Name: Cryosectioning simultánea de varios cerebros de roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprende a realizar criosección simultánea de múltiples cerebros de roedores para inmunohistoquímica. Este método reduce la variabilidad entre muestras y optimiza la visualización de estructuras anatómicas y proteínas locales.

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Fondos de apoyo de la misión de PCH apoyó la investigación en este manuscrito. Los autores desean agradecer a Daniel Griffiths por tomar las imágenes utilizadas en las figuras.

Se ha optimizado la técnica Megabrain con todo y hemiseccionada cerebros de varones adultos de ratones C57Bl65, ratas Sprague-Dawley juvenil y ratas Sprague-Dawley adultas que fueron perfundido con 1 x de tampón fosfato salino (PBS) seguido de transcardially de paraformaldehído al 4%6. Resultados similares se pueden lograr en otras cepas de ratón y rata, en ambos sexos y diferentes edades. El estudio para generar datos para este manuscrito utilizado ratas Sprague-Dawley juvenil y fue aprobado por el Comité de uso y cuidado Animal institucional de la Universidad de Arizona, y animales de experimentación fueron atendidos según la guía para el cuidado y uso de laboratorio Los animales7.
1. crioprotección de cerebros perfundidos
<ol><li>Siguiente éxito transcardial perfusión6, recoger el cerebro completo6,8 de los animales y después arreglar colocando en un frasco de 25 mL de paraformaldehído al 4% en PBS durante 24 h. PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es un fijador de tejido tóxico; Manéjela con cuidado. Transferencia de paraformaldehido en un contenedor de residuos específicamente etiquetado que identifica su concentración y el volumen dentro de una campana de humos químicos y luego almacenar en el gabinete hasta eliminados por seguridad química o bien de residuos químicos con personal capacitado.</li>
	<li>Transcurrido 24 h, en una campana de humos, quitar cerebros de paraformaldehído al 4% con una espátula. Transferir el cerebro en un frasco de aproximadamente 20 mL de solución de sacarosa al 15% en solución salina tamponada con Tris de 1 x (TBS), hasta que cerebro se hunde hasta el fondo de la cubeta (aproximadamente 24 h).</li>
	<li>A continuación, transferir el cerebro a un frasco de aproximadamente 20 mL de solución de sacarosa al 30% en 1 x TBS, hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo de la cubeta (aproximadamente 24-48 h).</li>
</ol>2. cerebro congelación
<ol><li>Coloque un vaso de precipitados de vidrio de 500 mL en una cama de hielo seco en un cubo de hielo. Verter 300-400 mL de isopentano (2 metil-butano) en el vaso de vidrio.</li>
	<li>Permitir que la temperatura de isopentano para llegar a entre-45 ° C y -50 ° C. Vigilar de cerca y mantener este rango de temperatura con un termómetro, manteniéndola constante durante todo el procedimiento. Asegúrese de que las lecturas de temperatura se toman desde el centro de la solución y no tocar la parte inferior o lateral del vaso.</li>
	<li>En el Banco, llenar una desechable incrustar molde (véase la lista de materiales) aproximadamente 1/2 lleno de temperatura óptima de corte (OCT; véase Tabla de materiales) compuesto. Asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire en los PTU. Si hay burbujas de aire Retire con una espátula o con aguja.</li>
	<li>
Retire el primer cerebro del frasco de sacarosa al 30% con una espátula. En este punto, o bien congelar cerebros total o hemisect, dependiendo del diseño del estudio.
	<ol>
<li>Para hemiseccionada cerebros, utilice una cuchilla nueva para hacer un corte limpio a través del tejido para separar los hemisferios. Si no es necesario para el estudio, quite el cerebelo y bulbos olfativos en esta etapa. Si el cerebelo es necesaria para el estudio, se sugiere cortar un área plana en la parte posterior del cerebro para ayudar al cerebro en pie directamente en el molde. Si el estudio requiere sólo de una región localizada del tejido, puede utilizarse una matriz de cerebro de roedor para bloquear el cerebro basado en coordenadas conocidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dar cerebros un numérico sistema. Dibujar un diagrama como se muestra en la figura 1. Escriba el número del primer cerebro para colocar en el molde de Megabrain en la posición 2, dejando la posición 1 como un espacio en blanco para facilitar la rápida identificación de la orientación en la que los cerebros fueron congelados.</li>
	<li>Usando fórceps romos o pinzas, recoger el cerebro para colocarse en la posición 1. Oriente el cerebro con la parte a cortar primero hacia arriba. Baje el cerebro en el OCT en la ubicación adecuada, utilizando las pinzas para ajustar su posición hasta que se encuentra de forma independiente.</li>
	<li>Repita los pasos 2.3 – 2.5 para los cerebros/hemisferios quedan congelados en las posiciones 3 – 10. Evite colocar cerebros/hemisferios en un diseño simétrico.</li>
	<li>Revisar todos los 9 cerebros en el molde de Megabrain. Una vez que los cerebros están de pie, vertical y correctamente orientado en el OCT (como se muestra en la figura 2B), añadir más OCT al molde (hasta que se cubran la parte superior de los cerebros). Una vez más, asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire visible en los PTU.</li>
	<li>Use las pinzas para sostener la esquina del molde, asegurando que el fórceps no se sumerja parcialmente en el OCT (Figura 3A). Teniendo cuidado de mantener el nivel de molde, coloque el molde en isopentano (-45 ° C a-50 ° C) para que la parte inferior tercera del molde se sumerge. Mantenerla aquí para permitir que las burbujas de los PTU a la superficie y lejos de los tejidos (figura 3B).</li>
	<li>Después de 30 s, menor el molde entero en el isopentano y el lanzamiento de las pinzas, dejando el Megabrain sumergido durante al menos 3 minutos (figura 3). Asegurar ese molde se mantiene a nivel, para cerebros permanecen verticales y equidistantes (figura 3D).</li>
	<li>Después de 3 minutos, uso las pinzas para quitar el molde que contiene el congelado, OCT había incrustado cerebros (figura 3E) del isopentano.</li>
	<li>Inmediatamente, envuelva el molde y su contenido en papel de aluminio y etiqueta con el número de animales o identificación de Megabrain. Toque el Megabrain congelado como con moderación posible para evitar descongelar el tejido.</li>
	<li>Este Megabrain se puede transferir a un congelador de-20 ° C y almacenado por un mínimo de 24 h. Nota: Protocolo puede hacer una pausa aquí y el Megabrain puede almacenarse congelados hasta que cryosectioning.</li>
</ol>3. preparar el Megabrain para secciones en criostato
<ol><li>Ajustar la temperatura de criostato a-19 ° C. Asegúrese de que se alcanza esta temperatura antes de continuar. A lo largo de secciones, asegurar que la temperatura se mantiene entre-18 ° C y -20 ° C.</li>
	<li>Tomar el Megabrain del congelador de-20 ° C y colocar en el criostato. También, colocar un plato de las dimensiones de tamaño adecuado y dos pinceles de punta finas en el criostato. Deje el Megabrain y el mandril en el criostato para por lo menos 15 minutos llegar a la temperatura del criostato.</li>
	<li>Adecuadamente diapositivas de etiqueta con el número de identificación de Megabrain y el número de diapositiva. Coloque estas diapositivas sobre una diapositiva más caliente (35-45 ° C).</li>
	<li>Desenvuelva el Megabrain del papel de aluminio. Utilice una cuchilla para cortar verticalmente las esquinas del molde para permitir la fácil remoción del bloque de OCT del molde (Figura 4A).</li>
	<li>Distribuir una capa delgada (aproximadamente 3 mm de espesor) de OCT en el portabrocas.</li>
	<li>Rápidamente, con mínimo contacto entre los dedos y el OCT, coloque el Megabrain en la tirada, en la orientación deseada. Pinzas grandes pueden utilizarse también para este paso para minimizar la descongelación. Antes de empezar sección, dejar el Megabrain montado tirada en el criostato para 15 – 20 minutos permitir que la OCT se congele completamente.</li>
	<li>Una vez que se ha congelado la capa base de PTU, aplique una capa gruesa de 2 mm OCT alrededor de los lados de lo Megabrain y que corra por los lados en el portabrocas. Esto ayuda a asegurar el Megabrain para el mandril. Otra vez, antes de continuar, deje el mandril Megabrain montado en el criostato para 15 – 20 minutos permitir que la OCT se congele.</li>
	<li>Utilice una cuchilla de afeitar para quitar cualquier exceso OCT desde los lados o la parte inferior de la tirada (Figura 4B).</li>
</ol>4. Cryosectioning el Megabrain
<ol><li>Antes de comenzar, asegúrese de que un vaso de precipitados que contiene al menos 20 mL 1 x PBS es accesible.</li>
	<li>Coloque el portabrocas, montado con el Megabrain, en la cabeza del mandril en el criostato (Figura 4B).</li>
	<li>Establecer el criostato para cortar en el espesor deseado. La metodología actual se ha optimizado para 10 μm a 50 μm secciones.</li>
	<li>Recortar el OCT y el tejido como sea necesario para llegar a la región del cerebro deseada para la recogida de tejido (figura 4).</li>
	<li>Cuando esté listo para recoger el tejido, baje la placa estabilizadora hasta que quede en el escenario y girar el mango de criostato para tomar una sola sección. Lentamente Levante la placa estabilizadora, teniendo cuidado que el Megabrain seccionado no está conectada a la placa estabilizadora y no se caiga la etapa figura 4).</li>
	<li>Suavemente utiliza los pinceles para desenrollar la sección Megabrain hasta que está mintiendo en la etapa de criostato (figura 5A). (Si es necesario, mantenga el OCT plana usando los pinceles para evitar balanceo).</li>
	<li>Quitar la corredera de diapositiva más caliente y pase la diapositiva, la cara de etiqueta hacia abajo, sobre la sección de Megabrain en la etapa que permite la sección se adhiera al portaobjetos.</li>
	<li>Aplique una gota de 1 x PBS a cada sección de tejido en la diapositiva rápidamente y no permita que estos se sequen hasta que han cepillado planos (ver paso 4.9).</li>
	<li>Utilizar un pincel de punta fino en PBS 1 x a Cepille cualquier burbuja en el tejido y desdoblar el tejido por lo que está mintiendo completamente en la diapositiva (figura 5B). Tenga cuidado de no cambiar la posición de las secciones de la cerebral y perder así la posición relativa de las otras secciones de tejido. Manipular el tejido con cuidado para evitar desgarros. Mantener las secciones de la cerebral fuera de los bordes de la diapositiva, como espacio periférico se requiere para una aplicación de lápiz PAP en algunos protocolos de tinción y cubreobjetos.</li>
	<li>Colocar el portaobjetos sobre la diapositiva más cálido y seco durante 45 minutos cubierta según sea necesario para evitar que el polvo de colocar en el tejido. Una vez secas, guardar las diapositivas en a-80 ° C hasta su uso posterior.</li>
</ol>

<ol><li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li>
<li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologica%22%5BJournal%5D)">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li>
<li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+I%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li>
<li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue%3A+example+staining+for+microglia+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li>
<li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome%2C+post-traumatic+sleep%2C+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).</li>
<li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).</li>
<li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen ninguna revelación.

Durante este procedimiento, debe considerar que la temperatura de lo Megabrain y sus alrededores debe ser constantemente monitoreada para evitar descongelar y volver a congelar el tejido. El cerebro puede sólo retirarse del congelador de-20 ° C hasta a 3 veces cada vez que se toca y de izquierda en el criostato, con una temperatura fluctuante más cálida, el tejido se descongela y refreezes, causando una jalea como textura y tejido anormal integridad10. Por lo tanto, es óptimo para cortar el Megabr...

Aquí, presentamos el protocolo para un nuevo método, que llamamos Megabrain, convertido a criosección roedor múltiples cerebros al mismo tiempo para los procedimientos de inmunohistoquímica aguas abajo. Un Megabrain permite la producción de diapositivas individuales que contienen tejido de múltiples animales. Esta técnica ha sido optimizada para cortar secciones coronales de hemisferios de rata adulta 9 o 5 cerebros completos adulto, al mismo tiempo. Por lo tanto, la técnica es más aplicable en los estudios de immunohistochemical grandes o en otros análisis realizados en tejido de cerebro montada diapositiva de una cohorte grande de animales.
Immunohistochemistry implica el uso de anticuerpos específicos dirigidos contra proteínas de interés para entender y caracterizar su expresión y cambios celulares en el tejido específico1,2,3. El uso de la inmunohistoquímica es frecuente en la investigación de la neurociencia, entre otras disciplinas científicas, ayudando en la comprensión celular y molecular del cerebro4. Estudios a gran escala con muchos animales y secciones del cerebro pueden ser intensivo de tiempo y recursos. Como tal, existe una razón multifacético detrás del desarrollo de lo Megabrain: reducir el tiempo dedicado cryosectioning, montaje y tinción de tejidos, mientras que, en consecuencia, menos reactivos. Además, la capacidad de agilizar el proceso y varios cerebros en el mismo la mancha redonda ayuda a aliviar parte de la variabilidad entre lotes, una limitación de inmunohistoquímica3la coloración. Además, seccionar un Megabrain es una alternativa de ahorro de tiempo al seccionamiento cerebros de roedores congelados individuales y permite la comparación rápida de tejido entre animales o incluso grupos de tratamiento por técnicas de microscopía.

<table><tbody><tr><td>Compuesto Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT (caja de 12)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Moldes de inclusión desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-41</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pinzas/pinzas de punta fuerte, rectas, anchas y de punta fuerte de alta precisión</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 20 mL Viales de centelleo de HDPE con Tapón de polipropileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa, botella de polietileno 2,5 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2-212</td><td>Es necesario compensar las concentraciones de sacarosa del 15% y del 30%.</td></tr><tr><td>2-metilbutano (certificado), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Vasos de precipitados de forma alta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-546E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Termómetros de inmersión parcial de líquido en vidrio de uso general (-50 a +50 &deg; C)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>13-201-642</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Espátula Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>STANLEY Hoja de afeitar</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de micrótomo Edge-Rite</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-070-60</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio (1" frost) - blanco</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; PBS (solución salina tamponada con fosfato) 10x, pH 7.2</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-013-032</td><td>Diluir a 1X &nbsp; antes de usar</td></tr><tr><td>15 piezas de pinceles finos</td><td></td> Amazon <td></td> B079J12ZRV <td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Chuck El mandril que se muestra en la Figura 4 fue hecho a medida por un técnico de laboratorio, sin embargo, hay tamaños similares disponibles para ordenar a otras empresas comercialmente.</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>EMS065</td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning simultánea de varios cerebros de roedores

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histología e inmunohistoquímica son métodos de rutina de análisis para visualizar la anatomía microscópica y localizar proteínas en tejido biológico. En neurociencia, así como una plétora de otros campos científicos, se utilizan estas técnicas. Inmunohistoquímica puede hacerse en tejido deslizante montado o secciones flotan libremente. Preparación de muestras de diapositivas es un proceso intensivo de tiempo. El siguiente protocolo para una técnica, llamada el Megabrain, reduce el tiempo necesario para montaje y criosección tejido cerebral hasta un 90% mediante la combinación de varios cerebros en un solo bloque congelado. Además, esta técnica reduce la variabilidad entre rondas, en un gran estudio histoquímico de la coloración. La técnica actual se ha optimizado para el uso de tejido cerebral de roedor en el análisis de immunohistochemical aguas abajo; sin embargo, puede aplicarse a distintos campos científicos que utilizan cryosectioning.

Un resultado positivo para este procedimiento es tejido que se encuentra en la diapositiva, sin burbujas ni lágrimas, en la orientación en que fueron congelados. Las secciones de tejido son uniformemente aparte y fácilmente identificable debido a la buena colocación del cerebro en el OCT y la notación buena como se demuestra en la figura 1. Asumiendo que el tejido cerebral fue recogido de animales de una edad similar, y que el tejido fue alineado en los PTU, ...

Aquí, presentamos un protocolo de congelación y sección de tejido cerebral de varios animales como una alternativa de ahorro de tiempo a procesar solo cerebros. Esto reduce la variabilidad de coloración durante la inmunohistoquímica y reduce la proyección de imagen y tiempo cryosectioning.

Cryosectioning simultánea de varios cerebros de roedores

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Este método de ahorro de tiempo reduce la variabilidad entre rondas de procedimientos inmunohistoquímicos en estudios de neurociencia para optimizar la visualización de la anatomía y proteínas y tejidos locales. La principal ventaja de esta técnica es que reduce el tiempo que se tarda en la criocirión y montar el tejido cerebral mediante la combinación de múltiples cerebros en un solo bloque congelado. Mientras que esta técnica está optimizada para secciones coronales de cerebros de roedores, se puede adaptar a secciones sagitales o transversales o diferentes tipos de tejidos como el músculo o el hígado.Después de una perfusión transcardial exitosa, después de arreglar el cerebro de los animales en un vial de 25 mililitros de 4%paraformaldehído en PBS durante 24 horas. Después de esto, usa fórceps con puntas contundentes para eliminar los cerebros del paraformaldehído. Transfiera el cerebro a un vial con aproximadamente 20 mililitros de solución de sacarosa al 30% en TBS.Mantenga el cerebro y la solución hasta que se hundan en la parte inferior del vial. A continuación, coloque un vaso de vidrio de 500 mililitros sobre una cama de hielo seco en un cubo de hielo. A continuación, vierta de 300 a 400 mililitros de isopentano en el vaso de precipitados.Mantenga el isopentano entre 45 negativos y 50 grados centígrados negativos. En la parte superior del banco, llene un molde de incrustación desechable aproximadamente a mitad de camino completo con la temperatura de corte óptima o el compuesto OCT. Utilice una aguja para eliminar cualquier burbuja de aire del molde.Utilice los fórceps con puntas contundentes para eliminar el primer cerebro de la solución de sacarosa. A continuación, utilice una nueva cuchilla de afeitar para eliminar el cerebelo y las bombillas olfativas antes de separar los hemisferios. A continuación, dé a los cerebros un sistema de nomenclatura numérico.Usa fórceps contundentes, recoge el cerebro que se colocará en la posición dos y orientalo con el lado que se corta primero mirando hacia arriba. Baje el cerebro en el OCT y utilice las pinzas para ajustar su posición hasta que se posicione de forma independiente. Una modificación clave de esta técnica es el espacio en blanco en la posición uno.Este espacio está designado para permitir una fácil identificación de la orientación del megacebro y por lo tanto identificar el animal asociado con cada cerebro. Después de que todos los cerebros se han colocado en el molde, añadir suficiente OCT para cubrir la parte superior del cerebro, a continuación, utilizar una aguja para eliminar cualquier burbuja de aire. Sostenga la esquina del molde con fórceps asegurando que los fórceps no se sumerjan parcialmente en el PTU.A continuación, baje el molde en el isopentano para que el tercio inferior del molde se sumerja. Después de 30 segundos, baje todo el molde en el isopentano y suéltelo de los fórceps. Después de tres minutos, utilice los fórceps para quitar el molde del isopentano.Envuelva inmediatamente el molde y su contenido en papel de aluminio y etiquételo adecuadamente. Transfiera el megacebro a un congelador negativo de 20 grados Celsius durante un mínimo de 24 horas. En primer lugar, ajuste la temperatura del gabinete de criostatos a 19 grados Celsius negativos.Retire el megacerebro del congelador y colóquelo en el criostato. A continuación, coloque un mandril y dos pinceles finos con puntas en el criostato. Después de esto, etiquete las diapositivas con el número de identificación de megabrano y el número de diapositiva y colocar las diapositivas en el calentador de diapositivas.A continuación, desenvuelva el megacerebro y use una cuchilla de afeitar para cortar las esquinas del molde. Dispensar una fina capa de OCT en el mandril. A continuación, coloque rápidamente el megacerebro en el mandril.Después de que el OCT esté completamente congelado, aplique una capa de dos milímetros de OCT alrededor de los lados del megacerebro y permita que corra por los lados sobre el mandril. Utilice una cuchilla de afeitar para eliminar cualquier exceso de OCT de los lados y la parte inferior del mandril. En primer lugar, coloque el mandril montado con el megacerebro en la cabeza del mandril del criostato.A continuación, ajuste el criostato al espesor deseado. Recortar el PTU y el tejido según sea necesario para llegar a la región cerebral deseada para la recolección de tejido. A continuación, baje la placa antivuelco hasta que descanse en el escenario y gire la manija del criostato para tomar una sola sección.Levante lentamente la placa antivuelco, teniendo cuidado de que la sección del tejido no se toque. Usa suavemente los pinceles para desenrollar la sección del tejido hasta que esté acostada. Si es necesario, sostenga el OCT plano usando los pinceles para evitar que se enrolle.A continuación, retire la diapositiva del calentador de diapositivas y coloque el lado de la etiqueta de la diapositiva hacia abajo sobre la sección del megabrancio y deje que se pegue a la diapositiva. Aplique rápidamente una gota de PBS en la sección del tejido. Usando un pincel con punta fina sumergido en PBS, cepilla cualquier burbuja en la sección de tejido y desdobla el tejido para que quede acostado sobre la diapositiva.Por último, coloque la diapositiva en el calentador de diapositivas para secar durante 45 minutos y guarde la diapositiva en 80 grados Celsius negativos. En este protocolo, se preparó tejido cerebral de nueve animales y se criocisó simultáneamente. Después de la criocirión, se puede realizar una tinción de H&E para evaluar la calidad de la crioprotección.Los resultados representativos de la molécula adaptadora de unión de calcio ionizado uno o la tinción Dea1 de microglia muestran una tinción constante entre cada cerebro del estudio en un solo megabrain. Al intentar este procedimiento, es importante recordar monitorear constantemente la temperatura mientras congela el megacebro para evitar agrietamiento o descongelación y luego volver a congelar el tejido que conduce a la integridad anormal del tejido. No se recomienda segregar diferentes grupos de tratamiento en megabranos separados, ya que esto puede crear varianza entre los grupos durante la tinción y reducir el sesgo y la subjetividad durante la toma de imágenes y el análisis.No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso y las precauciones como usar PBE y trabajar en una capucha siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El perfilado de la expresión de ARN en regiones cerebrales discretas del ratón requiere una estrategia precisa y reproducible de recolección de tejido. Aquí se describe un protocolo que utiliza tanto la sección coronal del cerebro como la microdisección asistida por punzón tisular. El rendimiento y la calidad del ARN total obtenido a partir de las muestras resultantes confirman la utilidad del método descrito.

Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

Se describen los procedimientos para la preparación y registro electrofisiológico de rodajas de cerebro que mantienen el eje dorsal-ventral medial de la corteza entorrinal (MEC). Debido a que la codificación neural de la localización sigue una organización dorsal-ventral en el MEC, estos procedimientos de facilitar la investigación de los mecanismos celulares importantes para la navegación y la memoria.

Preparación de las rebanadas parasagitales para la Investigación de dorsal-ventral Organización de los roedores de corteza entorrinal medial

Este video muestra un protocolo detallado paso a paso para preparar secciones de tejido cerebral de ratón congelado para análisis posteriores.

Procesamiento del cerebro de un ratón para su análisis posterior

Este protocolo se describen los pasos básicos de procedimiento para la realización de patch-clamp grabaciones de células enteras. Esta técnica permite el estudio del comportamiento eléctrico de las neuronas, y cuando se realiza en secciones de cerebro, permite la evaluación de varias funciones neuronales de las neuronas que todavía están integrados en los circuitos cerebrales relativamente bien conservadas.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Consecutivos crio-secciones se recogen para permitir que las aplicaciones histológicas y enriquecimiento de ARN para mediciones de la expresión de genes usando las regiones adyacentes de un músculo esquelético solo ratón. ARN de alta calidad se obtiene a partir de 20 - 30 mg de cryosections y mediciones agrupadas están directamente comparación entre aplicaciones.

Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

Este procedimiento describe la recolección de regiones cerebrales congeladas discretas para obtener proteínas y ARN de alta calidad utilizando herramientas baratas y comúnmente disponibles.

Colección de regiones cerebrales de roedores congelados para análisis posteriores

Presentamos un protocolo práctico, paso a paso, rápido para la extracción del cerebro del ratón y la disección de regiones discretas del tejido cerebral fresco. La obtención de regiones cerebrales para el análisis molecular se ha convertido en una rutina en muchos laboratorios de neurociencia. Estas regiones cerebrales se congelan inmediatamente para obtener datos transcriptómicos de alta calidad para el análisis a nivel de sistema.

Microdisección del cerebro del ratón en regiones funcional y anatómicamente diferentes

El presente protocolo describe una resección estandarizada de tumores cerebrales en roedores a través de un enfoque mínimamente invasivo con un sistema integrado de preservación de tejidos. Esta técnica tiene implicaciones para reflejar con precisión el estándar de atención en roedores y otros modelos animales.

Implementación de la resección de tumor cerebral mínimamente invasiva en roedores para la recolección de tejido de alta viabilidad

El presente protocolo describe una estrategia práctica para acelerar la etapa de verificación de las coordenadas de inyección estereotáxica antes de realizar el rastreo viral utilizando tintes y secciones congeladas.

Validación preliminar de las coordenadas de inyección estereotáxica mediante criosección

Las neurociencias modernas necesitan explorar las diferencias entre muchas especies, incluidos los roedores de laboratorio y los humanos. Sin embargo, surgen dificultades técnicas cuando se trata de mamíferos de cerebro grande. Este enfoque aborda la variación interespecie de poblaciones neuronales en mamíferos muy diferentes, produciendo resultados comparables que se pueden mapear para revelar patrones evolutivos.

Un enfoque comparativo para estudios cuantitativos de recuento celular en cerebros de mamíferos muy diferentes

Aprende a realizar criosección simultánea de múltiples cerebros de roedores para inmunohistoquímica. Este método reduce la variabilidad entre muestras y optimiza la visualización de estructuras anatómicas y proteínas locales.

Cryosectioning simultánea de varios cerebros de roedores

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