un protocolo que puede ser realizado por inspectores de salud de planta con formación de laboratorio limitada. Un fuerte enfoque, por lo tanto, nace en la optimización de velocidad y la simplicidad del protocolo. Mientras que las pruebas de diagnóstico existentes generalmente han sido desarrolladas para la identificación de uno o varios biotipos de B. tabaci, el nuevo ensayo de lámpara cubre el conjunto de B. tabaci especies complejas8,16,17 ,18. El problema de la diversidad genética pronunciadas dentro de taxonomía del complejo fue solucionado mediante el uso de combinaciones de primer diferentes conjuntos y la aplicación de primers degenerados8. La novela ensayo de lámpara de B. tabaci está diseñada de tal manera que los cebadores dirigidos un fragmento en el extremo 3' del COI gene mitocondrial8. Este gen presenta un objetivo adecuado para ensayos de diagnóstico animal porque alberga regiones conserva lo suficiente para asegurar la sensibilidad diagnóstica para una especie específica, mientras que discriminar suficientemente entre relacionada con organismos19, 20. Además, el gen COI a menudo se utiliza como un marcador genético en estudios genéticos de la población y como una secuencia de la firma de análisis de código de barras de ADN, resultando en numerosas entradas de secuencia de ADN en bases de datos de código abierto como GenBank y negrita21 ,22. Al lado de las secuencias COI públicamente disponibles de B. tabaci, secuencias de COI de especies estrechamente relacionadas (Aleurocanthus spp [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, Bemisia spp [N = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciaey Trialeurodes spp. [N = 4]) fueron incluidos en el primer diseño de este estudio y utilizados para evaluar el diagnóstico sensibilidad y especificidad en silico8 .
Debido a la precisión del método, su velocidad (< 1 h) y la simplicidad del Protocolo, el ensayo ha demostrado ser adecuado para la aplicación in situ cuando se implementa como parte del procedimiento de control de importación en un POE suizo8.

<table><tbody><tr><td>B. tabaci Mezcla de imprimación LAMP</td><td>OptiGene Ltd.</td><td>bajo pedido</td><td>Para la preparación de lectura para usar B. tabaci LAMP kit</td></tr><tr><td>Centrífuga MiniSpin</td><td>Eppendorf AG</td><td>5452000010</td><td>Para varias etapas de centrifugación</td></tr><tr><td>Cresol rojo (tinte rojo)</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>114472</td><td>Componente de solución de extracción de ADN</td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer</td><td>Eppendorf AG 5382000015</td><td></td><td>Para la extracción de ADN</td></tr><tr><td>Genie II (dispositivo de análisis LAMP in situ)</td><td>OptiGene Ltd.</td><td>Genio&reg; II</td><td>Para el análisis de LAMP</td></tr><tr><td>Tiras Genie (tiras LAMP de 8 tubos)</td><td>OptiGene Ltd.</td><td>OP-0008-50</td><td>Para la preparación de lectura para usar B. tabaci LAMP</td></tr><tr><td>kit HotStarTaq Master Mix</td><td>Qiagen AG</td><td>203443</td><td>Para la generación de control de amplificación positivo </td></tr><tr><td>Labcycler (Thermocycler)</td><td>SensoQuest GmbH, distribuido por Witec AG</td><td>011-103</td><td>Para la extracción de ADN</td></tr><tr><td>GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix</td><td>OptiGene Ltd.</td><td>ISO-001LNL</td><td>Para la preparación de lectura para usar B. tabaci LAMP</td></tr><tr><td>kit Mini centrífuga Labnet Prisma</td><td>Labnet International Inc.</td><td>C1801</td><td>Para varios pasos de centrifugación</td></tr><tr><td>NucleoFast 96 PCR</td><td>Marcherey-Nagel GmbH</td><td>743500.4</td><td>Para la limpieza de control de amplificación positivo </td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de potasio</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>319376</td><td>Componente de solución de extracción de ADN</td></tr><tr><td>Qbit Fluorometer 3</td><td>Thermo Fisher Scientific Corp.</td><td>Q33226</td><td>Para medir la concentración de ADN de control positivo</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td>Para la limpieza del control de amplificación positivo</td></tr><tr><td>Tubos Safe-Lock 0,5 mL (tubo de microcentrífuga)</td><td>Eppendorf AG</td><td>0030 121.023</td><td>Para</td></tr> extracción <tr><td>de ADN Tubos Safe-Lock 2,0 mL (tubo de microcentrífuga)</td><td>Eppendorf AG</td><td>0030 120.094</td><td>Para la preparación de kit de lámpara B. tabaci de lectura para</td></tr><tr><td>usar Palillos de dientes de madera</td><td>VWR International LLC</td><td>470226-594</td><td>Para la extracción de ADN</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 (Vortex)</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-0236</td><td>Para varios pasos de mezcla</td></tr></tbody></table>

un ensayo de amplificación isotérmica (lámpara) mediada por el lazo para identificación rápida de bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

La mosca blanca Bemisia tabaci (Gennadius) es una plaga invasora de considerable importancia, que afectan a la producción de cultivos hortícolas y ornamentales en muchos países alrededor del mundo. Pérdidas de rendimiento graves son causadas por alimentación directa y aún más importante, también por la transmisión de más de 100 virus patógenos nocivos. En cuanto a otras plagas invasivas, el aumento del comercio internacional facilita la dispersión de B. tabaci a áreas más allá de su gama nativa. Inspecciones de planta importación productos en los puntos de entrada como los puertos marítimos y aeropuertos, por lo tanto, ven como una medida de prevención importante. Sin embargo, esta última línea de defensa contra las invasiones de plagas sólo es efectiva si los métodos de identificación rápida para las muestras de insectos sospechosos están disponibles. Porque es difícil no taxonomistas, un ensayo de rápida identificación molecular basado en la amplificación isotérmica mediada por el lazo (la diferenciación morfológica entre los regulados de B. tabaci y parientes cercanos sin estado de cuarentena Se ha desarrollado la tecnología de la lámpara). Esta publicación informa el protocolo detallado de la extracción de DNA rápida que describe análisis nuevo, puesta en marcha de la reacción de la lámpara, así como la interpretación de su lectura, que permite identificar especímenes B. tabaci dentro de una hora. En comparación con los protocolos existentes para la detección de la específicas B. tabaci biotipos, el método desarrollado apunta a todo el complejo en un ensayo de especies B. tabaci . Por otra parte el ensayo está diseñado para aplicarse en el sitio por los inspectores de salud de la planta con formación mínima de laboratorio directamente en puntos de entrada. Validación completa realizada bajo condiciones in situ y laboratorio demuestra que el ensayo informó de lámpara es una herramienta de identificación rápida y confiable, mejorar la gestión de de B. tabaci.

Durante la validación de la prueba de la lámpara de B. tabaci , insectos muestras interceptadas durante el proceso de control de importación Suiza regular fueron analizados8. Los especímenes se originaron de ocho países diferentes (Islas Canarias, República Dominicana, Israel, Malasia, Marruecos, Singapur, Tailandia y Vietnam) y reflejan la diversidad genética de B. tabaci en POEs europeo8. Todos los resultados de la lámpara eran Cruz-validado por código de barras de ADN8.
De un total de 80 muestras analizadas por lámpara, 75 ejemplares (93,8%) fueron correctamente identificados como B. tabaci (verdaderos positivos), dos ejemplares (2,5%) fueron identificados correctamente como no B. tabaci (verdaderos negativos) y tres especímenes (3.8%) se identificaron erróneamente que no son de B. tabaci (falsos negativos) (tabla 2)8. Los resultados negativos corregir originados de dos especímenes de Trialeurodes vaporariorum , una especie no reguladas en alto riesgo de ser confundido con B. tabaci en garitas de planta productos8. Basado en estos resultados, se calcularon las siguientes medidas de precisión diagnóstica: prueba de especificidad (tasa de verdaderos negativos), 100%; prueba de sensibilidad (true-positive rate), 96.2%; Test de eficiencia (porcentaje de resultados de la prueba correcta), 96.3% (tabla 2)8. Cuando se evalúa la sensibilidad analítica (límite de detección), el ensayo B. tabaci lámpara con éxito amplificó la DNA de la muestra diluida a 100 fg/μl a través de tres repeticiones técnicas (tabla 3).
Un subconjunto de los ensayos (N = 13) se realizaron bajo condiciones in situ en el aeropuerto de Zurich Suiza POE por inspectores de salud de la planta utilizando la lista para usar lámpara de B. tabaci kits8. Cuando Cruz-validado en el laboratorio de referencia, todos los resultados de la prueba en el sitio fueron encontrados para ser correcto (test de eficiencia = 100%)8. Evaluación del rendimiento de análisis in situ de la lámpara, el tiempo promedio (tiempo hasta que un resultado positivo era disponible), positivo fue 38,4 ± 10,3 min (media ± desviación estándar)8. Una parcela de amplificación de ADN representativa y el correspondiente derivado recocido de un análisis B. tabaci lámpara realizado bajo condiciones in situ se muestran en la Figura 3A y B. En este ejemplo, muestra uno y dos fueron identificados correctamente como B. tabaci indicado por amplificación del ADN después de aproximadamente 30 min (Figura 3A) junto con las temperaturas de recocido esperadas en aproximadamente 82 ° C (figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58502/58502fig1.jpg"> Figura 1: visualización de la configuración experimental de una lista para usar kit de lámpara de B. tabaci se describe en el protocolo de. S1, muestra 1; S2, muestra 2; PAC, el control positivo de amplificación; NAC, control de amplificación negativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58502/58502fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58502/58502fig2.jpg"> Figura 2: esquema de validación lámpara lectura. PAC: control amplificación positiva; NAC: control de amplificación negativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58502/58502fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58502/58502fig3.jpg"> Figura 3: derivado de parcela (A) y recocido de amplificación DNA (B) de un análisis de la lámpara de B. tabaci se realizaron bajo condiciones in situ. La fluorescencia se mide en unidades de intensidad relativa. Línea verde, muestra 1; línea naranja, muestra 2; línea azul, control de amplificación negativa (NAC); línea roja, control de amplificación positiva (PAC). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58502/58502fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Stock Conc.</td>
			<td>Reacción final Conc.</td>
			<td>Volumen por reacción</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq polimerasa Master Mix</td>
			<td>2 x</td>
			<td>1 x</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer C1-J-2195</td>
			<td>20 ΜM</td>
			<td>0.4 ΜM</td>
			<td>0.4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer TL2-N-3014</td>
			<td>20 ΜM</td>
			<td>0.4 ΜM</td>
			<td>0.4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua grado molecular</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>8,2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plantilla de la DNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: preparación del mastermix de reacción de PCR para la B. tabaci control de amplificación positiva. Componentes y concentraciones necesarias para establecer una reacción de PCR. El volumen de reacción final es 20 μl. secuencias de la cartilla se presentan en 1.2.1.1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>N</td>
			<td>NTP</td>
			<td>NFP</td>
			<td>NTN</td>
			<td>NFN</td>
			<td>SEN (%)</td>
			<td>SPE (%)</td>
			<td>
EFF (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>80</td>
			<td>75</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>96.2</td>
			<td>100</td>
			<td>96.3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Resultados de la B. tabaci Validación de ensayo lámpara. N, número de análisis; NTP, número de resultados verdaderos positivos; NFP, número de resultados falsos positivos; NTN, número de negativos verdaderos resultados; NFN, número de resultados falsos negativos; SEN, sensibilidad diagnóstica; SPE, especificidad, EFF, prueba de eficiencia.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
CADN (fg/μL)</td>
			<td>NPR</td>
			<td>
TP (min) (media ± SD)</td>
			<td>
TA (° C) (media ± SD)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x 105
</td>
			<td>3</td>
			<td>33.5 ± 2.9</td>
			<td>81,3 ± 0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x 104
</td>
			<td>3</td>
			<td>30,7 ± 1.1</td>
			<td>81 ± 0.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x 103
</td>
			<td>3</td>
			<td>40.4 ± 3.9</td>
			<td>81,1 ± 0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x 102
</td>
			<td>3</td>
			<td>50,7 ± 1.6</td>
			<td>±0. 1 81.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x 101
</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x 100
</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: sensibilidad analítica (límite de detección) de la B. tabaci ensayo lámpara. Cada dilución se analizó por triplicado. CADN, concentración de DNA por reacción; NPR, número positivo Replica; TP, hasta que un resultado positivo estaba disponible; TA, recocido temperatura; SD, desviación estándar.

Este papel divulga el protocolo para un ensayo de identificación rápida para Bemisia tabaci basado en tecnología de amplificación isotérmica mediada lazo (lámpara). El protocolo requiere laboratorio mínimo entrenamiento y puede, por tanto, aplicarse in situ en los puntos de entrada para las importaciones de planta como los puertos marítimos y aeropuertos.

Un ensayo de amplificación isotérmica (lámpara) mediada por el lazo para identificación rápida de Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Este método proporciona una herramienta de diagnóstico rápida y fiable para la identificación de Bemisia tabaci, una plaga de insectos invasora que afecta a la producción de hortalizas y cultivos ornamentales en muchos países del mundo. Debido a su facilidad, el método se puede realizar in situ directamente en los puntos de entrada de los productos de importación de plantas, como puertos y aeropuertos, y por lo tanto tiene el potencial de reducir la dispersión de Bemisia tabaci a lo largo de las redes comerciales. Para comenzar, utilice tijeras para cortar una tira LAMP de ocho tubos en dos tiras LAMP de cuatro tubos.A continuación, etiquete los tubos de acuerdo con el esquema descrito en la figura uno del protocolo de texto. Después de esto, prepare suficiente mezcla maestra de reacción B.tabaci LAMP para 80 reacciones. A continuación, dispensar 22,5 microlitros de la mezcla maestra en cada uno de los tubos de las tiras LAMP de cuatro tubos.Centrífuga de pulso, y ponlos en hielo. Rápidamente vórtice y centrífuga de pulso B.tabaci LAMP PAC. A continuación, agregue 2,5 microlitros en el tubo etiquetado PAC en cada una de las tiras LAMP de cuatro tubos.A continuación, cierre las tapas y guarde las unidades del kit B.tabaci LAMP listas para usar a menos 20 grados centígrados. Para comenzar la extracción de ADN, utilice palillos de dientes estériles para transferir los especímenes de insectos a tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitros con 30 microlitros de solución de extracción de ADN. Luego, incubar las muestras durante cinco minutos a 95 grados Celsius en un ThermoMixer establecido en 300 rpm.Brevemente vórtice y centrifugar pulso las muestras. Descongele uno de los kits B.tabaci LAMP listos para usar. A continuación, vórtice el kit rápidamente, y el pulso lo centrifuga.Añadir 2,5 microlitros de extracto de ADN de muestra a los tubos S-uno y S-dos. A continuación, agregue 2,5 microlitros de solución de extracción de ADN alcalino puro al tubo NAC. Después de la centrifugación de pulsos y vórtices del kit, inserte el kit en un dispositivo de análisis LAMP y realice análisis de amplificación de ADN isotérmico a 65 grados centígrados durante 60 minutos.En la misma carrera, realice un análisis de temperatura de fusión de los productos de amplificación de ADN calentando primero el kit a 98 grados Centígrados y enfriándolo a 75 grados centígrados. Valide la lectura LAMP mediante la aplicación de validación LAMP automatizada. En primer lugar, defina la especie objetivo y el número de muestras probadas antes de hacer clic en el botón Generar informe.Por último, transfiera la lectura a los campos de entrada adecuados de la aplicación de validación. Inmediatamente después de introducir los datos, se mostrará el resultado de la validación. En este protocolo, los especímenes de insectos B.tabaci interceptados en el curso del proceso regular de control de importaciones suizos fueron analizados a través del ensayo LAMP.De un total de 80 especímenes analizados, 75 especímenes fueron identificados correctamente como verdaderos positivos, y dos especímenes fueron identificados correctamente como verdaderos negativos. Tres especímenes, sin embargo, eran falsos negativos y fueron identificados incorrectamente como no ser B.tabaci. Un subconjunto de los ensayos fue realizado in situ por inspectores de salud vegetal en el aeropuerto de Zúrich.En los resultados representativos, las muestras uno y dos se identificaron correctamente como B.tabaci a través de la amplificación del ADN después de aproximadamente 30 minutos en la temperatura de recocido prevista de aproximadamente 82 grados centígrados. Después de su desarrollo, este método allanó el camino para una identificación rápida y fácil de realizar in situ de Bemisia tabaci. El protocolo está diseñado de tal manera que puede ser realizado por inspectores de salud vegetal con formación limitada en laboratorio.Después de la validación in situ exitosa del método en un punto de entrada suizo para los productos de importación de plantas, el método podría adaptarse a otros patógenos vegetales, pero también, si fuera necesario, a otros patógenos humanos o veterinarios.

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Investigación

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Fuente: Domesle, K. J., et al. Amplificación isotérmica mediada por lazos para el cribado de Salmonella en alimentos de origen animal y la confirmación de Salmonella por aislamiento en cultivo.  J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demuestra la técnica de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para detectar un gen bacteriano objetivo amplificando el ADN a temperatura constante. La mezcla de reacción se prepara añadiendo una mezcla maestra isotérmica, cebadores específicos para el gen...

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