Un ensayo de amplificación isotérmica (lámpara) mediada por el lazo para identificación rápida de Bemisia tabaci
29 de octubre de 2018
Este papel divulga el protocolo para un ensayo de identificación rápida para Bemisia tabaci basado en tecnología de amplificación isotérmica mediada lazo (lámpara). El protocolo requiere laboratorio mínimo entrenamiento y puede, por tanto, aplicarse in situ en los puntos de entrada para las importaciones de planta como los puertos marítimos y aeropuertos.
Este método proporciona una herramienta de diagnóstico rápida y fiable para la identificación de Bemisia tabaci, una plaga de insectos invasora que afecta a la producción de hortalizas y cultivos ornamentales en muchos países del mundo. Debido a su facilidad, el método se puede realizar in situ directamente en los puntos de entrada de los productos de importación de plantas, como puertos y aeropuertos, y por lo tanto tiene el potencial de reducir la dispersión de Bemisia tabaci a lo largo de las redes comerciales. Para comenzar, utilice tijeras para cortar una tira LAMP de ocho tubos en dos tiras LAMP de cuatro tubos.
A continuación, etiquete los tubos de acuerdo con el esquema descrito en la figura uno del protocolo de texto. Después de esto, prepare suficiente mezcla maestra de reacción B.tabaci LAMP para 80 reacciones. A continuación, dispensar 22,5 microlitros de la mezcla maestra en cada uno de los tubos de las tiras LAMP de cuatro tubos.
Centrífuga de pulso, y ponlos en hielo. Rápidamente vórtice y centrífuga de pulso B.tabaci LAMP PAC. A continuación, agregue 2,5 microlitros en el tubo etiquetado PAC en cada una de las tiras LAMP de cuatro tubos.
A continuación, cierre las tapas y guarde las unidades del kit B.tabaci LAMP listas para usar a menos 20 grados centígrados. Para comenzar la extracción de ADN, utilice palillos de dientes estériles para transferir los especímenes de insectos a tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitros con 30 microlitros de solución de extracción de ADN. Luego, incubar las muestras durante cinco minutos a 95 grados Celsius en un ThermoMixer establecido en 300 rpm.
Brevemente vórtice y centrifugar pulso las muestras. Descongele uno de los kits B.tabaci LAMP listos para usar. A continuación, vórtice el kit rápidamente, y el pulso lo centrifuga.
Añadir 2,5 microlitros de extracto de ADN de muestra a los tubos S-uno y S-dos. A continuación, agregue 2,5 microlitros de solución de extracción de ADN alcalino puro al tubo NAC. Después de la centrifugación de pulsos y vórtices del kit, inserte el kit en un dispositivo de análisis LAMP y realice análisis de amplificación de ADN isotérmico a 65 grados centígrados durante 60 minutos.
En la misma carrera, realice un análisis de temperatura de fusión de los productos de amplificación de ADN calentando primero el kit a 98 grados Centígrados y enfriándolo a 75 grados centígrados. Valide la lectura LAMP mediante la aplicación de validación LAMP automatizada. En primer lugar, defina la especie objetivo y el número de muestras probadas antes de hacer clic en el botón Generar informe.
Por último, transfiera la lectura a los campos de entrada adecuados de la aplicación de validación. Inmediatamente después de introducir los datos, se mostrará el resultado de la validación. En este protocolo, los especímenes de insectos B.tabaci interceptados en el curso del proceso regular de control de importaciones suizos fueron analizados a través del ensayo LAMP.
De un total de 80 especímenes analizados, 75 especímenes fueron identificados correctamente como verdaderos positivos, y dos especímenes fueron identificados correctamente como verdaderos negativos. Tres especímenes, sin embargo, eran falsos negativos y fueron identificados incorrectamente como no ser B.tabaci. Un subconjunto de los ensayos fue realizado in situ por inspectores de salud vegetal en el aeropuerto de Zúrich.
En los resultados representativos, las muestras uno y dos se identificaron correctamente como B.tabaci a través de la amplificación del ADN después de aproximadamente 30 minutos en la temperatura de recocido prevista de aproximadamente 82 grados centígrados. Después de su desarrollo, este método allanó el camino para una identificación rápida y fácil de realizar in situ de Bemisia tabaci. El protocolo está diseñado de tal manera que puede ser realizado por inspectores de salud vegetal con formación limitada en laboratorio.
Después de la validación in situ exitosa del método en un punto de entrada suizo para los productos de importación de plantas, el método podría adaptarse a otros patógenos vegetales, pero también, si fuera necesario, a otros patógenos humanos o veterinarios.
Resumen
Este artículo presenta un ensayo de identificación rápida de Bemisia tabaci mediante la amplificación isotérmica mediada por bucle (tecnología LAMP). El método está diseñado para su implementación in situ en puntos de entrada de importaciones vegetales y requiere una formación de laboratorio mínima.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Patología vegetal
- Manejo de especies invasoras
- Tecnología diagnóstica
Antecedentes
- Bemisia tabaci es una plaga insectil invasora que afecta cultivos en todo el mundo.
- La detección temprana es crucial para prevenir su propagación.
- Los métodos actuales pueden no ser adecuados para pruebas rápidas in situ.
- La tecnología LAMP ofrece una solución prometedora para diagnósticos rápidos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo rápido y confiable para identificar Bemisia tabaci.
- Permitir pruebas in situ en puntos de importación como aeropuertos y puertos marítimos.
- Reducir el riesgo de dispersión de plagas mediante el comercio.
Métodos Utilizados
- Preparación de la mezcla maestra de la reacción LAMP y extracción de ADN.
- Amplificación isotérmica de ADN a 65 grados Celsius.
- Análisis de la temperatura de fusión de los productos de amplificación.
- Validación de los resultados mediante una aplicación automatizada.
Resultados principales
- 75 de 80 especímenes se identificaron correctamente como positivos verdaderos.
- Dos especímenes se identificaron correctamente como negativos verdaderos.
- Tres especímenes fueron negativos falsos.
- El método se validó con éxito in situ por inspectores.
Conclusiones
- El ensayo LAMP proporciona un método rápido y eficaz para la identificación de plagas.
- Puede realizarse por personas con formación limitada en laboratorio.
- El método tiene potencial para adaptarse a otros patógenos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación molecular rápida de plagas invasoras como Bemisia tabaci es fundamental para prevenir pérdidas agrícolas y proteger las cadenas globales de suministro. El ensayo LAMP permite la detección in situ en puntos de entrada, reduciendo la dependencia de laboratorios centralizados y acelerando los tiempos de respuesta. Esto respalda la gestión proactiva de riesgos en biotecnología agrícola y el cumplimiento de normativas en el comercio internacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la detección específica del complejo de especies Bemisia tabaci, apoyando la comprobación de hipótesis en estudios sobre interacciones vector-patógeno.
- Valor operativo: Proporciona un blanco molecular estandarizado para validar la capacidad vectorial de insectos en modelos preclínicos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera señales cuantitativas de amplificación en menos de 60 minutos, lo que permite el cribado de alto rendimiento de especímenes de insectos.
- Valor operativo: Requiere una cantidad mínima de muestra y reactivos liofilizados estables, lo que facilita la escalabilidad del ensayo y su uso en campo.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Facilita la correlación entre la presencia del vector y el riesgo de transmisión del virus en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Apoya el monitoreo longitudinal de poblaciones de plagas en estudios en ambientes controlados.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar una identificación rápida del vector antes de los estudios de transmisión del patógeno, lo que permite una selección informada de muestras para ensayos posteriores.
- Biología de Descubrimiento: Confirma la identidad del vector para reducir asociaciones falsas en experimentos de interacción vector-virus.
- Detección: Proporciona un resultado binario (positivo/negativo) con controles internos, asegurando la disponibilidad del ensayo y su reproducibilidad.
- Análisis: Se integra con software de validación automatizado para una interpretación estandarizada de los datos y consistencia entre laboratorios.
- Investigación Traslacional: Permite el seguimiento de la prevalencia del vector en regiones geográficas relevantes para las amenazas emergentes de virus vegetales.
- Reutilización Empresarial: El diseño basado en kits permite su reutilización en múltiples sitios de inspección y su adaptación a otras especies de vectores.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en el objetivo al reducir la identificación errónea de vectores insectos en estudios biológicos.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de purificación de ADN y termociclado, reduciendo las barreras técnicas y los requisitos de capacitación.
- Valor estratégico: Acelera las decisiones de avance o no avance en las evaluaciones de riesgo de plagas, reduciendo así la posible pérdida de cultivos y el impacto económico.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo de los recursos de vigilancia basada en datos validados de detección de vectores.
Consideraciones de Implementación
- Formación básica en biología molecular para el manejo de reactivos y la preparación de muestras.
- Acceso a un dispositivo de detección de fluorescencia o turbidez compatible con LAMP.
- Procedimientos operativos estándar para el transporte de muestras y el control de contaminación.
- Consideraciones para la adaptación a diferentes especies de insectos o etapas de desarrollo.
- Estabilidad ambiental de los reactivos durante la implementación en campo y el almacenamiento.
