Name: Un método In Vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprenda a evaluar la integridad de la barrera hematotesticular en ratones C57Black/6 mediante inyección de inulina-FITC. Este método in vivo permite estudiar los efectos de factores genéticos y ambientales sobre la fertilidad masculina.

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Este trabajo fue financiado por la nacional clave de R & D programa de China (2016YFA0500902), el nacional Ciencias naturales Fundación de China (31471228, 31771653), la Fundación de ciencia de Jiangsu para jóvenes distinguidos eruditos (BK20150047), la Ciencia Natural Fundación de la provincia de Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) y el programa de innovador y emprendedor de la provincia de Jiangsu a K.Z.

Todos los experimentos con animales realizados han sido aprobados por el Comité de la Universidad médica de Nanjing. Ratones machos C57BL/6 fueron mantenidos bajo condiciones de fotoperíodo controlado y proveyeron de alimentos y agua.
1. preparaciones
<ol><li>
Capilares de microinyección
	<ol>
<li>Utilice capilares de microinyección con un diámetro externo, diámetro interno y longitud de 1.0 mm, 0,8 mm y 10,0 cm, respectivamente.</li>
		<li>Tire los capilares de vidrio con un capilar extractor (figura 1A). Prueba y ajuste la configuración según la máquina extractor capilar que está siendo utilizado.</li>
		<li>Romper las puntas de pipetas con pinzas a utilizar para obtener los capilares de un diámetro de 50 μm en la punta. Nota: Las puntas pueden ser demasiado largas para penetrar los testículos.</li>
		<li>Afilar la punta en un ángulo de 30° usando un beveler micropipeta (figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reactivos
	<ol>
<li>Preparar 1% pentobarbital sódico: disolver sodio pentobarbital 100 mg en 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (paso 2.3.3).</li>
		<li>Preparar la inulina-FITC de 10 mg/mL: disolver 1 mg en 100 μL de PBS (paso 2.1.6) inulina-FITC.</li>
		<li>Preparación de paraformaldehído al 4%: disolver paraformaldehido (PFA) 4 g en 100 mL de PBS (paso 2.3.3).</li>
		<li>Preparar 30% sacarosa: sacarosa 3 g en 10 mL de PBS (paso 2.3.4) se disuelven.</li>
		<li>Preparación de cloruro de cadmio 0.1%: disolver 10 mg en 10 mL de PBS (paso 2.1.1) de cloruro de cadmio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. métodos
<ol><li>
Preparación anestesia y PREQUIRGICA
	<ol>
<li>Pesar de ratones machos de 8 semanas de edad C57BL/6 y calcular la dosis necesaria de CdCl2. Tratar un grupo de ratones (n = 3) con CdCl2 (5 mg/kg p.v., i.p.) durante 3 días antes de la cirugía. Tratar a otro grupo de ratones machos de 8 semanas de edad C57BL/6 (n = 3) con PBS como control.</li>
		<li>Realizar cirugía en condiciones asépticas mediante pinzas, aguja, tijeras y jeringa estéril.</li>
		<li>Preparar la solución de trabajo de anestesia recién. La dosis requerida de la anestesia es de 70 mg de pentobarbital de sodio/kg de peso corporal. En promedio, un adulto ratón C57BL/6 a 8 semanas de edad pesa ~ 25 g, que corresponde a 175 μL de 1% pentobarbital sódico (1,75 mg por ratón). Nota: El pentobarbital sódico se disuelve en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). La solución es filtrada por 0.22 um unidad de filtro antes de ser utilizados.</li>
		<li>Limpiar la zona para la cirugía con etanol al 75% y cubrir la zona con una toalla de papel limpia.</li>
		<li>Encienda el calentador termostático y ajustar la temperatura a 37 ° C.</li>
		<li>Preparar solución de trabajo de inulina-FITC (10 mg/mL) en el día de la cirugía.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimiento quirúrgico
	<ol>
<li>Pesar de ratones machos de 8 semanas de edad C57BL/6 y calcular la dosis requerida de la anestesia.</li>
		<li>Realizar una inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio utilizando la jeringa estéril de 1 mL. Mantenga el ratón en una jaula limpia.</li>
		<li>Observar la respuesta refleja del ojo y patrón de respiración del ratón para confirmar que está bajo anestesia completa. Nota: Generalmente, 10-15 min se necesitan hasta que el ratón está profundamente anestesiado, con una total falta de respuesta de pellizco del dedo del pie y el mantenimiento de la respiración lenta y constante.</li>
		<li>Mueva el ratón a la zona de operación y cubrir la zona de los ojos con un papel de seda húmedo para evitar la sequedad durante la anestesia (figura 2A).</li>
		<li>Afeite su pelo abdominal con una afeitadora y desinfectar el área quirúrgica con etanol al 75%.</li>
		<li>Con unas tijeras afiladas, hacer una incisión en la piel de 1 cm por encima de las glándulas prepuciales para exponer la pared abdominal. Elevar la pared abdominal con pinzas pequeñas y haga una incisión de 0.5 cm para exponer la cavidad peritoneal (figura 2B).</li>
		<li>Utilice pinzas para buscar cojines gordos todo el epidídimo y testículo. Saque con cuidado las almohadillas de grasa para exponer claramente los testículos adjunto (figura 2 y 2D). Por lo general, operan sobre un testículo a la vez. Nota: Evite tocar las almohadillas de grasa y testículos con las manos.</li>
		<li>Coloca un papel (9 cm de diámetro) debajo de los cojines gordos y testículo (figura 2).</li>
		<li>Inyectar inulina-FITC en una pipeta de microinyección y conéctelo a la unidad de instrumental quirúrgico (figura 1). Suavemente inserte la pipeta de microinyección en la túnica albugínea y cargar un total de 20 μL de inulina-FITC en el intersticio del testículo (Figura 2E y 2F). Nota: Presione con cuidado la pipeta de microinyección para evitar moverlo.</li>
		<li>Vigilar el movimiento de inulina-FITC en los testículos (figura 2).</li>
		<li>Inmediatamente Coloque los testículos en la cavidad abdominal después de la terminación de la inyección.</li>
		<li>Repita el procedimiento en el testículo contralateral. Este testículo se inyecta con 20 μL de PBS como un control.</li>
		<li>Cierre la piel con una sutura quirúrgica y mueva el ratón a una almohadilla de calor de un calentador termostático (figura 1B). Administrar una dosis de 1 mg de analgésicos (buprenorfina) por 1 kg de peso corporal vía inyección subcutánea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recolección de los testículos y la preparación de secciones congeladas
	<ol>
<li>40 minutos después de la inyección, eutanasia el ratón receptor mediante dislocación cervical según el cuidado de los animales y utilizar las pautas.</li>
		<li>Utilice un par de tijeras afiladas para recoger los testículos. Coloque 1 mL de PBS helada para quitar cualquier contaminación de la sangre a los testículos.</li>
		<li>Fijar los testículos en paraformaldehído al 4% (PFA) a 4 ° C durante 12-24 h. descartar el 4% PFA y lavado del tejido 3 x 1,5 ml de PBS 1% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Deshidratar los tejidos en sacarosa al 30% durante la noche. Poner los testículos en el marco de la inclusión y cubrir el tejido con la temperatura óptima de corte compuesto (OCT). Después del OCT se congela, llene el marco de la inclusión de OCT para que el testículo entero puede ser cubierto con OCT.</li>
		<li>Corte secciones de 5 μm de espesor, congeladas de los testículos en un criostato a-20 ° C y que se adhieren al portaobjetos de microscopio. Nota: Volver a congelar tejidos embebidos en el hielo seco puede aumentar la rigidez para el corte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Requisición de imagen
	<ol>
<li>Coloque los portaobjetos en una caja humidificada. Caliente las diapositivas en temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
		<li>Lávese las secciones de 3 x con solución salina tamponada con Tris (TBS) a temperatura ambiente.</li>
		<li>Secado con aire por 5 min en la oscuridad. Limpie cualquier residual TBS con papel libre de polvo.</li>
		<li>Cubrir las secciones transversales con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Coloque el cubreobjetos invertido sobre un portaobjetos de microscopio.</li>
		<li>Adquisición de imágenes mediante un microscopio confocal. Un total de 20 aumentos es suficiente para la detección de la señal fluorescente brillante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li>
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<li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li>
<li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+%27blood-testis+barrier%27+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li>
<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li>
<li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li>
<li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats%3A+a+quantitative+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li>
<li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+cadherin%2Fcatenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li>
<li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).</li>
<li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture%3A+I.+Morphological+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Research%22%5BJournal%5D)">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+%28BTB%29%3A+An+In+Vivo+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Espermatogénesis tiene lugar en el epitelio seminífero y es un proceso altamente ordenado y dinámico que está regido por las células germinales y células somáticas (p. ej., las células de Sertoli)13. La estructura de la BTB, que está construida por células de Sertoli, divide el epitelio seminífero en un básico y un compartimiento apical. El desarrollo de las células germinales meióticas y haploides se produce en el compartimento apical que forma una barrera inmunológica<sup class...

Espermatogénesis mamíferos se consideran un proceso altamente estructurado que comprende espermatogonias de auto renovación y diferenciación a espermatocitos en espermatozoides haploides por mitosis, meiosis y espermiogénesis, que dramático ocurren cambios bioquímicos y morfológicos. Células germinales en desarrollo progresivamente son transportadas desde la base de los túbulos seminíferos hacia el lumen. Este proceso está regulado por los contactos de la célula entre las células germinales y células de Sertoli1,2. Las células de Sertoli adyacentes forman la BTB se encuentra cerca de la base del túbulo seminífero. La BTB físicamente divide el epitelio en un básico y un compartimento adluminal. Durante las etapas VIII - IX del ciclo epitelial, espermatocitos preleptotene/leptoteno de los compartimentos basals migran a través de la BTB, entrar en los compartimientos adluminal del3. Por lo tanto, la función de la BTB es proporcionar un microambiente de immunoprivileged para la terminación de la meiosis y espermiogénesis4,5,6. A diferencia de otras sangre-tejido barreras (e.g., barrera blood - brain) que se componen sólo de uniones estrechas (TJs), el BTB está formado por cuatro diferentes cruces (TJs, especializaciones ectoplasmáticos, ensambladuras de gap y base de filamento intermedio desmosomas) entre el Sertoli de células1,7.
Muchos estudios han utilizado ratones modificados genéticamente, infecciones por virus y sustancias tóxicas ambientales para investigar mecanismos de BTB integridad7,8,9. La interrupción de la BTB induce la espermatogénesis deteriorada y subfertilidad o infertilidad. Puesto que la formación de la BTB y la integridad han sido confirmados para ser afectado por los contactos entre las células de Sertoli8, un modelo en vitro basado en cultivo primario de células de Sertoli aisladas se ha utilizado para el estudio BTB. Sin embargo, este modelo no puede imitar exactamente BTB dinámica en vivo. Por otra parte, esa cultura no Co de las células germinales con las células de Sertoli se ha establecido como capaz de reflejar todos los componentes estructurales y funcionales relevantes de la BTB10,11.
En general, en vivo ensayos de integridad BTB se basan normalmente en moléculas pequeñas, como EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina y conjugados con FITC inulina (inulina-FITC). Normalmente, la difusión de la biotina o inulina-FITC desde el compartimiento basal es bloqueada por estructura BTB. Por lo tanto, somos capaces de utilizar este método para evaluar la magnitud del daño de la BTB en comparación con grupos control. Mientras que TBB puede verse comprometida con ciertos tipos de estímulos, tales como el tratamiento con cadmio cloruro (CdCl2)12, BTB se convierte en accesible a moléculas pequeñas, que finalmente entran en el compartimento adluminal como indicadores.
Un temprano en vivo TBB integridad ensayo implica la inyección de biotina o inulina-FITC en la vena yugular, que consiste en una cirugía y es invasiva, complicado y desperdiciador de tiempo. Además, como las sustancias reportero difunden a través de todo el cuerpo vía la circulación, la concentración local de biotina o inulina-FITC en los túbulos seminíferos es limitada. Por otra parte, la exposición sistémica puede inducir reacciones inmunes. Aquí, presentamos un sencillo y eficaz en vivo TBB integridad ensayo que permite la inyección directa de una pequeña alícuota de inulina-FITC en el intersticio de un testículo. Usando el fluorescente etiquetado método, el proceso de tinción es conveniente, como anticuerpos secundarios no son necesarios. Aquí, se visualiza el proceso de colorante fluorescente en el testículo.

<table><tbody><tr><td>Tirador capilar&nbsp;</td><td>INSTRUMENTO SUTTER (EE. UU.)</td> <td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone (EE. UU.)</td> <td>SH30258.01</td><td>dilución a 1 & veces; en ddH2O</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma (EE. UU.)</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de adhesión</td><td>CITOGLAS (China)</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cadmio</td><td>Sigma (EE. UU.)</td><td>655198-5G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss (Alemania)</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Papel libre de polvo</td><td>Kimberly-Clark (EE. UU.)</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Inulina-FITC</td><td>Sigma (EE. UU.)</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de microinyección</td><td>Zhengtianyi (China)</td><td>BJ-40</td><td>1,0 mm &times; 0,8 mm&nbsp; &times; 100 mm</td></tr><tr><td>Biseladora de micropipetas</td><td>NARISHIGE (JAPÓN)</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>SAKURA (JAPÓN)</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma (EE. UU.)</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Merck (Alemania)</td><td>P11011</td><td></td></tr><tr><td>Afeitadora&nbsp;</td><td>Yashen (China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon (JAPÓN)</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa&nbsp;</td><td>Sangon Biotech (China)</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos quirúrgicos</td><td>Stronger (China)</td><td></td><td>tijeras, fórceps, portaagujas</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>KDL (China)</td><td>20163150518</td><td>0,45 mm y veces; 0,16 mm</td></tr><tr><td>Calentador termostático</td> RW LB <td>KELL (Nanjing, China)</td><td>KEL-2010</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS, pH 7.6</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M Tris</td><td>Sangon Biotech (China)</td><td>A600194</td><td></td></tr><tr><td>1,37 M Nacl</td><td>Sangon Biotech (China)</td><td>A610476</td><td></td></tr></tbody></table>

un método in vivo para el estudio de integridad de barrera hematotesticular ratón

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Espermatogénesis es el desarrollo de espermatogonias en espermatozoides maduros en los túbulos seminíferos de los testículos. Este proceso es apoyado por las ensambladuras de la célula de Sertoli en la barrera del sangre-testis (BTB), que es la barrera de tejido más apretada en el cuerpo mamífero y segrega el epitelio seminífero en dos compartimentos, una basal y adluminal un. La BTB crea un microambiente único de las células germinales en la meiosis I / II y para el desarrollo de postmeiotic espermátides en espermatozoides por medio de la espermiogénesis. Aquí, describimos un análisis confiable para monitorear la integridad BTB de testículo de ratón en vivo. Un BTB intacto bloquea la difusión de la inulina FITC conjugado desde la basal en el compartimento apical de los túbulos seminíferos. Esta técnica es adecuada para el estudio de candidatos de genes, virus o tóxicos ambientales que pueden afectar la función BTB o integridad, con un procedimiento fácil y un requisito mínimo de habilidades quirúrgicas en comparación con métodos alternativos.

El montaje experimental para realizar el análisis de integridad BTB se muestra en la figura 1. Tire y afilar los capilares de la microinyección con tirador capilar y beveler micropipeta, respectivamente (figura 1A y 1C). El calentador termostático y equipo para la microinyección se ilustran en la figura 1B y 1D.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la integridad de barrera Hematotesticular inyectando inulina-FITC en los testículos. Este es un método eficiente en vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular que puede estar comprometida por elementos genéticos y ambientales.

Un método In Vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular ratón

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la barrera de los análisis de sangre de los campos de la biología sobre los candidatos a genes, los virus o las toxinas ambientales que pueden afectar la función o integridad de la barrera de los análisis de sangre. Tres días antes de la cirugía, tratar al menos tres ratones macho C57Black/6 de ocho semanas de edad diariamente con un cloruro de cadmio de cinco miligramos por kilogramo de peso corporal a través de la inyección intraperitoneal. El día de la cirugía, coloque un tejido limpio sobre un área quirúrgica esterilizada con etanol al 75% y establezca un calentador termostático en 37 grados centígrados.Coloque un ratón anestesiado sobre el tejido y luego confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del final. Afeitar el cabello abdominal con una afeitadora, y desinfectar la piel expuesta con 75%etanol. Haga una incisión cutánea de un centímetro por encima de las glándulas preputiales para exponer la pared abdominal, y use pequeños fórceps para levantar la piel para hacer una incisión de 0,5 centímetros en el peritoneo.Utilice los fórceps para buscar almohadillas de grasa alrededor del epidídimo y testis, tirando cuidadosamente de las almohadillas de grasa para exponer un testículo unido. Coloque un pedazo de papel de nueve centímetros debajo de las almohadillas de grasa y los testículos, y cargue una pipeta de microinyección con solución de inulina-FITC recién preparada. Conecte la pipeta a una unidad microempresador y utilice un microscopio de disección para insertar suavemente la punta de la pipeta de microinyección debajo de la túnica albuginea.Gire lentamente la palanca de operación para entregar 20 microlitros de la inulina-FITC en el intersticio de los testículos. Si la entrega es exitosa, los testículos se volverán de color verde-amarillo brillante. Inmediatamente devolver los testículos a la cavidad abdominal, e inyectar los testículos contralaterales con 20 microlitros de PBS, a continuación, cerrar la piel con una sutura quirúrgica.Y coloque el ratón sobre la almohadilla de calor de un calentador termostático. 40 minutos después de la inyección, utilice tijeras afiladas para recoger los testículos de cada ratón y lave los tejidos en un mililitro de PBS helado. A continuación, fijar los testículos en 4%paraformaldehído a cuatro grados Celsius durante 12 a 24 horas seguido de tres lavados en 1,5 mililitros de 1%PBS por lavado.Después de 30%deshidratación de sacarosa durante la noche, transfiera las muestras a marcos de incrustación individuales y cubra los tejidos con un compuesto de temperatura de corte óptimo. Ajuste la temperatura de un criostato a 20 grados Celsius negativos y coloque los fotogramas en el criostato durante unos 10 minutos hasta que el PTU esté congelado. A continuación, llene cada marco de incrustación con OCT fresco hasta que todo el testis esté cubierto en cada molde.Cuando la segunda capa de OCT se haya congelado, adquiera secciones transversales de cinco micrómetros de espesor de cada testículo, capturando las secciones de tejido en diapositivas de microscopio de vidrio a medida que se obtienen. Para tomar una imagen de las muestras, primero caliente los portaobjetos en una caja humidificada a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, lave los portaobjetos tres veces en solución salina fresca tamponada por comprimidos por lavado y deje que las secciones se sequen durante cinco minutos protegidas de la luz.Utilice papel libre de polvo para eliminar cualquier solución salina residual y monte las muestras con un medio de montaje complementado por DAPI. A continuación, cubra cada muestra con un resbalón de cubierta invertido e imagine las muestras bajo el objetivo 20X de un microscopio confocal. Tres días de tratamiento con cloruro de cadmio causan daños en la barrera blood-testis permitiendo la difusión inulina-FITC desde el compartimiento basal hasta el compartimiento apical del epitelio semicífero.Por el contrario, esta difusión se bloquea en el control de los testículos tratados con PBS. El alcance del daño de la barrera blood- testis se determina calculando la relación entre la distancia de difusión inulina-FITC y el radio del mismo tubulo semiínfero. Además, la barrera intacta de los testis de sangre en los ratones noqueados de Rictor heterocigoto bloquea la difusión de la inulina a través de la barrera en el compartimiento apical, mientras que los ratones noqueadores condicionales de Rictor poseen una barrera de testis de sangre comprometida que permite la difusión de la inulina.Al intentar este procedimiento, es importante recordar entregar inulina-FITC preparado el día del experimento y mantener el tejido protegido de la luz ya que FITC es una molécula sensible a la luz. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia de espermatogénesis deteriorada porque la función de la barrera blood-testis es proporcionar un microambiente de privilegio inmune para la finalización de la meiosis en la espermatogénesis. Después de su desarrollo, esta técnica proporciona una manera para que los investigadores en el campo de la medicina reproductiva exploren la subfertilidad y la infertilidad en ratones.No olvide que trabajar con paraformaldehídos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de prendas y máscaras faciales al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Los protocolos para el trasplante de células germinales de testículo y el xenotrasplante de tejido se describen. Germen de los resultados de trasplante de células en donantes derivado de la espermatogénesis en los testículos receptores y representa un ensayo de reconstitución funcional para la identificación de células madre de espermatogonias (SSC). Tejido testicular xenoinjerto reproduce desarrollo de los testículos y la espermatogénesis de las especies de los distintos donantes en los...

Germen de Trasplante de Células y Tejidos Testículos xenotrasplante en ratones

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Ensayo de prueba de permeabilidad Vasos Sanguíneos

El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente...

Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial

Este artículo describe la microinyección y electroporación de testículo de ratón in vivo como una técnica de transfección de células de ratón testiculares para estudiar procesos únicos de la espermatogénesis. El protocolo presentado implica etapas de preparación capilar de vidrio, microinyección a través del conducto eferente, y transfección por electroporación.

En Vivo microinyección y electroporación del mouse Testis

Se presenta un protocolo para estudiar las interacciones del endotelio de pericitos humanos en ratón usando una variación del ensayo de angiogénesis tapón de gel de matriz.

Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

Aquí presentamos un ensayo de permeabilidad vascular de cerebro de ratón mediante inyección intraperitoneal de trazadores fluorescentes seguido de perfusión que es aplicable a los modelos animales de disfunción de la barrera blood - brain. Una hemi-cerebro se utiliza para evaluar cuantitativamente la permeabilidad y el otro para tracer visualización/immunostaining. El procedimiento toma 5-6 h por 10 ratones.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Aprovechando la microscopía intravital, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales intestinales en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal teñida tópicamente (acriflavina y rhodamineB-dextran) de ratones anestesiados se compara hasta una sola célula mediante microscopía confocal.

Un enfoque basado en microscopía intravital para evaluar la permeabilidad intestinal y el rendimiento del desprendimiento de células epiteliales

Este protocolo describe la microdisección asistida por transilluminación de segmentos de tubulos seminiferosos de ratón adultos que representan etapas específicas del ciclo epitelial seminferoso, y los tipos celulares en el mismo, y la inmunodetención posterior de preparaciones de calabaza y segmentos de tubérculos intactos.

Disección asistida por transilluminación de etapas específicas del ciclo epitelial seminiferoso del ratón para análisis de inmunodetención aguas abajo

Este artículo informa una inhibición in vivo de CENP-E a través de cirugía abdominal e inyección testicular de GSK923295, un modelo valioso para la división meiótica masculina. Usando los ensayos de inmunofluorescencia, citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión, mostramos que la inhibición de CENP-E da como resultado una desalineación cromosómica e inestabilidad del genoma en espermatocitos de ratón.

Evaluación funcional de la quinesina-7 CENP-E en espermatocitos mediante inhibición in vivo , inmunofluorescencia y citometría de flujo

En el presente protocolo, la función de barrera endotelial de la glándula submandibular (SMG) se evaluó inyectando diferentes trazadores fluorescentes ponderados molecularmente en las venas angulares de modelos animales de prueba in vivo bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones.

In vivo Detección de permeabilidad vascular en glándula submandibular de ratón

Aquí, presentamos un protocolo para establecer un modelo de ratón de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y transferencia de embriones (ET), lo que nos permite observar cambios relacionados con la edad en el metabolismo de la glucosa que pueden atribuirse a ICSI, proporcionando información sobre sus posibles impactos a largo plazo en el desarrollo humano.

Monitorización de la glucosa en sangre en crías de ratón después de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides

Aprenda a evaluar la integridad de la barrera hematotesticular en ratones C57Black/6 mediante inyección de inulina-FITC. Este método in vivo permite estudiar los efectos de factores genéticos y ambientales sobre la fertilidad masculina.

Un método In Vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular ratón

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