Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT
27 de noviembre de 2019
Aquí, presentamos un protocolo para generar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y operar NETQUANT, una opción de software totalmente automática para la cuantificación de NETs en imágenes de inmunofluorescencia.
Aquí presentamos NETQUANT, un enfoque totalmente automatizado para cuantificar NETS y las imágenes de inmunofluorescencia. Esto ayudará a los investigadores a realizar análisis de imágenes comparables a partir de datos generados por múltiples usuarios y condiciones. Las ventajas de esta técnica son la facilidad de uso, el análisis de datos de una sola célula, múltiples criterios para evaluar la formación de NET y un análisis imparcial de varias imágenes.
Instale y abra el software de análisis. Se puede encontrar una versión actualizada en el archivo GitHub de Zenodo o en el sitio web de Nordonfelt Lab. En la pestaña de configuración, elija una carpeta de origen para el análisis haciendo clic en la opción obtener ruta en el menú de origen.
Seleccione la carpeta que contiene las secuencias de imágenes que se van a analizar. Una vez más, haga clic en la opción obtener ruta en el menú de destino y seleccione la carpeta de destino para guardar los datos después del análisis de imagen. A continuación, cuando utilice imágenes de canal separadas, asigne un nombre a las carpetas del canal para que el canal de ADN se corresponda con la mancha de ADN nuclear, y el canal NET representa la mancha de elastasa de neutrófilos en las imágenes.
Además, asigne un nombre a la carpeta que contiene los archivos de imagen de control como control. A continuación, haga clic en el botón cargar información de imagen y cargue los metadatos de la imagen en el software. A continuación, en el submenú Orden de canal, seleccione el orden de canal correcto contenido en las imágenes.
Esto ayuda a evitar desajustes accidentales. Ahora haga clic en el botón preparar datos para adquirir las propiedades de imagen primarias de los datos sin procesar y convertir las imágenes. Las imágenes convertidas aparecerán en el submenú Tipos de muestra.
Haga clic en el menú de tipo de muestra, seleccione una imagen del submenú y haga clic en mostrar los datos de la imagen para mostrar las imágenes divididas en el ADN y Neutrophil Trampa extracelular, o canal NET, respectivamente. Para segmentar las celdas en sus respectivos canales, seleccione la pestaña Método de segmentación y seleccione un método en el submenú del método para los canales DNA y NET. El método predeterminado de segmentación se establece en adaptable y es la configuración recomendada.
Otras opciones están disponibles en el software, incluyendo borde global y chanverse. También se ha incluido una opción de cuenca hidrográfica para ayudar a distinguir entre células estrechamente colocadas o NEA. También en la pestaña de segmentación, haga clic en la opción de muestras de control de segmento.
A continuación, seleccione PMA en el submenú de tipo de muestra y haga clic en la opción de lote para comenzar la segmentación de todas las imágenes incluidas en el conjunto de datos. A continuación, seleccione las imágenes en el menú de tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para visualizar y validar las máscaras de imagen binaria para las máscaras de ADN y NET generadas después de la segmentación. Ahora, en la pestaña de análisis, haga clic en el botón determinar umbral para analizar las muestras de control.
Luego, en el lado derecho, cambie el tipo de muestra a PMA y haga clic en el botón Obtener propiedades de celda para completar el análisis de las muestras estimuladas. A continuación, seleccione una imagen del submenú Tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para mostrar la superposición y el número de celdas y celdas de conformar mosquio en la imagen. Comience seleccionando la muestra en el submenú Tipo de muestra.
Las imágenes individuales se pueden seleccionar en el submenú de tipo de muestra para el análisis o se puede analizar todo el lote de imágenes seleccionando la opción de lote. Una vez seleccionado, haga clic en el botón analizar NETs para completar el análisis. Ajuste los criterios de NET manualmente para obtener resultados óptimos para una muestra determinada.
Compare los NT identificados con las imágenes originales para evaluar la calidad de la identificación. Una vez completado este paso, los criterios de NET se pueden aplicar a todas las imágenes del conjunto de datos. Los cambios realizados en los criterios de NET también se aplican simultáneamente a todos los ejemplos de control.
Inspeccione el resumen de datos en el submenú de datos de celda, donde se muestra el número de imágenes, el recuento de celdas por imagen y el porcentaje de NIT por imagen. Introduzca la pestaña de salida para seleccionar y ver las salidas de resultados. Explore y compare las diversas salidas de datos generadas a partir del análisis de muestras de control y tratadas con PMA seleccionando la forma de la salida y haciendo clic en el botón de resultados de salida.
A continuación, inicie el archivo CSV de la tabla de datos de resultados para explorar los datos de una sola celda y haga clic en los archivos PDF de resultados para visualizar la distribución del área NET y la relación DNA a NET en los ejemplos. La línea roja indica el valor de umbral en los gráficos. Por último, haga clic en el archivo de distribución bivariada de resultados para determinar el área NET frente a la forma del ADN.
Aquí, se analizaron 15 imágenes de neutrófilos de control y 15 imágenes de neutrófilos estimulados por PMA en menos de diez minutos. Se contó el número total de células y se determinó el porcentaje de células con trampas extracelulares de neutrófilos utilizando el método de cuantificación automatizado descrito en este artículo. Estos resultados muestran que los neutrófilos estimulados por PMA tienen un área más grande, un aumento en la deformación nuclear y una relación ADN a NET más alta que las muestras de control.
Cuando se combinan en un gráfico 3D, las muestras estimuladas por PMA tienden a mostrar áreas de agrupaciones de apriete que las muestras de control. Al intentar el procedimiento, es importante recordar que aunque el flujo de trabajo se probó con varios donantes, se recomienda que el usuario decida los parámetros de software adecuadamente en función del conjunto de datos individual.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo presenta NETQUANT, un software completamente automatizado diseñado para la cuantificación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) en imágenes de inmunofluorescencia. Esta herramienta tiene como objetivo facilitar un análisis de imágenes consistente en diversas condiciones de investigación.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunología
- Análisis de imágenes
Antecedentes
- Las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) desempeñan un papel crucial en la respuesta inmunitaria.
- La cuantificación de las NETs es esencial para comprender su función y sus implicaciones en diversas enfermedades.
- Los métodos existentes para la cuantificación de NETs pueden ser inconsistentes entre diferentes usuarios y condiciones.
- NETQUANT tiene como objetivo estandarizar este proceso mediante la automatización.
Objetivo del estudio
- Presentar un software fácil de usar para cuantificar las NET.
- Permitir a los investigadores realizar un análisis imparcial de múltiples imágenes.
- Facilitar el análisis de datos a nivel individual de células y la evaluación de la formación de NET.
Métodos Utilizados
- Instalación del software NETQUANT desde el archivo Zenodo en GitHub o desde el sitio web del Laboratorio Nordonfelt.
- Selección de la carpeta de origen para el análisis mediante la interfaz del software.
- Uso de múltiples criterios para evaluar la formación de NET.
- Procesamiento automatizado de imágenes de inmunofluorescencia para cuantificación.
Resultados Principales
- NETQUANT proporciona un enfoque optimizado para la cuantificación de NET.
- El software permite un análisis consistente en diferentes condiciones experimentales.
- Los investigadores pueden obtener resultados imparciales a partir de múltiples imágenes.
- El análisis de datos a nivel de célula individual mejora la comprensión de la formación de NET.
Conclusiones
- NETQUANT es una herramienta valiosa para investigadores que estudian las NET.
- El software mejora la fiabilidad del análisis de imágenes en estudios de inmunofluorescencia.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta herramienta para evaluaciones más precisas de fenómenos relacionados con las NET.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación automatizada basada en imágenes de las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) aborda un cuello de botella crítico en la investigación de inmunología y enfermedades inflamatorias al permitir un análisis objetivo y de alto rendimiento de la formación de NETs. Esta capacidad apoya la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en programas de descubrimiento de fármacos centrados en vías mediadas por neutrófilos, enfermedades inflamatorias y mecanismos de defensa del huésped. Al proporcionar datos con resolución a nivel de célula individual y criterios estandarizados para la identificación de NETs, NETQUANT mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos y facilita la colaboración entre equipos de inmunología, imagen y ciencia de datos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas relacionadas con las vías de NETosis y la función de los neutrófilos en modelos de enfermedad.
- Valor operativo: Proporciona parámetros biológicamente relevantes, como el aumento del área superficial, la relación proteína marcadora de NET:ADN y la deformación nuclear, para definir la formación de trampas extracelulares neutrófilas con resolución a nivel de una sola célula.
- Valor predictivo: Facilita la validación funcional de dianas al cuantificar la formación de trampas extracelulares en respuesta a estímulos como el PMA, permitiendo evaluar los efectos de compuestos sobre la liberación de trampas extracelulares por neutrófilos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Preparación del ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la generación de salidas cuantitativas estandarizadas a partir de imágenes de inmunofluorescencia.
- Reproducibilidad: Aborda limitaciones clave de los métodos manuales y semiautomáticos al ofrecer un análisis imparcial en múltiples usuarios y condiciones mediante la determinación automatizada de umbrales y el procesamiento por lotes.
- Escalabilidad: Permite la preparación para cribado y la reutilización de la plataforma mediante una aplicación de acceso gratuito con una interfaz gráfica de usuario fácil de usar que procesa secuencias de imágenes en menos de diez minutos para conjuntos de datos experimentales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Apoya la alineación translacional de biomarcadores mediante la cuantificación de la formación de ETN, un proceso implicado en enfermedades autoinmunes, metástasis del cáncer y trastornos trombóticos.
- Continuidad preclínica: Aborda decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar mediciones cuantitativas de variables dependientes (por ejemplo, porcentaje de células formadoras de ETN, distribución del área de ETN) que permiten la comparación entre muestras control y estimuladas.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Se centra en el valor predictivo de reducción de riesgos mediante el análisis multivariado del área de ETN frente a la forma del ADN, ayudando a esclarecer los mecanismos de acción en la selección de compuestos inmunomoduladores.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
NETQUANT se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial de dianas hasta la identificación de compuestos activos y el trabajo preclínico, especialmente en programas centrados en inmunología e inflamación donde la NETosis es un mecanismo fisiopatológico relevante.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la cuantificación automatizada de la formación de NET en respuesta a perturbaciones genéticas o farmacológicas.
- Tamizaje: Describe la preparación del ensayo mediante el procesamiento automatizado de imágenes de inmunofluorescencia, salidas cuantitativas y capacidades de análisis por lotes que aseguran la reproducibilidad entre condiciones experimentales.
- Análisis: Destaca mediciones como el número de células por imagen, el porcentaje de NET por imagen, la distribución del área de NET y la relación de ADN a NET, que ayudan a los equipos a comparar condiciones y evaluar los efectos de compuestos.
- Investigación Traducional: Conecta el método con la continuidad preclínica mediante el análisis del sistema relevante a enfermedades de la formación de NET, lo cual tiene implicaciones en sepsis, lupus y trombosis asociada al cáncer.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable en lugar de una técnica de uso único, con un software disponible gratuitamente que apoya la estandarización entre sitios y proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de la ambigüedad mecanicista en las vías de NETosis.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la cuantificación de NET basada en imágenes entre diferentes usuarios y sitios.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas en programas de desarrollo de fármacos enfocados en la inflamación.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en datos cuantitativos de formación de NET provenientes de modelos preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados necesarios en microscopía de inmunofluorescencia y principios de análisis de imágenes.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluyendo microscopía de fluorescencia y formatos de archivo de imagen compatibles.
- Requisitos de estandarización entre equipos para la denominación de canales, métodos de segmentación y aplicación de criterios de NET en muestras de control y estimuladas.
- Consideraciones de adaptación entre sistemas modelo, como neutrófilos humanos frente a murinos y diferentes condiciones de estimulación más allá de la PMA.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la documentación fuente: los usuarios deben elegir adecuadamente los parámetros del software según sus conjuntos de datos individuales, y la validación del flujo de trabajo puede requerir optimización para tipos celulares específicos o protocolos de tinción.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
0:34
Analysis and Quantification of Neutrophil Extracellular Traps (NETs)
2:19
Segmentation of Cells in the DNA Channel and the NET Channel
3:41
Single-cell Analysis of Identifiable Properties
4:19
Comparison of Cell Properties to Identify NET-forming Cells
5:23
Result Outputs Demeanor
6:16
Results: Analysis of NET Formation
7:07
Conclusion
