Name: Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprenda a cuantificar trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT, un software automatizado para análisis de imágenes de inmunofluorescencia. Esta herramienta permite obtener resultados consistentes y sin sesgos en estudios de inmunología.

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El trabajo fue financiado por la Fundación Crafoord (TM y PN), la beca sueca de investigación gubernamental (PN, TM), el Consejo de Investigación Sueco (PN) y la Fundación Groschinsky (TM, PN).

El comité de ética de la Universidad de Lund aprobó la recolección de sangre venosa de voluntarios sanos de acuerdo con la Declaración de Helsinki (2013/728). Todos los voluntarios proporcionaron su consentimiento informado por escrito.
1. Aislamiento de neutrófilos de sangre periférica usando Centrifugación Density-Gradient
<ol><li>Recoger sangre venosa humana en tubos que contienen heparina y permitir que los tubos alcancen la temperatura ambiente. Nota: Se requiere un mínimo de 16 ml de sangre de un donante sano para producir un pellet de células suficientemente grande.</li>
	<li>Mezclar la sangre con un volumen de 2% de dextran en solución salina (0,9% NaCl) y dejar sedimentar a temperatura ambiente durante 30 minutos en un tubo de centrífuga cónica estéril de 50 ml.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante en un tubo de centrífuga cónica estéril de 50 ml y centrífuga a 200 x g durante 10 min a 4 oC.</li>
	<li>A partir de este paso, continúa el aislamiento a 4oC o sobre hielo.</li>
	<li>Resuspender el pellet en 5 ml de salina helada y capa en la parte superior de 5 ml de gradiente de aislamiento de leucocitos (9,1% diatrizoato de sodio con 5,7% de dextran, p/v) en un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 ml.</li>
	<li>Centrífuga durante 30 min a 400 x g a 4oC.</li>
	<li>Aspira rinde al sobrenadante y deséchalo.</li>
	<li>Lyse glóbulos rojos mediante la reanimación del pellet en 3 ml de agua helada durante 30 s. Añadir inmediatamente 1 mL de 3.6% NaCl y luego llenar con 10 mL de salina fría de hielo.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular durante 10 min a 350 x g.</li>
	<li>Retire el sobrenadante, recoja el pellet celular y resuspenderlo en 1 ml de salina. Reservar 10 l en un tubo de microcentrífuga para la evaluación del número de celda y la viabilidad utilizando el azul de tripa en una cámara de B-rker.</li>
	<li>Añadir 10 sl de suspensión celular a 90 ml de solución azul trypan al 0,4%. Tomar 10 l de la suspensión de la célula en una cámara de B-rker. Cuente las celdas en los 4 cuadrados enlazados por 3 líneas en cada esquina de la cámara. Las células que aparecen de color azul oscuro a la suanada de tinte no son viables, excluyémoslas del número total de células.</li>
	<li>Exprese el número de celda como celdas/ml según lo definido por la ecuación siguiente. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58528/58528eq1.jpg"> Nota: Aquí el factor de cámara era 10.000, el factor de dilución era 10 y el número total de cuadrados era 4.</li>
	<li>Diluir la suspensión de celda restante a 10 ml para un paso de lavado final.</li>
	<li>Centrífuga durante 5 min a 200 x g.</li>
	<li>Resuspender los neutrófilos en RPMI-1640 con albúmina sérica humana (HSA) inactivada por calor de 2 mg/ml a una concentración de 5 x 105 células/ml.</li>
</ol>2. Preparación de Coverslips y Estimulación de Neutrófilos
<ol><li>Coloque un cubreobjetos (10 mm, #1) en cada pocal de una placa de 12 pocillos y cubra el cubreobjetos añadiendo 200 ml de solución de poli-l-lisina al 0,01% y déjelo a 37 oC durante la noche.</li>
	<li>Lave los cubreobjetos con solución salina tampón de fosfato de 300 l (PBS) una vez y déjelo secar.</li>
	<li>Añadir 400 éL de 5 x 105 neutrófilos/ml a cada pocil e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
	<li>Mover la placa que contiene neutrófilos a una incubadora a 37 oC con 5% deCO2 durante 15 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante. Añadir 400 l de medio RPMI-1640 precalentado con 2 mg/ml de HSA a los controles. Añadir 300 l de RPMI precalentado con 20 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) para la estimulación.</li>
	<li>Estimular los neutrófilos durante 150 min a 37 oC con 5% co2.</li>
</ol>3. Visualización de NETs
<ol><li>Retire el sobrenadante y lave las muestras 2 veces con 200 s de PBS.</li>
	<li>Corrija las muestras añadiendo 200 s de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS durante 20 min a 37 oC. Nota: La PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado.</li>
	<li>Las muestras de lavado 3 x con 200 ml de PBS.</li>
	<li>Permeabilizar las muestras añadiendo 50 sL de 0.5% Triton X-100 para 30 s.</li>
	<li>Lave las muestras 3 veces con 200 ml de PBS.</li>
	<li>Bloquear las muestras con un 5% de suero de cabra en PBS durante 1 h a 37 oC.</li>
	<li>Añadir 300 ml de elastasa de neutrófilos antihumanosa de conejo primario en solución de bloqueo a una dilución de 1:500 durante 90 min a 37 oC.</li>
	<li>Lave las muestras 3 veces con 300 s de PBS.</li>
	<li>Añadir 300 ml de anticuerpo fluorescente anticonejo de cabra secundario a una dilución de 1:1000 durante 90 min a 37 oC.</li>
	<li>Lavar los cubreobjetos 3x con 300 sl de PBS.</li>
	<li>Retire los cubreobjetos de los pozos y monte el cubreobjetos con un medio de montaje de 10 l que contenga DAPI. Conservar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad para secar las muestras. Nota: La tinción de ADN con DAPI es sin duda un paso crítico en el método. Los usuarios también pueden solucionar problemas mediante la adición de una solución de DAPI exógena en un rango de concentración final de 0,1 u20120,5 g/ml durante 2 u20123 min, seguido de 3 pasos de lavado con 300 ol pbS.</li>
	<li>Adquiera imágenes con un microscopio de fluorescencia de campo ancho utilizando un objetivo 20X.</li>
</ol>4. Análisis y cuantificación de NETs utilizando NETQUANT
Nota: NETQUANT se puede descargar haciendo clic en el archivo de instalación que se encuentra en el archivo Zenodo Github o en el sitio web de Nordenfelt Lab (<a href="https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34" target="_blank">https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34</a>).
<ol><li>Importación de conjuntos de datos para análisis, nomenclatura de canales y conversión de imágenes
	<ol>
<li>Abra la pestaña Configuración en NETQUANT.</li>
		<li>Elija la carpeta de origen para el análisis haciendo clic en la opción Obtener ruta en el menú de origen y seleccione la carpeta que contiene las secuencias de imágenes que se van a analizar.</li>
		<li>Haga clic en la opción Obtener ruta en el menú de destino y seleccione la carpeta para guardar los datos después del análisis de imagen.</li>
		<li>Nombre los canales de modo que "canal de ADN" se corresponda con la tinción de ADN(por ejemplo,ADN o DAPI) y "canal NET" representa la tinción de proteína ligada a LA RED(porejemplo, NET, elastasa de neutrófilos) en las imágenes. Para el buen funcionamiento del software, (recomendado) nombre la carpeta que contiene los archivos de imagen de control como "control". Nota: El canal NET hace referencia únicamente a la tinción del marcador de proteína de gránulo enlazado a NET.</li>
		<li>Alimentar los metadatos de la imagen en el software haciendo clic en el botón Cargar información de imagen en el submenú Información de imagen.</li>
		<li>Seleccione el orden de canal correcto contenido en las imágenes en el submenú Orden de canal. Esta opción se ha incluido como a prueba de fallos para evitar discrepancias accidentales.</li>
		<li>Adquiera propiedades de imagen principal de los datos sin procesar y convierta las imágenes haciendo clic en el botón Preparar datos. Las imágenes convertidas aparecen en el submenú Tipo de ejemplo. Haga clic en el menú Tipo de ejemplo para mostrar y seleccionar todos los conjuntos de datos adquiridos para su análisis.</li>
		<li>Seleccione una imagen del submenú Tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para mostrar las imágenes divididas en el canal DNA y NET respectivamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Segmentación de células en el canal de ADN y el canal NET
	<ol>
<li>Seleccione el método de segmentación haciendo clic en el submenú Método en el canal de ADN y el canal NET. Nota: El método predeterminado de segmentación se establece en adaptativo y es la configuración recomendada. Otras opciones también están disponibles, incluyendo global, edge y Chan-Vese. También se incluye una opción de cuenca hidrográfica para ayudar a distinguir entre células o NET colocadas de cerca.</li>
		<li>Introduzca la pestaña Segmentación para segmentar las celdas de control primero en ambos canales haciendo clic en la opción Muestras de control de segmento.</li>
		<li>Seleccione PMA en el submenú de tipo de muestra y haga clic en la opción Lote (recomendado) para comenzar la segmentación de todas las imágenes incluidas en el conjunto de datos. Seleccione las imágenes en el menú de tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para visualizar y validar las máscaras de imagen binarias (máscara de ADN y máscara NET) generadas después de la segmentación.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de una sola celda de propiedades identificables
	<ol>
<li>Introduzca la pestaña de análisis y analice las muestras de control haciendo clic en el botón Determinar umbral.</li>
		<li>Cambie el tipo de muestra a PMA y haga clic en el botón Obtener propiedades de celda para completar el análisis de muestras estimuladas.</li>
		<li>Seleccione una imagen del submenú Tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para mostrar la superposición y el número de celdas y celdas de formación de REDES en la imagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Comparación de propiedades de celda para identificar celdas formadoras de NET
	<ol>
<li>Seleccione la muestra del submenú de tipo de muestra y haga clic en el botón Analizar NET para completar el análisis. Las imágenes individuales se pueden seleccionar en el submenú de tipo de muestra para el análisis o se puede analizar todo el lote de imágenes seleccionando la opción de lote (recomendado).</li>
		<li>Ajuste los criterios de NET manualmente para obtener resultados óptimos para una muestra determinada. Compare los NET identificados con las imágenes originales para evaluar la calidad de la identificación. Nota: Los criterios de NET se pueden utilizar en todas las imágenes del conjunto de datos. Cualquier cambio en los criterios de NET se aplica simultáneamente en todos los ejemplos de control. Esto limita la posibilidad de cualquier diferencia potencial que pueda surgir debido al exceso de ajuste de los parámetros de NET. La configuración de los criterios NET se puede ajustar según los requisitos del usuario. La relación entre las tasas de detección falsas y NETQUANT se ha explorado anteriormente13. Los rangos típicos para el aumento de área son de 2 u20124, la circularidad será de 0,7 u20120.9 y la relación ADN/NET será de 0,6 a 2,0.</li>
		<li>Inspeccione el resumen de datos en el submenú Datos de celda donde se muestra nifique el número de imágenes, el número de celdas por imagen y el porcentaje de NET por imagen. Nota: El porcentaje total de NET en todo el conjunto de datos se muestra mediante el "indicador NET". El recuento total de imágenes, el recuento de celdas, el porcentaje de NET en la muestra (NET%) y NETs% en el ejemplo de control se muestran en la tabla de estadísticas de resumen debajo del indicador NET. Recomendamos que los datos de control se notifiquen junto con los datos obtenidos de muestras estimuladas.</li>
	</ol></li>
	<li>Resultados de resultados
	<ol>
<li>Introduzca la pestaña Salida para seleccionar y ver las salidas de resultados.</li>
		<li>Explore y compare las diversas salidas de datos generadas a partir del análisis de control y PMA seleccionando la forma de la salida y haciendo clic en el botón Resultados de salida. Nota: Todos los datos generados después del análisis para controles y estimulaciones se guardan en la carpeta de análisis como se selecciona en el submenú de destino. Los datos se guardan en formatos .csv o .pdf.</li>
		<li>Inicie el archivo Method para obtener la versión del software y los criterios de NET utilizados para el análisis (que se incluirán en la sección de métodos con fines de publicación).</li>
		<li>Haga clic en la tabla De resultados para visualizar los puntos de datos individuales de una muestra determinada.</li>
		<li>Visualice la distribución del área NET y la relación DNA:NET en las muestras. La línea roja indica el valor de umbral en los gráficos.</li>
		<li>Determine el área NET frente a la forma del ADN haciendo clic en el archivo de distribución Bivariate.</li>
	</ol></li>
	<li>Carga de análisis anteriores y todos los pasos de lote
	<ol>
<li>Cargue la configuración de análisis previamente correcta en NETQUANT mediante el botón Cargar análisis anterior.</li>
		<li>Utilice el botón Lote todos los pasos incluidos en el menú Configuración para ejecutar los pasos 5-u201212(Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5) directamente para obtener la salida final.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at work.</a> Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).</li>
<li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li>
<li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Sorensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+-+the+dark+side+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis%3A+how+vital+is+it%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NETosis: how vital is it?</a> Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Mohanty, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+for+NETosis+provides+antimicrobial+defense+at+the+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa.</a> Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).</li>
<li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).</li>
<li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+determination+of+NET+%28neutrophil+extracellular+traps%29+coverage+in+fluorescent+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images.</a> Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).</li>
<li>Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETQUANT%3A+Automated+Quantification+of+Neutrophil+Extracellular+Traps%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1999(2017).</li>
<li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+double-edged+swords+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li>
<li>Cedervall, J., Olsson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+Gone+Astray+-+NETs+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunity Gone Astray - NETs in Cancer.</a> Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).</li>
<li>Ginley, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+detection+and+quantification+of+human+and+mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17755(2017).</li>
</ol>

TM y PN tienen una patente pendiente relacionada con los algoritmos utilizados en NETQUANT.

La formación NET es una adición relativamente reciente al diverso armamentario de neutrófilos4 y ha habido una notable oleada de interés para estudiar la implicación de los NETs en una amplia gama de áreas de investigación5,7,14,15. La adquisición de imágenes mediante microscopía de inmunofluorescencia y la cuantificación posterior basada en imágenes es un método ampliam...

Los neutrófilos son mediadores cruciales de las respuestas de defensa innatas del huésped contra una amplia variedad de patógenos microbianos1. Ejecutan sus funciones antimicrobianas liberando sus gránulos que contienen una amplia gama de proteínas antimicrobianas2,produciendo especies reactivas de oxígeno (ROS) e hipoclorito1,y a través de fagocitosis3. Además, Brinkmann et al. 4 describió las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) como un mecanismo novedoso por el cual los neutrófilos atrapan y eliminan los patógenos invasores. Desde su descubrimiento hace poco más de una década4, los NETs se han implicado en una amplia variedad de infecciosos5,6 y no infeccioso7 morbilidades. La formación de REDES es un proceso activo y da como resultado la extrusión de ADN de cromatina recubierto con proteínas antimicrobianas derivadas de gránulos8. Algunos de los cambios clave en la morfología celular y nuclear asociados con la formación de REDES incluyen la pérdida de morfología nuclear, la descondensación de cromatina, la movilización de proteínas de gránulos desde el citoplasma al núcleo y un aumento en el diámetro nuclear y celular8,9.
Los NET similares a la web, que pueden aparecer como estructuras difusas ligeramente más grandes que la célula o como estructuras varias veces más grandes que un solo neutrófilo se consideran indicadores de NETosis5,10. Mediante la microscopía de fluorescencia, las NET se pueden detectar sondeando el ADN con una sonda fluorescente como 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y por la tinción de inmunofluorescencia contra proteínas ligadas a redes netasas como la aslastasa de neutrófilos. La cuantificación de áreas superpuestas de tinción para ADN y proteínas ligadas a REDES determina el área total bajo NETs en una imagen11.
Hay varias opciones de análisis de imágenes disponibles para realizar la cuantificación basada en imágenes por fluorescencia de los NET11,12. Pero estas opciones de software presentan limitaciones para no ser fáciles de usar y/ o totalmente automatizados. En este artículo, demostramos el funcionamiento de NETQUANT13, una aplicación de libre disponibilidad que puede realizar una cuantificación NET basada en imágenes basada en imágenes de microscopía de inmunofluorescencia totalmente automatizada imparcial. La aplicación tiene una interfaz gráfica fácil de usar (GUI) y puede realizar análisis de una sola célula. El software cuantifica la NETosis en una imagen mediante la detección de los cambios morfológicos en el área del marcador enlazado a LA RED de ADN, la deformación asociada a la descondensación de cromatina del núcleo y el aumento de la relación de proteínas enlazadas dnalo:NET. En conjunto, los múltiples criterios de definición de NET permiten una cuantificación estricta de NET en varios conjuntos de datos de forma imparcial.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Tubos de plástico heparinizados</td><td>BD Biosciences</td><td>367885</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield</td><td>114547</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 con L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Matraces cónicos de 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>Matraces cónicos de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Tejido de 12 pocillos placas de cultivo</td><td>Falcon</td><td>10626491</td><td></td></tr><tr><td>#1 Cubreobjetos 10mm</td><td>Menzel Glaser</td><td>CS10100</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Menzel Glaser</td><td>631-0098</td><td></td></tr><tr><td>Elastasa primaria antihumana</td><td>DAKO DAKO</td><td>conejo 1373, inmunización</td><td></td>por contrato</tr><tr><td>Fluoróforo secundario conjugado anti-conejo de cabra Life</td><td>technologies</td><td>A-11072, A-11070</td><td></td></tr><tr><td>PROLONG-Gold Reactivo antidecoloración con tecnologías DAPI</td><td>Life</td><td>P36930</td><td>Medio de montaje</td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-E Microscopio de epifluorescencia</td> Cámara CCD <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Andor Zyla</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apochromat 20x, 40x</td><td>objetivos Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows 10</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Sistema operativo</td></tr><tr><td>macOS Sierra 10.12</td><td>Apple</td><td></td><td>Sistema operativo</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante netquant

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras antimicrobianas similares a la web que consisten en proteínas antimicrobianas derivadas del ADN y del gránulo. La microscopía de inmunofluorescencia y los métodos de cuantificación basados en imágenes siguen siendo herramientas importantes para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos. Sin embargo, existen limitaciones clave en los métodos basados en la inmunofluorescencia que actualmente están disponibles para cuantificar los NET. Los métodos manuales de cuantificación de NET basada en imágenes suelen ser subjetivos, propensos a errores y tediosos para los usuarios, especialmente los usuarios no experimentados. Además, las opciones de software disponibles actualmente para la cuantificación son semiautomáticas o requieren capacitación antes de la operación. Aquí, demostramos la implementación de un método automatizado de cuantificación de imágenes basado en inmunofluorescencia para evaluar la formación NET denominada NETQUANT. El software es fácil de usar y tiene una interfaz gráfica de usuario (GUI) fácil de usar. Considera parámetros biológicamente relevantes como un aumento en la superficie y la relación de proteína de marcador DNA:NET, y la deformación nuclear para definir la formación de NET. Además, esta herramienta se construye como una aplicación de libre disposición, y permite la cuantificación y el análisis de la resolución de una sola celda.

5 x 105 neutrófilos/ml fueron sembrados sobre los cubreobjetos colocados en una placa de 12 pocillos y estimulados con PMA de 20 nM o sin estimular durante 150 min. Las muestras se teñían entonces utilizando anticuerpos primarios anti-humanos neutrófilos elastasa, anticuerpos conjugados secundarios con fluoróforo anticonejo de cabra y DAPI - un tinte fluorescentemente etiquetado que mancha el ADN (Ver la Tabla de Materiales para más detalles). A continuación, s...

Aquí, presentamos un protocolo para generar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y operar NETQUANT, una opción de software totalmente automática para la cuantificación de NETs en imágenes de inmunofluorescencia.

Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Aquí presentamos NETQUANT, un enfoque totalmente automatizado para cuantificar NETS y las imágenes de inmunofluorescencia. Esto ayudará a los investigadores a realizar análisis de imágenes comparables a partir de datos generados por múltiples usuarios y condiciones. Las ventajas de esta técnica son la facilidad de uso, el análisis de datos de una sola célula, múltiples criterios para evaluar la formación de NET y un análisis imparcial de varias imágenes.Instale y abra el software de análisis. Se puede encontrar una versión actualizada en el archivo GitHub de Zenodo o en el sitio web de Nordonfelt Lab. En la pestaña de configuración, elija una carpeta de origen para el análisis haciendo clic en la opción obtener ruta en el menú de origen.Seleccione la carpeta que contiene las secuencias de imágenes que se van a analizar. Una vez más, haga clic en la opción obtener ruta en el menú de destino y seleccione la carpeta de destino para guardar los datos después del análisis de imagen. A continuación, cuando utilice imágenes de canal separadas, asigne un nombre a las carpetas del canal para que el canal de ADN se corresponda con la mancha de ADN nuclear, y el canal NET representa la mancha de elastasa de neutrófilos en las imágenes.Además, asigne un nombre a la carpeta que contiene los archivos de imagen de control como control. A continuación, haga clic en el botón cargar información de imagen y cargue los metadatos de la imagen en el software. A continuación, en el submenú Orden de canal, seleccione el orden de canal correcto contenido en las imágenes.Esto ayuda a evitar desajustes accidentales. Ahora haga clic en el botón preparar datos para adquirir las propiedades de imagen primarias de los datos sin procesar y convertir las imágenes. Las imágenes convertidas aparecerán en el submenú Tipos de muestra.Haga clic en el menú de tipo de muestra, seleccione una imagen del submenú y haga clic en mostrar los datos de la imagen para mostrar las imágenes divididas en el ADN y Neutrophil Trampa extracelular, o canal NET, respectivamente. Para segmentar las celdas en sus respectivos canales, seleccione la pestaña Método de segmentación y seleccione un método en el submenú del método para los canales DNA y NET. El método predeterminado de segmentación se establece en adaptable y es la configuración recomendada.Otras opciones están disponibles en el software, incluyendo borde global y chanverse. También se ha incluido una opción de cuenca hidrográfica para ayudar a distinguir entre células estrechamente colocadas o NEA. También en la pestaña de segmentación, haga clic en la opción de muestras de control de segmento.A continuación, seleccione PMA en el submenú de tipo de muestra y haga clic en la opción de lote para comenzar la segmentación de todas las imágenes incluidas en el conjunto de datos. A continuación, seleccione las imágenes en el menú de tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para visualizar y validar las máscaras de imagen binaria para las máscaras de ADN y NET generadas después de la segmentación. Ahora, en la pestaña de análisis, haga clic en el botón determinar umbral para analizar las muestras de control.Luego, en el lado derecho, cambie el tipo de muestra a PMA y haga clic en el botón Obtener propiedades de celda para completar el análisis de las muestras estimuladas. A continuación, seleccione una imagen del submenú Tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para mostrar la superposición y el número de celdas y celdas de conformar mosquio en la imagen. Comience seleccionando la muestra en el submenú Tipo de muestra.Las imágenes individuales se pueden seleccionar en el submenú de tipo de muestra para el análisis o se puede analizar todo el lote de imágenes seleccionando la opción de lote. Una vez seleccionado, haga clic en el botón analizar NETs para completar el análisis. Ajuste los criterios de NET manualmente para obtener resultados óptimos para una muestra determinada.Compare los NT identificados con las imágenes originales para evaluar la calidad de la identificación. Una vez completado este paso, los criterios de NET se pueden aplicar a todas las imágenes del conjunto de datos. Los cambios realizados en los criterios de NET también se aplican simultáneamente a todos los ejemplos de control.Inspeccione el resumen de datos en el submenú de datos de celda, donde se muestra el número de imágenes, el recuento de celdas por imagen y el porcentaje de NIT por imagen. Introduzca la pestaña de salida para seleccionar y ver las salidas de resultados. Explore y compare las diversas salidas de datos generadas a partir del análisis de muestras de control y tratadas con PMA seleccionando la forma de la salida y haciendo clic en el botón de resultados de salida.A continuación, inicie el archivo CSV de la tabla de datos de resultados para explorar los datos de una sola celda y haga clic en los archivos PDF de resultados para visualizar la distribución del área NET y la relación DNA a NET en los ejemplos. La línea roja indica el valor de umbral en los gráficos. Por último, haga clic en el archivo de distribución bivariada de resultados para determinar el área NET frente a la forma del ADN.Aquí, se analizaron 15 imágenes de neutrófilos de control y 15 imágenes de neutrófilos estimulados por PMA en menos de diez minutos. Se contó el número total de células y se determinó el porcentaje de células con trampas extracelulares de neutrófilos utilizando el método de cuantificación automatizado descrito en este artículo. Estos resultados muestran que los neutrófilos estimulados por PMA tienen un área más grande, un aumento en la deformación nuclear y una relación ADN a NET más alta que las muestras de control.Cuando se combinan en un gráfico 3D, las muestras estimuladas por PMA tienden a mostrar áreas de agrupaciones de apriete que las muestras de control. Al intentar el procedimiento, es importante recordar que aunque el flujo de trabajo se probó con varios donantes, se recomienda que el usuario decida los parámetros de software adecuadamente en función del conjunto de datos individual.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video demuestra la inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs en neutrófilos premarcados utilizando suero del paciente que contiene anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilos. Además, el uso de un tinte de ADN impermeable y la microscopía de fluorescencia permite la visualización de los NET.

Inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos premarcados

Se describen métodos para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera y visualizar la formación neta en vivo neutrófilos mediante microscopía de fluorescencia. También se describe son protocolos para cuantificar la formación neta y citrulinado histona H3 (citH3) expresión usando microscopia de la inmunofluorescencia.

In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia

Este protocolo describe un ensayo de neutrófilos trampa extracelular (red) altamente sensible y de alto rendimiento para la cuantificación semiautomática de ex vivo red formación por microscopia confocal tridimensional de la inmunofluorescencia. Este protocolo puede utilizarse para evaluar la red formación y degradación después de diferentes estímulos y se puede utilizar para estudiar terapias potenciales orientada en la red.

Un análisis de alto rendimiento para evaluar y cuantificar la formación de neutrófilos trampa extracelular

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras tridimensionales generadas por granulocitos neutrófilos estimulados. En los últimos años ha quedado claro que los NET están implicados en una amplia variedad de enfermedades. La detección de NETs en el tejido puede tener relevancia diagnóstica, por lo que se requieren protocolos estandarizados para etiquetar los componentes NET.

Etiquetado de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y murinos en tejido incrustado por parafina

Aquí se presenta un protocolo para la inducción y análisis de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) in vitro . La cuantificación del ADN, la catelicidina (LL37) y la actividad enzimática arrojó datos que muestran la variabilidad en la composición y morfología de los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos en condiciones controladas similares.

Análisis morfológico y composicional de trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por estímulos microbianos y químicos

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) se asocian con diversas enfermedades, y la inmunofluorescencia se utiliza a menudo para su visualización. Sin embargo, existen varios protocolos de tinción y, en muchos casos, solo se examina un tipo de tejido. Aquí, establecemos un protocolo de aplicación general para la tinción de NET en tejido de ratón y humano.

Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Presentamos un método automatizado de alto rendimiento para cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) utilizando el sistema de análisis de células vivas, junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana.

Técnica de alto rendimiento en tiempo real para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos humanos

Este protocolo definido describe un enfoque de microscopía de alto rendimiento en tiempo real para visualizar y cuantificar la liberación de trampas extracelulares (NET) de neutrófilos humanos in vitro. El método reproducible permite la investigación de las características y la cinética de la liberación de NET tras la estimulación con distintos inductores de NETosis y permite la evaluación de la farmacología de los antagonistas de NETosis.

Cuantificación microscópica en tiempo real y de alto rendimiento de la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y evaluación de la farmacología de los antagonistas

Las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) es un importante mecanismo de inmunidad innata para luchar contra las bacterias patógenas, hongos y parásitos. A continuación se describen los métodos para aislar a los granulocitos neutrófilos de la sangre humana y para activarlos para formar NET. Se presentan las técnicas de preparación para visualizar NET en la microscopía óptica y electrónica.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

Se presenta un protocolo para la cuantificación y comparación concurrente de tres componentes celulares y extracelulares dentro de biofilms. La metodología implica el uso de microscopía de escaneo láser confocal, software de análisis y visualización estructural de biopelículas y software de análisis estadístico.

Cuantificación concurrente de componentes celulares y extracelulares de biofilms

Aprenda a cuantificar trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT, un software automatizado para análisis de imágenes de inmunofluorescencia. Esta herramienta permite obtener resultados consistentes y sin sesgos en estudios de inmunología.

Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT

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