Name: Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a aislar, fijar y realizar inmunofluorescencia en glándulas suprarrenales de ratón. Esta técnica permite estudiar la zonación adrenal y la identidad celular preservando la morfología tisular.

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Damos las gracias por sus sugerencias y asistencia técnica en el establecimiento de este protocolo Dr. Mohamad Zubair. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón, institutos nacionales de salud Research Grant 2R01-DK062027 (para G.D.H).

Todos los métodos fueron realizados según protocolos aprobados institucionalmente bajo el auspicio de la Comisión de la Universidad sobre el uso y cuidado de animales en la Universidad de Michigan.
1. preparación para la cirugía
<ol><li>El día antes de la cirugía, preparar 4% paraformaldehido (PFA) / fosfato tampón salino (PBS). En el caso de alícuotas congeladas, proceder a descongelar uno y almacenar a 4 ° C. Nota: 4% PFA no es estable por más de 48 h. PRECAUCIÓN: PFA es tóxico, Evite contacto con piel y ojos y desechar en un contenedor apropiado.</li>
	<li>En el día de la cirugía, preparar los instrumentos quirúrgicos de esterilizar las tijeras y pinzas con 70% de etanol (EtOH) y deje secar sobre una toalla de papel.</li>
	<li>Lugar una placa de 24 pocillos con PBS 1 x (1 mL/pocillo es suficiente) en un cubo de hielo. Nota: Las glándulas suprarrenales se mantendrán en este plato de cultura múltiples bien después de la cirugía.</li>
</ol>2. suprarrenal disección
<ol><li>Eutanasia el ratón siguiendo protocolos estándar aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC). Se requiere un método secundario de la eutanasia para asegurar la muerte (por ejemplo decapitación).<ol>
<li>Eutanasia por sobredosis de isoflurano, coloque el ratón en una cámara llena de vapores de isoflurano hasta que cesa la respiración, a continuación, quite el ratón de la cámara, coloque sobre una superficie y realizar la dislocación cervical. Nota: La mayoría métodos de eutanasia causan señal de socorro para el animal y no son adecuados para los estudios de estrés porque puede añadir la variable de confusión de la activación del eje hipófisis-suprarrenal y liberación medular de catecolaminas. En este caso, la decapitación es la técnica sugerida para adoptar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque el ratón supino, esterilizar el área de la incisión en el abdomen y los flancos con el 70% EtOH. Nota: Mientras que afeitar la piel aumentará la esterilidad, para esta aplicación en particular no es necesario.</li>
	<li>Cortar la piel en el abdomen usando tijeras, separar la piel de peritoneo, deskin el ratón pellizcando la piel alrededor de la corte y tirando en direcciones opuestas dos (caudal y rostral). Luego se corta el peritoneo hasta llegar a los flancos derecho e izquierdos posteriores.</li>
	<li>Eliminar el corte de glándula suprarrenal murino alrededor del tejido adiposo circundante y colocarlo en la placa multiwell 24 lleno de 1 x PBS y mantenido en hielo.</li>
</ol>3. Peri-suprarrenales eliminación de grasa
<ol><li>Con un microscopio de disección, coloque las suprarrenales en un vaso de base o un plato de Petri en la placa de la platina, coloque la fuente de luz, seleccione la ampliación y ajuste el enfoque para obtener una visión clara de la suprarrenal todo. Nota: El aumento utilizado puede variar dependiendo de preferencias personales. Un aumento total de 30 X con un lente de plan 1 X, zoom 3 X y ocular 10 X permite visualizar la glándula entera con un buen campo de visión.</li>
	<li>Quite rápidamente el tejido graso adyacente con dos agujas de 25 G, evitando la deshidratación de la suprarrenal. Si esto sucede antes de que se quita toda la grasa, mover el suprarrenal detrás en el pozo que contiene 1 x PBS para 1-2 min y luego continuar con el proceso de eliminación de grasa.</li>
	<li>Lavar 2 x por 2 min en PBS 1 x.</li>
</ol>4. tejido procesamiento e incrustación
<ol><li>Fijar los tejidos en el 4% PFA/PBS a 4 ° C en una plataforma oscilante de 2 h.</li>
	<li>Quitar los 4% PFA y lavar los tejidos con PBS 1 x, 3 x 15 min a 4 ° C. PRECAUCIÓN: PFA es tóxico y es un desperdicio peligroso; debe ser manejado con precaución bajo una campana química y desechar en un recipiente de residuos peligrosos.</li>
	<li>Incubar las glándulas suprarrenales en el 50% EtOH a 4 ° C en una plataforma oscilante de 2 h.</li>
	<li>Incubar las glándulas suprarrenales en el 70% EtOH a 4 ° C en una plataforma oscilante para un mínimo de 2 h. Nota: Si no proceder con el procesamiento para inclusión de tejidos, las glándulas suprarrenales pueden almacenarse en el 70% EtOH a 4 ° C. Evitar el almacenamiento a largo plazo en el 70% EtOH y proceder a tejido procesado tan pronto como sea posible da muestras de mejor calidad.</li>
	<li>Preparar el suprarrenal para proceso envolviendo en Gasa y encerrando en un cassette para inclusión tisular del tejido. Coloque el cartucho en una jarra llenada con 70% EtOH y almacenar a 4 ° C hasta que esté listo para pasar al procesador de tejido. Inserte el casete en el procesador de tejido programado como registrados en la tabla 1 y ejecutar el programa.</li>
	<li>Transferir el casete en una estación de inclusión con parafina fundida a 65 ° C. Si no hay una estación de enfriamiento, coloque una bandeja de refrigeración frío junto a él.</li>
	<li>Un molde de inclusión de la etiqueta y abrir el cassette para inclusión tisular. Usando un par de pinzas, desenvolver la gasa y el suprarrenal suavemente en la posición deseada en el centro de la base en el molde de incrustación. Vierte la parafina derretida en el suprarrenal. Si es necesario, sostenga el suprarrenal con pinzas para asegurar su posición en el molde de lo contrario puede moverse dentro del molde.</li>
	<li>Suavemente mueva el molde de incrustación a la bandeja de refrigeración y esperar a que el endurecimiento de la parafina. Después de eso, para facilitar el seccionar, almacenar moldes de inclusión en un lugar fresco.</li>
</ol>5. seccionar con un micrótomo rotatorio
<ol><li>Verifique que el micrótomo esté limpio antes de comenzar, elimine todos los residuos de parafina desechados, asegurar que se afila el cuchillo (o lámina), el mecanismo interno del aceite y alimenten el soporte del bloque si es necesario.</li>
	<li>Etiqueta una serie de portaobjetos de microscopio (positivamente cargado o cubierto para evitar la pérdida de tejido (véase Tabla de materiales)), los ponen en un conjunto de calentador de portaobjetos a 37 ° C y dispensar agua ultrapura tipo autoclave 1 sobre cada diapositiva.</li>
	<li>Espesor de la sección set 5 μm.</li>
	<li>Inserte la cuchilla de micrótomo en sujetador de la cuchilla, el ángulo de la hoja de control, asegúrese de que la cuchilla está bien fijada en el soporte y Compruebe la holgura del soporte del bloque y bloque de parafina.</li>
	<li>Llevar el soporte del bloque a su posición más alta y, si es posible, bloquear la palanca de funcionamiento, retire el bloque de parafina en el molde y colóquelo en el soporte del bloque fijándolo firmemente con la pinza. El ángulo de la línea central de la hoja con la superficie del frente del bloque debe ser unos 20°. Si es necesario, vuelva a ajustar el bloque de parafina. PRECAUCIÓN: La cuchilla es filosa.</li>
	<li>Si previamente bloqueado, desbloquear el volante y baje el bloque de parafina hasta que su cara esté nivelada con el borde de la cuchilla de micrótomo. Gire la rueda de mano con un ritmo constante. Realizar el ajuste inicial para retirar la parafina y exponer el suprarrenal.</li>
	<li>Mantener girando la rueda de mano y la sección hasta el final del suprarrenal. Usar un microscopio de campo luminoso o disección para verificar la presencia de tejido en las secciones. Retire la cinta de la hoja y con la ayuda de otro par de pinzas para colocarlo en el agua sobre el portaobjetos de cristal. Puede ser útil para colocar la cinta sobre una superficie, estirar cuidadosamente y luego montarlo en la diapositiva.</li>
	<li>Deje que las diapositivas se seque en la placa. Luego los ponen en una bandeja deslizante y hornee a 37 ° C durante la noche o más si el agua está todavía presente. Una vez secas, guardar las diapositivas en una caja de diapositivas en temperatura ambiente.</li>
	<li>Guarde todo el equipo usado y limpie el microtomo.</li>
</ol>6. inmunofluorescencia
<ol><li>Seleccionar diapositivas de inmunotinción y colocarlos en un soporte de diapositivas.</li>
	<li>En una placa caliente, traer un vaso de precipitados llenado de citrato de 0.01 M a pH 2.0 a hervir. El volumen del buffer depende del tamaño del vaso y debe ser suficiente para cubrir las secciones de las diapositivas durante la ebullición (algunos evaporación debe tenerse en cuenta). Cubrir el vaso con papel de aluminio. Nota: Otros métodos para la recuperación de antígeno están disponible (ver discusión).</li>
	<li>Desparafinizar el portaobjetos en xileno 100% 2 x durante 5 minutos. Rehidratar las diapositivas utilizando la siguiente serie: 100% EtOH 2 x durante 5 minutos, 70% EtOH 2 x durante 5 minutos, tipo 1 agua ultrapura durante 5 minutos. Nota: Después de parafina, es importante no dejar que seque las secciones: las secciones de tejido deben cubrirse siempre con amortiguadores o soluciones hasta el final del procedimiento o puede dañarse la estructura del tejido.</li>
	<li>Para la recuperación de antígeno, coloque los portaobjetos en un sostenedor de la diapositiva del metal e introdúzcalo en el vaso con hervir citrato sin el papel de aluminio. Dejar hervir durante 10 minutos.</li>
	<li>Retire el vaso de la placa y dejar enfriar para 20 minutos Asegúrese de que las secciones suprarrenales están todavía cubiertas con el buffer.</li>
	<li>Prepare la solución de bloqueo. Si utilizando la tinción comercialmente disponible kit empleadas para el Representante de resultados (véase la Tabla de materiales), en un tubo añadir 1,25 mL de PBS 1 x, 1 gota (equivalente a unos 45 μL) de reactivo de bloqueo de Ig de ratón y el 5% de suero normal de cabra. Almacenar la solución de bloqueo a 4 ° C o en hielo durante el trabajo. Nota: El suero utilizado depende de la especie del anticuerpo secundario. Aquí se han utilizado anticuerpos secundarios en cabra. Para otros anticuerpos, las concentraciones séricas diferentes pueden ser necesarias. Empíricamente para determinar la concentración correcta prueba varias concentraciones.</li>
	<li>Transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin conteniendo PBS 1 x y lavado 3 x 10 min cada uno en un eje de balancín con suave balanceo.</li>
	<li>Preparar una cámara humidificada para tinción.</li>
	<li>Sacuda suavemente el PBS de una diapositiva; Limpie la parte inferior de la diapositiva con un trapo sin pelusa para quitar el exceso PBS.</li>
	<li>Utilizando un marcador especial para diapositivas con propiedades hidrofóbicas, dibuje un círculo alrededor de cada sección suprarrenal, asegurándose de que la superficie esté seca para evitar la propagación de la solución de tinta a la sección. Si es necesario, cuidadosamente seque la superficie. Colocar el portaobjetos en la cámara humidificada.</li>
	<li>Rápidamente, pipetee 50 μl (o suficiente para cubrir las secciones) de bloquear la solución sobre cada sección. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Nota: Bloqueo de volumen de solución necesario puede variar; es importante que las secciones están bien cubiertas con la solución.</li>
	<li>Preparar la solución diluyente del kit disponible comercialmente con 7,5 mL de PBS 1 x, 600 μl de proteína concentrado acción solución y 5% de suero normal de cabra (o cualquier otro suero y concentración en la solución de bloqueo). Almacenar la solución diluyente a 4 ° C o en hielo durante el trabajo.</li>
	<li>Preparar las soluciones de anticuerpo primario dilución de los anticuerpos primarios en las concentraciones apropiadas de la solución diluyente. Para la tinción de Co, añadir una alícuota de cada anticuerpo en un nuevo tubo y mezcle suavemente. Coloque los anticuerpos y anticuerpos soluciones en hielo hasta que esté listo para usar. Nota: Aquí empleamos anticuerpo anti-SF1 en conejo y un anticuerpo anti-TH en ratón. Para el anticuerpo de preparar soluciones de trabajo siguen como se indica.<ol>
<li>Para la solución de trabajo de SF1, en un tubo, añadir 1 μl de anticuerpo anti-SF1 a 999 μl de la solución diluyente (concentración final de 1.5 μg/mL). Para la solución de trabajo de TH, en un tubo, añadir anticuerpo de anti-TH de 1 μL en 499 μl de la solución diluyente (concentración final estimado de 2 a 6 μg/mL).</li>
		<li>Para SF1 + TH mezcla de trabajo de anticuerpo, en un nuevo tubo, pipetear 250 μl de solución de trabajo de SF1 y 250 μl de solución de trabajo de TH. Mezclar suavemente por pipeteo. Almacenar en hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir las diapositivas en una jarra de Coplin conteniendo 1 x PBS y 3 x 5 min en un eje de balancín con suave balanceo.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos de vuelta en la cámara de vapor después de limpiar el exceso de PBS, pipeta el SF1 + mezcla de trabajo de anticuerpo (u otra solución de anticuerpo primario) en cada sección, cerrar la cámara humidificada y dejarlo toda la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Al día siguiente, mueva las diapositivas en un Coplin jar que contiene 1 x PBS y lavan 3 x 15 min en un eje de balancín con suave balanceo.</li>
	<li>Mientras lavar los portaobjetos, preparar la solución de anticuerpo secundario en la solución diluyente utilizar la concentración adecuada. Si se realiza tinción de Co, añadir igual cantidad de cada solución de anticuerpo secundario en un tubo nuevo. Mezclar suavemente por pipeteo. Almacenar en hielo. Proteger los tubos de la luz y almacenar en hielo hasta que esté listo para usar. Nota: Aquí, los anticuerpos secundarios utilizados son 488 nm fluorescente tinte etiquetado anti-ratón planteado en cabra y 549 fluorescente tinte etiquetado anti-conejo en cabra. La solución de anticuerpo secundario se preparó agregando 0,5 μl de cada anticuerpo secundario en 799 μl de la solución diluyente (concentración final de 1,2 μg/mL).</li>
	<li>Vuelva a colocar las diapositivas en la cámara de vapor después de quitar el exceso de PBS, rápidamente pipetear la solución de anticuerpo secundario en las secciones de suprarrenales, cerrar la cámara humidificada y proteger de la luz. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave los portaobjetos en una jarra de Coplin con 1 x PBS y lavar 3 x 15 min en un eje de balancín con un balanceo suave, asegurándose de proteger de la luz.</li>
	<li>Preparar a los 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solución para tinción nuclear: 1 μl de DAPI (20 mg/mL) en 1 mL de PBS 1 x. Nota: Contratinción nuclear azul fluorescente puede también lograrse utilizando colorante Hoechst.</li>
	<li>Pipetear la solución de DAPI sobre las secciones suprarrenales, cubierta de la luz e incubar a temperatura ambiente durante 7 minutos.</li>
	<li>Lavar los portaobjetos en una jarra de Coplin con 1 x PBS y lavar 3 veces durante 5 minutos en un eje de balancín con suave balanceo mientras que proteger el portaobjetos de la luz.</li>
	<li>En un área protegido de la luz directa, colocar un cubierta de vidrio y pipeta 60 μL o unas 3 gotas de agente de montaje adecuado para inmunofluorescencia a lo largo de la superficie de la cubierta de vidrio.</li>
	<li>Limpie suavemente la parte posterior de una diapositiva con una toallita libre de pelusas, posición de la diapositiva hacia abajo hacia el vidrio de cubierta y paralelo a él, por lo que las secciones de tejido enfrentan el vidrio de la cubierta con el agente de montaje. Ligeramente que conducirlo en el cristal de la tapa y asegúrese de que no está atrapada ninguna burbuja de aire entre la diapositiva y el vidrio de la cubierta.<ol>
<li>Si es necesario, aplique más presión para eliminar las burbujas de aire y el exceso de medio de montaje.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colocar el portaobjetos en un recipiente oscuro y cura a temperatura ambiente durante un mínimo de 24 h (o el tiempo indicado en la hoja de información del agente de montaje utilizado) y luego proceder a la proyección de imagen.</li>
</ol>7. la proyección de imagen
Nota: Un microscopio de fluorescencia conectado a una cámara es necesario para la detección y captura de la fluorescencia emitida por los tejidos después de la excitación en determinadas longitudes de onda. Aunque obvio, es importante recordar que elegir el secundario anticuerpos conjugan con fluorocromos cuya excitación y espectros de emisión son compatibles con el equipo disponible. Proyección de imagen de configuración varía según el microscopio y el software utilizado para capturar imágenes. Hay algunas reglas básicas que se aplican para la proyección de imagen suprarrenales secciones, como asegurándose de que el tiempo de exposición, cámara gana ajustes e intensidad fuente de luz se mantiene constante.
<ol><li>Encienda la fuente de luz y la cámara, iniciar el software de imágenes siguiendo las instrucciones del fabricante. Nota: El orden de estas acciones puede diferir dependiendo del equipo utilizado.</li>
	<li>Garantizar la diapositiva en el escenario, abra el obturador, y mirando por los oculares del microscopio uso canal de (DAPI) tinción nuclear y ampliación baja (4 X) para identificar el tejido en la diapositiva: secciones suprarrenales son pequeñas y su visualización puede requerir algún tiempo.</li>
	<li>Cambiar a un mayor aumento (10 X), enfoque y cerrar el obturador. Nota: Es importante evitar innecesariamente larga exposición a la luz que puede causar el fotoblanqueo, resultando en pérdida de señal.</li>
	<li>Utilizando los comandos del software, seleccionar el objetivo (10 X) y el canal en uso (DAPI), ajustar el tiempo de exposición (1 s, se puede ajustar si la señal es demasiado fuerte o débil). Si está disponible, establezca binning para la proyección de imagen viva (no adquisición) a '2 X 2', conversión de ganancia a media, velocidad de lectura a 20 MHz'. Si el software utilizado no aparece la barra de escala al final de la proyección de imagen, seleccione la opción de barra de escala en el menú y la barra de la posición donde desee.</li>
	<li>Abra el obturador, vuelva a ajustar el foco si es necesario y cambie los canales (FITC, TRITC, DAPI). Si el microscopio no es automatizado, tomar una foto de la suprarrenal en cada canal sin necesidad de mover el escenario y asegúrese de ajustar la selección del canal en uso. Cierre el obturador una vez terminada. Nota: Anote los ajustes empleados en caso de que el software no guarda automáticamente les.</li>
	<li>Guardar las imágenes. Nota: Cuadros combinados pueden a menudo crear usando software del microscopio u otros paquetes de software de editor de gráficos.</li>
	<li>Repetir la proyección de imagen de otras áreas de la sección o con un aumento mayor. Nota: Un aumento de X 20 a menudo requiere un menor tiempo de exposición (es decir, ms de 800).</li>
	<li>Al final de la proyección de imagen, apague todos los equipos en el orden adecuado.</li>
</ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método para el aislamiento de las glándulas suprarrenales de ratón junto con la preparación y tinción de las glándulas suprarrenales seccionado ratón embebido en parafina.
Comparado con otros protocolos que hemos probado, este protocolo de la inmunofluorescencia ha sido conveniente para la mayoría de los anticuerpos utilizados en nuestro laboratorio. Sin embargo, en algunos casos puede requerir algunos ajustes para mejorar los resultados de la tinción. Una variable q...

Inmunohistoquímica es una técnica para la detección de componentes del tejido con el uso de anticuerpos contra moléculas celulares específicas y posteriores técnicas de tinción para detectar los anticuerpos conjugados1. Este procedimiento de inmunohistoquímica requiere fijación específica y procesamiento de los tejidos que están determinados a menudo empírico para el antígeno específico, tejidos y anticuerpos utilizados2. La fijación es crucial para preservar el estado "original" de los tejidos y manteniendo así intacta celular y estructuras subcelulares y patrones de expresión. Se necesitan adicionales de procesamiento y procedimientos de inclusión para preparar el tejido seccionado en rebanadas que se usan para estudios histológicos con inmunohistoquímica.
Inmunotinción puede realizarse con detección chromogenic o fluorescente. Detección cromógena requiere la utilización de una enzima para convertir un sustrato soluble en un producto coloreado insoluble. Mientras que esta enzima puede ser conjugada con el anticuerpo reconoce al antígeno (anticuerpo primario), más a menudo es conjugado con el anticuerpo que reconoce el anticuerpo primario (es decir, el anticuerpo secundario). Esta técnica es muy sensible; el producto coloreado que resultan de la reacción enzimática es Fotoestables y requiere sólo un microscopio de campo luminoso para la proyección de imagen. Sin embargo, immunostaining cromogénico puede no ser conveniente cuando se intenta visualizar dos proteínas que co localización, ya que la deposición de un solo color puede enmascarar la deposición de la otra. En el caso de coloración Co, inmunofluorescencia ha demostrado para ser más ventajosos. El advenimiento de la inmunofluorescencia se atribuye a Albert Coons y colegas, que desarrolló un sistema para identificar antígenos de tejidos con anticuerpos marcados con fluoresceína y visualizarlas en los tejidos seccionados bajo luz ultravioleta3. Detección de fluorescencia se basa en un anticuerpo conjugado con un fluoróforo que emite luz después de la excitación. Porque hay varios fluoróforos con emisiones en diferentes longitudes de onda (con poca o ninguna superposición), este método de detección es ideal para los estudios de múltiples proteínas.
La glándula suprarrenal es un órgano vinculado situado encima del riñón y caracterizado por dos componentes embriológicamente distintos rodeados por una cápsula mesenquimal. La corteza suprarrenal externa, derivada del mesodermo intermedio mesonephric, secretan hormonas esteroides mientras que la médula interna, derivada de la cresta neural, produce catecolaminas como adrenalina, noradrenalina y dopamina. La corteza suprarrenal se divide histológicamente y funcionalmente en tres zonas concéntricas, con cada zona secretoras de diferentes clases de hormonas esteroides: el exterior de la zona glomerular (zG) produce mineralocorticoides que regulan la homeostasis de electrolitos y volumen intravascular; la media de la zona fasciculada (zF), directamente debajo de la zG, segrega glucocorticoides que median la respuesta de estrés a través de la movilización de los almacenes de la energía para aumentar la glucosa en plasma; y la zona interna reticular (zR), que sintetiza precursores de esteroides (es decir, dehidroepiandrosterona (DHEAS))4.
Alguna variación en la zonación adrenocortical está presente entre las especies: por ejemplo, Mus musculus carece de la zR. La única zona X postnatal del M. musculus es un remanente de la corteza fetal caracterizado por pequeñas células pobres en lípidos con citoplasmas acidófilos5. La zona X desaparece en la pubertad en ratones machos y después del primer embarazo en ratones femeninos o degenera gradualmente en las hembras no crían6,7. Por otra parte, la tortuosidad y el espesor de los objetos expuestos de zG marcan variación entre las especies como la organización de las células madre y progenitoras periféricas en y adyacente a la zG. La rata, a diferencia de otros roedores, dispone de una zona indiferenciada visible (zU) entre la zG y zF que funciona como una zona de la célula de vástago o una zona de transitorios amplificando progenitores. El zU es único a las ratas o simplemente más prominente organizan grupo de células es desconocido8,9.
Las células de la corteza suprarrenal contienen gotitas de lípidos que almacenan los ésteres de colesterol que servir como el precursor de todas las hormonas esteroides10,11.  El término "steroidogenesis" define el proceso de producción de las hormonas esteroides de colesterol a través de una serie de reacciones enzimáticas que involucran la actividad del factor steroidogenic 1 (SF1), cuya expresión es un marcador de potencial steroidogenic. En la glándula suprarrenal, Sf1 expresión sólo está presente en las células de la corteza12. Un interesante estudio encuentra la expresión de la biotina endógena en las células adrenocorticales con potencial steroidogenic13. Mientras que esto puede ser la causa de una mayor experiencia en métodos de tinción basada en biotina/estreptavidina, debido a la detección de la biotina endógena por el anticuerpo conjugado con estreptavidina, esta característica podría emplearse también para distinguir el steroidogenic células de otras poblaciones dentro de la glándula suprarrenal, es decir, endoteliales, capsular y las células de la médula.
Inervado por neuronas simpáticas preganglionares, la médula suprarrenal se caracteriza por células basófilas con un citoplasma granular que contiene epinefrina y norepinefrina. Las células de la médula se denominan "cromafines" debido al alto contenido de catecolaminas que forma un pigmento marrón después de oxidación14. Tirosina hidroxilasa (TH) es la enzima que cataliza el paso tarifa-limitador en la síntesis de catecolaminas y en la glándula suprarrenal, se expresa solamente en la médula15.
Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de las glándulas suprarrenales de ratón, su proceso de inclusión en parafina de seccionamiento y un método para realizar la inmunofluorescencia que manchaba en suprarrenales secciones con el fin de identificar los tipos celulares que constituyen el corteza suprarrenal y la médula. Este protocolo es un estándar en nuestro laboratorio para la inmunotinción con anticuerpos múltiples rutinariamente utilizados en nuestra investigación.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>Nest Biotechnology Co.</td><td>0412B</td><td></td></tr><tr><td>Agujas desechables 25 G x 5/8"</td> <td>Exel International</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus&nbsp;</td><td>McCormik scientific</td><td>39502004</td><td>Parafina para la inclusión de tejidos</td></tr><tr><td>Casetes de biopsia Shandon II con tapa adjunta</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>1001097 Casetes para el procesamiento</td></tr><tr><td>de tejidos Cuchillas de micrótomo de alto perfil</td><td>Accu-Edge</td><td>4685</td><td>Cuchillas desechables de acero inoxidable Moldes</td></tr><tr><td>de inclusión de tejidos de plástico desechables Peel-away</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986</td><td>Truncado, 22 mm cuadrado superior cónico a 12 mm inferior</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Chemical X5P1GAL</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol de 200 pruebas</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de gasa Certi-Pad&nbsp;</td><td>Seguridad certificada Mfg, Inc</td><td>231-210</td><td>3" x 3. Almohadillas de gasa estériles sin látex</td></tr><tr><td>kit M.O.M&nbsp;</td><td>Laboratorios de vectores</td><td>BMK-2202</td><td>Para la detección de anticuerpos primarios de ratón en tejido</td></tr><tr><td>de ratón KimWipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Toallitas de 4,4 pulgadas x 8,4 pulgadas</td></tr><tr><td>Super PAP PEN</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>00-8899</td><td>Bolígrafo para dibujar en portaobjetos</td></tr><tr><td>Microscopio cubreobjetos de vidrio&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-D</td><td>Tamaño: 22 x 50 x 1.5</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542&nbsp;</td><td>(Preparado en caldo de 20 mg/mL)</td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración ProLong Gold</td><td>Sondas moleculares</td><td>P36930</td><td>Agente de montaje para inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>X-cite series 120Q</td><td>Lumen Dynamics</td><td></td><td>Fuente de luz</td></tr><tr><td>Coolsnap Myo</td><td>Cámara fotométrica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optiphot-2&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopio</td></tr><tr><td>micrótomo</td><td>American Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue embedder</td><td>Leica</td><td>EG1150 H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Procesador de tejidos&nbsp;</td><td>Leica</td><td>ASP300S</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de ratón anti-TH</td><td>Millipore</td><td>MAB318</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Conejo anti-SF1</td><td>Grupo de proteínas Ab (PTGlabs)</td><td>&nbsp; </td><td>anticuerpo primario</td>hecho a medida</tr><tr><td>Alexa-488 Mouse IgG &nbsp; cabra criada</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-545-003 &nbsp;</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Dylight-549 Conejo IgG cabra criada</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-505-003</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Ácido citrato anhidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Investigación Básica&nbsp;</td>Software <td>de Nikon</td><td></td><td>para la generación de imágenes</td></tr></tbody></table>

aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

La inmunofluorescencia es una técnica bien establecida para la detección de antígenos en los tejidos con el empleo de anticuerpos conjugados con fluorocromo y tiene un amplio espectro de aplicaciones. Detección de antígenos permite la caracterización y la identificación de múltiples tipos de células. Situado por encima de los riñones y encapsulado por una capa de células mesenquimales, la glándula suprarrenal es un órgano endocrino, compuesto por dos tejidos diferentes con diferente origen embriológico, la corteza externa de derivados del mesodermo intermediaria mesonephric y los nervios médula interna derivados de la cresta. La corteza suprarrenal segrega esteroides (es decir, mineralocorticoides, glucocorticoides, hormonas sexuales), mientras que la médula suprarrenal produce las catecolaminas (es decir, adrenalina, noradrenalina). Mientras realiza la investigación suprarrenal, es importante poder distinguir células únicas con diferentes funciones. Aquí proporcionamos un protocolo desarrollado en nuestro laboratorio que describe una serie de pasos secuenciales necesarios para obtención de tinción de inmunofluorescencia para caracterizar los tipos celulares de la glándula suprarrenal. Nos centramos primero en la disección de las glándulas suprarrenales de ratón, la eliminación microscópica del periadrenal grasa seguida de la fijación, la transformación y la inclusión en parafina de los tejidos. A continuación describimos de seccionamiento de los bloques de tejido con un micrótomo rotatorio. Por último, detallamos un protocolo para la tinción inmunofluorescente de las glándulas suprarrenales que hemos desarrollado para minimizar la Unión inespecífica del anticuerpo y autofluorescencia para obtener una señal óptima.

La figura 1 representa un esquema del protocolo completo descrito anteriormente. Las glándulas suprarrenales son extraídas de ratones, tejido adiposo adyacente se quita con un microscopio de disección y el suprarrenal entonces se fijan en el 4% PFA. Después de este paso, las glándulas suprarrenales son procesadas embebidas en parafina y seccionadas con un micrótomo para cortar el órgano en rodajas finas que se depositan sobre los portaobjetos de microscopio. ...

Aquí presentamos un método para aislar las glándulas suprarrenales de los ratones, reparar los tejidos, les sección y realizar tinción de inmunofluorescencia.

Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

La inmunofluorescencia es un método básico que puede ayudar a responder preguntas clave en el campo suprarrenal sobre la zonación suprarrenal, la identidad celular y la función. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de múltiples proteínas preservando la morfología del tejido suprarrenal. Para extraer la glándula suprarrenal murina, corte alrededor del tejido adiposo circundante y coloque la glándula en un pozo de una placa de 24 múltiples metros que contenga PBS fresco en hielo.Transfiera la glándula a una placa de Petri o soporte de vidrio bajo un microscopio de disección y use dos agujas de calibre 25 para eliminar el tejido graso adyacente. Cuando se haya eliminado toda la grasa, fije el tejido en 4%paraformaldehído a cuatro grados Celsius con balanceo durante dos horas. Al final de la incubación, enjuague la glándula con tres lavados de 15 minutos a cuatro grados centígrados en uno a dos mililitros de PBS fresco por lavado.Después del último lavado, deshidratar la glándula en dos inmersiones secuenciales de etanol a cuatro grados Celsius con balanceo durante dos horas por incubación. Para preparar el tejido suprarrenal para su procesamiento, envuelva la glándula en la gasa y encierre la glándula suprarrenal en un casete que incrusta tejido. A continuación, coloque el cassette en un frasco lleno de 70% de etanol para un almacenamiento de cuatro grados Centígrados hasta su procesamiento.Para procesar el tejido, inserte el cassette en el procesador de tejidos para su procesamiento como se indica en la tabla. Al final del programa, transfiera el cassette a una estación de incrustación llena de parafina derretida de 65 grados y utilice un par de fórceps para desenvolver la gasa. Transfiera suavemente la suprarrenal en la posición adecuada en el centro de la base del molde de incrustación y vierta la parafina derretida sobre la glándula.A continuación, mueva cuidadosamente el molde de incrustación a una bandeja de refrigeración para facilitar el endurecimiento de la parafina. Antes de secisar por microtoma rotativo, etiquete una serie de diapositivas de microscopio y colocar las diapositivas en un calentador de diapositivas Celsius de 37 grados. Dispensar alrededor de 450 microlitros de agua ultra pura autoclaves tipo uno en cada diapositiva y ajustar el espesor de corte de sección del microtomo a cinco micrómetros.Cargue el tejido incrustado en el bloque de corte y baje el bloque de parafina hasta que la muestra esté a la altura de la cara con el borde de la hoja del microtomo. Girando la rueda de mano con un ritmo constante, realizar un recorte inicial para eliminar la parafina y exponer el tejido suprarrenal. A continuación, adquiera cinco secciones de micrómetros hasta el final de la glándula suprarrenal utilizando fórceps para transferir cada sección a la gota de agua en uno de los portaobjetos preetiquetados a medida que se recoge.Después de confirmar la presencia de tejido en las secciones por microscopía, seque los portaobjetos en la placa caliente durante unas dos horas y hornéelos al menos durante la noche en una bandeja deslizante a 37 grados centígrados hasta que no haya más agua visible. Una vez secos, guarde los portaobjetos en una caja deslizante a temperatura ambiente. Para la recuperación de antígenos de inmunofluorescencia, desparafinar los portaobjetos con dos inmersiones de cinco minutos 100% de xileno, seguidas de rehidratación en una serie descendente de inmersión en etanol y agua.Después de la inmersión en agua, transfiera los portaobjetos a un portaobjetos metálicos y coloque el soporte en un vaso de precipitado de citrato molar 0,01 en una placa caliente durante 10 minutos. Al final de la incubación, retire el vaso de precipitados de la placa caliente y déjelo enfriar durante 20 minutos, teniendo cuidado de que todas las secciones suprarrenales todavía estén cubiertas con tampón. Cuando el vaso de precipitados se enfríe, transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin para tres lavados de 10 minutos en PBS fresco con un suave balanceo.Después del último lavado, limpie cuidadosamente la superficie de cada diapositiva sin dañar las secciones de tejido y utilice un marcador hidrófobo para hacer un círculo alrededor de cada sección. Coloque los portaobjetos en una cámara humidificada y agregue rápidamente al menos 50 microlitros de solución de bloqueo a cada sección para una incubación de una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación de bloqueo, lave los portaobjetos tres veces en PBS fresco durante cinco minutos por lavado con mecedores y de vuelta a los portaobjetos a la cámara.A continuación, agregue el cóctel de anticuerpos primario de interés a cada sección para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, lave las muestras con tres lavados de 15 minutos en PBS fresco por lavado y etiquete los portaobjetos con la solución de anticuerpos secundaria adecuada durante una hora protegida de la luz. Al final de la incubación, lavar las muestras con tres lavados de 15 minutos en una balancín protegido de la luz, etiquetando los núcleos de las secciones con DAPI durante siete minutos a temperatura ambiente protegida de la luz después del último lavado.Después de tres lavados PBS de cinco minutos con balanceo, agregue 60 microlitros de agente de montaje adecuados para la inmunofluorescencia a lo largo de la superficie de un vidrio de cubierta por muestra y presione ligeramente cada sección de tejido deslizante hacia abajo sobre un vidrio de cubierta, teniendo cuidado de evitar burbujas. A continuación, colocar cada diapositiva plana en un recipiente oscuro para el curado a temperatura ambiente durante al menos 24 horas antes de la toma de imágenes. Durante el proceso de eliminación de grasa, es fundamental no dejar que la glándula suprarrenal se seque ya que la deshidratación puede dañar la estructura del tejido.Después de una extirpación exitosa del tejido adiposo circundante, la glándula suprarrenal debe ser fácilmente detectable sin grasa visible adicional. La inmunostaining de las secciones de la glándula suprarrenal como se ha demostrado revela la tinción del factor esteroideogénico nuclear una tinción de las células adrenocorticales, tinción de tirosina hidroxilasa de las células medulares, tinción DAPI de los núcleos de las células no esteroideogénicas de la cápsula externa, y co-tinción con células adrenocorticales y medulares. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las suprarrenales del ratón son pequeñas y que sus posiciones son algo variables, lo que dificulta su detección.Por lo tanto, es crucial tener una visión clara de la zona durante la disección. Estos procedimientos son técnicas básicas para el estudio de la glándula suprarrenal in vivo. Después de esto, se pueden realizar métodos adicionales de inmunosuchado para satisfacer necesidades científicas específicas.Después de su desarrollo, la inmunosuferidad allanó el camino para que los investigadores en los campos de la ciencia biomédica exploraran la expresión de proteínas in situ, una herramienta útil en muchas disciplinas y campos.

isolation-fixation-immunofluorescence-imaging-mouse-adrenal

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Médula suprarrenal cromafines sistemas de cultivos celulares son muy útiles para el estudio del acoplamiento excitación-secreción en el establecimiento in vitro. Este protocolo se ilustra el método utilizado para diseccionar las glándulas suprarrenales y luego aislar a la región medular al eliminar la corteza suprarrenal. La digestión de la médula en una sola las células cromafines se demostró entonces.

Ratón cromafín aislamiento de células

Este video muestra un ensayo para realizar inmunotinción múltiple utilizando anticuerpos primarios de la misma especie huésped. En este método, una sección de tejido suprarrenal se somete a un proceso de inmunotinción de dos pasos. Inicialmente, la sección se tiñe con anticuerpos específicos para los marcadores en la corteza, seguido de la extracción del anticuerpo unido y se vuelve a teñir con anticuerpos específicos para los marcadores en la médula.

Un método de inmunotinción múltiple que utiliza anticuerpos primarios de la misma especie huésped

De alta resolución de imagen intravital con mejor contraste de hasta 120 m de profundidad en los ganglios linfáticos de ratones adultos se consigue modular espacialmente el patrón de excitación de un multi-focal del microscopio de dos fotones. En 100 m de profundidad se midió resoluciones de 487 nm (laterales) y 551 nm (axial), eludiendo así los límites de dispersión y difracción.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Después de la exocitosis, la membrana plasmática fusionada se recupera a través de un proceso conocido como endocitosis. Este mecanismo reforma las nuevas vesículas sinápticas para la siguiente ronda de liberación. Los eventos endocíticos individuales se capturan y analizan mediante el uso de los registros de capacitancia adjuntos a la célula en células cromafines suprarrenales de ratón.

Los métodos para mediciones de capacitancia celulares inscritos en ratón suprarrenal Cromafín Cell

El protocolo de inmunofluorescencia indirecta descrito en este artículo permite la detección y la localización de las proteínas en la glándula mamaria del ratón. Un método completo se da para preparar muestras de glándula mamaria, para llevar a cabo la inmunohistoquímica, a la imagen las secciones de tejido mediante microscopía de fluorescencia, y para reconstruir imágenes.

Inmunofluorescencia indirecta en secciones congeladas de ratón Glándula Mamaria

Se presenta un método para el aislamiento y cultivo de conducto de Wolff ratón (WD). También demostramos un procedimiento detallado para toda la inmunotinción monte de WDS cultivadas / recién aisladas con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio del desarrollo de WD, bobinado, y la diferenciación.

Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos

Presentamos un protocolo para diseccionar las glándulas pituitaria y preparar pituitarias secciones coronales de desarrollar ratones.

Disección y preparación del segmento Coronal de desarrollo de hipófisis de ratón

Se han establecido varios métodos diferentes para la inmunomanchación múltiple utilizando anticuerpos primarios de la misma especie huésped. Aquí, describimos el uso de desmontaje de anticuerpos mediados por microondas y de taquimida de fluoróforo para bloquear la reactividad cruzada de anticuerpos durante la inmunomancha multiplex en secciones suprarrenales de ratón incrustadas en parafina fija sin forfina.

Microwaving y fluorofore-Tyramida para inmunomanchado multiplex en las adrenales del ratón - Uso de anticuerpos primarios no conjugados de la misma especie anfitriona

Este protocolo describe una técnica de imagen confocal para detectar tres modos de fusión en células cromafines suprarrenales bovinas. Estos modos de fusión incluyen 1) fusión cerrada (también llamada kiss-and-run), que involucra la apertura y el cierre del poro de fusión, 2) la fusión de permanencia, que involucra la apertura del poro de fusión y el mantenimiento del poro abierto, y 3) la fusión retráctil, que involucra la contracción de la vesícula fusionada.

Microscopía confocal para medir tres modos de dinámica de poros de fusión en células cromafines suprarrenales

Este protocolo describe el aislamiento de progenitores fibroadipogénicos (FAPs) del músculo esquelético y cardíaco a partir de ratones espinosos (Acomys) mediante disociación enzimática y clasificación celular activada por fluorescencia. Los FAPs obtenidos de este protocolo pueden expandirse y diferenciarse eficazmente a miofibroblastos y adipocitos.

Aislamiento, expansión y diferenciación de progenitores fibro-adipogénicos a partir del modelo de ratón espinoso

Se desarrolló un enfoque robusto y reproducible para establecer cultivos primarios 2D de células enriquecidas en zona glomerulosa y zona fasciculata para la corteza suprarrenal del ratón. Este sistema preserva características moleculares y funcionales clave de cada zona, permitiendo una investigación enfocada de las vías de señalización, la producción hormonal y el comportamiento de las células corticales suprarrenales ex vivo.

Establecimiento de cultivos primarios enriquecidos en zonas a partir de la corteza suprarrenal del ratón

Aprenda a aislar, fijar y realizar inmunofluorescencia en glándulas suprarrenales de ratón. Esta técnica permite estudiar la zonación adrenal y la identidad celular preservando la morfología tisular.

Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

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