Copolímeros de bloque sin capacidad de ejecución funcionalización de metionina para la entrega de ADN de plásmido dirigido
6 de agosto de 2019
Este trabajo presenta la preparación de copolímeros de bloque biocompatibles funcionalizados de metionina (mBG) a través del método reversible de transferencia de cadena de adición-fragmentación (RAFT). También se investigó la capacidad de complejidad del ADN plásmido del mBG obtenido y su eficiencia de transfección. El método RAFT es muy beneficioso para la polimerización de monómeros que contienen grupos funcionales especiales.
Los portadores de fármacos poliméricos catiónicos tienen las ventajas de una buena estabilidad, baja inmunogenicidad y preparación y modificación fáciles. Aquí, ofrecemos un método rápido y simple para su síntesis. El método de polimerización de transferencia de cadena de fragmentación reversible es un método aplicable a polímeros de bloque de rendimiento con peso molecular controlado y estructura y grupos funcionales de transporte.
Estos portadores de fármacos pueden llevar simultáneamente diferentes medicamentos para lograr el tratamiento de la colaboración del cáncer, la inflamación y otras enfermedades. La polimerización IFT es un método clásico, y este protocolo da un ejemplo de su aplicación en la terapia génica. La clave del éxito para la síntesis de este polímero es controlar con precisión la temperatura de reacción.
Es más aconsejable utilizar un baño de aceite que un baño de agua. Para comenzar este procedimiento, obtenga un matraz de fondo redondo con un tapón de goma y un agitador magnético que se utilizará como botella de polimerización. Disolver 1,87 gramos de BIS-hidroxi HEMA en un mililitro de agua destilada en la botella de polimerización.
En un vaso de precipitados de cinco mililitros, disolver 0,03 gramos de CTP y 0,02 gramos de ACVA en 0,5 mililitros de 1, 4-dioxano. Añadir esta mezcla a la botella de polimerización. A continuación, utilice una trampa de condensado para congelar la solución en la botella de polimerización.
Fije el frasco al soporte de hierro y utilice un conducto tropezado con una aguja para aspirar e inyectar nitrógeno en la mezcla de reacción. A continuación, selle la botella de polimerización y descongele la solución a temperatura ambiente durante 30 minutos. Repita este ciclo de congelación-bomba-descongelación tres veces.
Después de esto, coloque la botella en un baño de aceite a 70 grados centígrados y deje que la solución reaccione durante 24 horas bajo la atmósfera de nitrógeno. Al día siguiente, enfríe la botella de polimerización a cero grados Celsius y abra el tapón de goma para terminar la reacción de polimerización. A continuación, preenfriar la acetona en un refrigerador a 20 grados Celsius negativos durante dos horas, y mezclarlo con la solución de reacción en la botella de polimerización en una proporción de 50 a uno.
Centrifugar esta mezcla a 8.200 veces g durante 10 minutos para eliminar la acetona y recoger el precipitado. Para purificar el heMA de poli bishidy sintetizado, disolver el precipitado recogido en dos mililitros de agua pura. Luego, mezcle con 100 mililitros de acetona preenfriada en una proporción de uno a 50.
Centrifugar la solución a 8.200 veces g durante 10 minutos para recoger el precipitado. Repita este proceso de purificación de disolver, mezclar y centrifugar el precipitado tres veces. En primer lugar, disolver 0,96 gramos de APMA y 0,93 gramos del HEMA poli bishidróxi purificado en cinco mililitros de agua destilada en un vaso de precipitados de 10 mililitros.
Disolver 0,01 gramos de ACVA en 0,5 mililitros de 1, 4-dioxano, y añadirlo a la solución APMA y poli bishidróxi HEMA. Transfiera esta mezcla a una botella de polimerización y ventile con nitrógeno seco durante una hora. Luego, coloque la botella de polimerización en un baño de aceite a 70 grados centígrados, y deje que reaccione durante 24 horas bajo la atmósfera de nitrógeno.
Al día siguiente, enfríe la botella de polimerización a cero grados Celsius y abra el tapón de goma para terminar la solución del proceso de polimerización. Para empezar, siembra células MCF-7 en los pozos de una placa de seis pozos a una densidad de 20.000 células por pozo. Cultivo de las células en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 12 horas.
Después de esto, reemplace el medio de cultivo con el medio de cultivo fresco que contiene polímero catiónico y poliplexios poliplexes de pDNA de diferente proporción de relaciones nitrógeno-fósforo. Escarúrlas durante seis horas, y luego reemplace el medio con dos mililitros de rpm 1640 medio fresco. Continúe cultivando durante 48 horas.
Luego, recoja las células y utilice un citómetro de flujo para detectar la fluorescencia verde. En este estudio, los copolímeros de bloques biocompatibles funcionalizados por metionina se preparan a través del método de transferencia de cadena de fragmentación de adición reversible, y se investiga la capacidad de complejo de ADN plásmido del mBG obtenido y su eficiencia de transfección. El tamaño medio de partícula y el potencial zeta de los poliplexes mBG/pDNA son 124 nanómetros y más 15,7 milivoltios, respectivamente, con una relación N-P de 16.
El retardo electroforético revela que el pDNA con una relación N-P de cero puede moverse sin restricciones en el gel de agarosa y se observa como una raya en el imágenes de gel. Cuando el pDNA se compleja con mBG, el movimiento de pDNA se retrasa, y posteriormente, el brillo de la banda se reduce. Esto muestra que el mBG puede complejo completamente el pDNA cuando el N a P es más alto que cuatro.
La citotoxicidad de los poliplexes mBG/pDNA se mide utilizando el ensayo estándar de MTT Estos resultados muestran que los poliplexes mBG/pDNA tienen citotoxicidad que los poliplexes PEI/pDNA en las relaciones N-a-P de cuatro, ocho, 16 y 32. Como también se puede ver, la citotoxicidad de los poliplexes mBG/pDNA aumenta con una mayor relación N-P. Este aumento de la citotoxicidad es el resultado del componente GPMA cargado positivamente.
La relación N-P utilizada en el experimento de transfección de ADNF se selecciona de acuerdo con los resultados de la citotoxicidad. Las capacidades de transfección de mBG1, mBG2 y mBG3 se comparan midiendo la intensidad de fluorescencia GFP, y los resultados mostraron que mBG3 es el portador de genes óptimo. Es importante agotar el aire del matraz de fondo redondo del limo y mantener la temperatura de reacción.
Los portadores de fármacos de polímeros obtenidos se pueden aplicar a la co-entrega de medicamentos de quimioterapia y medicamentos genéticos para tratar sinérgicamente el cáncer farmacorresistente. El mecanismo molecular de la combinación de fármacos genéticos y medicamentos quimioterápticos se puede explorar más a fondo para el tratamiento de tumores farmacorresistentes. La acetona se clasifica como baja tóxica por su toxicidad aguda.
Deben evitarse las llaves, la inhalación o el contacto con los ojos o la piel. Evitar el riesgo de escaldación durante el procedimiento de calentamiento.
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Descripción general
Este estudio presenta un método rápido y sencillo para sintetizar portadores poliméricos catiónicos de fármacos utilizando el método de polimerización por transferencia de cadena reversible por adición-fragmentación (RAFT). Los copolímeros en bloque biocompatibles funcionalizados con metionina (mBG) sintetizados fueron evaluados por su capacidad para formar complejos con ADN plasmídico y por su eficiencia de transfección.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Química de polímeros
- Terapia génica
- Sistemas de administración de fármacos
Antecedentes
- Los polímeros catiónicos como vehículos de fármacos ofrecen estabilidad y baja inmunogenicidad.
- La polimerización RAFT permite un control preciso del peso molecular y de la estructura.
- Estos vehículos pueden transportar múltiples fármacos para un tratamiento conjunto.
- El control preciso de la temperatura de reacción es crucial para una síntesis exitosa.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para sintetizar copolímeros en bloque biocompatibles.
- Investigar la capacidad de formación de complejos con ADN de los polímeros sintetizados.
- Evaluar la eficiencia de transfección de los vehículos de fármacos.
Métodos Utilizados
- Polimerización por transferencia de cadena por adición-fragmentación reversible (RAFT).
- Síntesis de copolímeros en bloque funcionalizados con metionina.
- Evaluación de la capacidad de complejación con ADN plasmídico.
- Evaluación de la eficiencia de transfección.
Resultados principales
- El mBG sintetizado demostró una complejación eficaz del ADN plasmídico.
- Se evaluó con éxito la eficiencia de transfección.
- La polimerización RAFT resultó beneficiosa para la síntesis de polímeros funcionalizados.
- El método permite la administración simultánea de múltiples fármacos.
Conclusiones
- El estudio desarrolló con éxito un método para sintetizar mBG.
- Estos polímeros biocompatibles muestran potencial para aplicaciones en terapia génica.
- Investigaciones futuras podrían mejorar su eficacia en la administración de fármacos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este trabajo presenta un método basado en la polimerización RAFT para sintetizar copolímeros en bloque biocompatibles funcionalizados con metionina, capaces de formar complejos con ADN plasmídico, ofreciendo una plataforma ajustable para el desarrollo de vectores de entrega génica. La capacidad de controlar el peso molecular, la relación de cargas y el tamaño de las partículas permite un diseño predecible de vehículos no virales con citotoxicidad reducida en comparación con el PEI, lo que facilita la reducción temprana de riesgos en terapias con ácidos nucleicos. Dichos sistemas responden a la necesidad de una síntesis polimérica escalable y reproducible en flujos de trabajo de descubrimiento preclínico, donde la claridad mecanicista y la consistencia en la formulación influyen en las decisiones de continuar o descartar un proyecto.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de las interacciones polímero-ADN mediante la cuantificación de la complejación en relaciones N/P definidas, apoyando la validación de objetivos mediante la entrega controlada de genes.
- Valor operativo: Proporciona una ruta de síntesis reproducible para copolímeros en bloque catiónicos con funcionalización ajustable de metionina y guanidina, reduciendo la variabilidad en ensayos de cribado iniciales.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera poliplexos bien definidos con potencial zeta medible (+15,7 mV a N/P 16) y tamaño (124 nm), lo que permite la evaluación estandarizada de la eficiencia de transfección y la citotoxicidad.
- Valor operativo: Facilita el cribado de alto rendimiento de variantes de polímeros (mBG1, mBG2, mBG3) al vincular el contenido de APMA (21 %, 37 %, 52 %) con resultados funcionales en ensayos de transferencia génica.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Demuestra la retención completa del ADN plasmídico a N/P >4, lo que indica una protección confiable del material genético, un punto de referencia clave en estudios preclínicos para evaluar la estabilidad del vector.
- Valor operativo: Permite el cribado de formulaciones a diferentes relaciones N/P (8, 16, 4) para identificar condiciones óptimas de transfección, al tiempo que se monitorean las tendencias de citotoxicidad asociadas al contenido de GPMA.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir la síntesis de vectores génicos definidos para la identificación de compuestos prometedores en la entrega de ácidos nucleicos, donde las relaciones estructura-función de los polímeros orientan las decisiones de avance.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre la entrega polimérica de genes al proporcionar resultados cuantificables (tamaño de partículas, potencial zeta, eficiencia de transfección) que permiten correlacionar la estructura con la actividad biológica.
- Selección: Permite la producción de poliplex listos para ensayos con tamaño constante (100–200 nm a N/P 16–32) y carga superficial, mejorando la reproducibilidad en campañas de evaluación de compuestos.
- Análisis: Genera lecturas biofísicas medibles (relación N/P, potencial zeta, retardo electroforético) que permiten el análisis comparativo de variantes poliméricas en condiciones estandarizadas.
- Investigación Traductiva: Vincula el diseño polimérico con relevancia preclínica mediante la demostración de la complejación de pDNA y una citotoxicidad reducida en comparación con PEI, apoyando el avance ajustado al riesgo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma modular basada en RAFT adaptable a otros aminoácidos funcionales u otros terapéuticos, promoviendo la estandarización entre proyectos en la síntesis de polímeros.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en el rendimiento de los vectores genéticos al vincular el diseño molecular (contenido de metionina/guanidina) con la unión al ADN y los resultados de transfección.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo de síntesis escalable y favorable para la purificación mediante precipitación con acetona y control RAFT, mejorando la consistencia entre lotes.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en fases avanzadas al ofrecer una alternativa de menor citotoxicidad frente al PEI, permitiendo decisiones más sólidas sobre continuidad o descarte en el desarrollo de terapias con ácidos nucleicos.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de polímeros candidatos (por ejemplo, mBG3 como vector óptimo) basada en la eficiencia de transfección y los perfiles de seguridad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la polimerización RAFT, incluyendo desgasificación por congelación-aspiración-descongelación y manipulación bajo atmósfera inerte.
- Depende del control preciso de la temperatura (baño de aceite a 70 °C) y de reactivos especializados (ACVA, CTP) para la síntesis reproducible de copolímeros en bloque.
- Necesita infraestructura analítica para GPC, potencial zeta, determinación del tamaño de partículas y ensayos de transfección basados en fluorescencia para evaluar el rendimiento de los polipléjidos.
- La adaptación a otras líneas celulares o cargas puede requerir una reoptimización de la relación N/P y la evaluación de citotoxicidad debido a los efectos variables mediados por GPMA.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de purificación en múltiples pasos y la sensibilidad al oxígeno durante la polimerización, lo cual debe mitigarse mediante protocolos rigurosos de desgasificación.
