Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

La inmunofluorescencia es un método básico que puede ayudar a responder preguntas clave en el campo suprarrenal sobre la zonación suprarrenal, la identidad celular y la función. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de múltiples proteínas preservando la morfología del tejido suprarrenal. Para extraer la glándula suprarrenal murina, corte alrededor del tejido adiposo circundante y coloque la glándula en un pozo de una placa de 24 múltiples metros que contenga PBS fresco en hielo.

Transfiera la glándula a una placa de Petri o soporte de vidrio bajo un microscopio de disección y use dos agujas de calibre 25 para eliminar el tejido graso adyacente. Cuando se haya eliminado toda la grasa, fije el tejido en 4%paraformaldehído a cuatro grados Celsius con balanceo durante dos horas. Al final de la incubación, enjuague la glándula con tres lavados de 15 minutos a cuatro grados centígrados en uno a dos mililitros de PBS fresco por lavado.

Después del último lavado, deshidratar la glándula en dos inmersiones secuenciales de etanol a cuatro grados Celsius con balanceo durante dos horas por incubación. Para preparar el tejido suprarrenal para su procesamiento, envuelva la glándula en la gasa y encierre la glándula suprarrenal en un casete que incrusta tejido. A continuación, coloque el cassette en un frasco lleno de 70% de etanol para un almacenamiento de cuatro grados Centígrados hasta su procesamiento.

Para procesar el tejido, inserte el cassette en el procesador de tejidos para su procesamiento como se indica en la tabla. Al final del programa, transfiera el cassette a una estación de incrustación llena de parafina derretida de 65 grados y utilice un par de fórceps para desenvolver la gasa. Transfiera suavemente la suprarrenal en la posición adecuada en el centro de la base del molde de incrustación y vierta la parafina derretida sobre la glándula.

A continuación, mueva cuidadosamente el molde de incrustación a una bandeja de refrigeración para facilitar el endurecimiento de la parafina. Antes de secisar por microtoma rotativo, etiquete una serie de diapositivas de microscopio y colocar las diapositivas en un calentador de diapositivas Celsius de 37 grados. Dispensar alrededor de 450 microlitros de agua ultra pura autoclaves tipo uno en cada diapositiva y ajustar el espesor de corte de sección del microtomo a cinco micrómetros.

Cargue el tejido incrustado en el bloque de corte y baje el bloque de parafina hasta que la muestra esté a la altura de la cara con el borde de la hoja del microtomo. Girando la rueda de mano con un ritmo constante, realizar un recorte inicial para eliminar la parafina y exponer el tejido suprarrenal. A continuación, adquiera cinco secciones de micrómetros hasta el final de la glándula suprarrenal utilizando fórceps para transferir cada sección a la gota de agua en uno de los portaobjetos preetiquetados a medida que se recoge.

Después de confirmar la presencia de tejido en las secciones por microscopía, seque los portaobjetos en la placa caliente durante unas dos horas y hornéelos al menos durante la noche en una bandeja deslizante a 37 grados centígrados hasta que no haya más agua visible. Una vez secos, guarde los portaobjetos en una caja deslizante a temperatura ambiente. Para la recuperación de antígenos de inmunofluorescencia, desparafinar los portaobjetos con dos inmersiones de cinco minutos 100% de xileno, seguidas de rehidratación en una serie descendente de inmersión en etanol y agua.

Después de la inmersión en agua, transfiera los portaobjetos a un portaobjetos metálicos y coloque el soporte en un vaso de precipitado de citrato molar 0,01 en una placa caliente durante 10 minutos. Al final de la incubación, retire el vaso de precipitados de la placa caliente y déjelo enfriar durante 20 minutos, teniendo cuidado de que todas las secciones suprarrenales todavía estén cubiertas con tampón. Cuando el vaso de precipitados se enfríe, transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin para tres lavados de 10 minutos en PBS fresco con un suave balanceo.

Después del último lavado, limpie cuidadosamente la superficie de cada diapositiva sin dañar las secciones de tejido y utilice un marcador hidrófobo para hacer un círculo alrededor de cada sección. Coloque los portaobjetos en una cámara humidificada y agregue rápidamente al menos 50 microlitros de solución de bloqueo a cada sección para una incubación de una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación de bloqueo, lave los portaobjetos tres veces en PBS fresco durante cinco minutos por lavado con mecedores y de vuelta a los portaobjetos a la cámara.

A continuación, agregue el cóctel de anticuerpos primario de interés a cada sección para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, lave las muestras con tres lavados de 15 minutos en PBS fresco por lavado y etiquete los portaobjetos con la solución de anticuerpos secundaria adecuada durante una hora protegida de la luz. Al final de la incubación, lavar las muestras con tres lavados de 15 minutos en una balancín protegido de la luz, etiquetando los núcleos de las secciones con DAPI durante siete minutos a temperatura ambiente protegida de la luz después del último lavado.

Después de tres lavados PBS de cinco minutos con balanceo, agregue 60 microlitros de agente de montaje adecuados para la inmunofluorescencia a lo largo de la superficie de un vidrio de cubierta por muestra y presione ligeramente cada sección de tejido deslizante hacia abajo sobre un vidrio de cubierta, teniendo cuidado de evitar burbujas. A continuación, colocar cada diapositiva plana en un recipiente oscuro para el curado a temperatura ambiente durante al menos 24 horas antes de la toma de imágenes. Durante el proceso de eliminación de grasa, es fundamental no dejar que la glándula suprarrenal se seque ya que la deshidratación puede dañar la estructura del tejido.

Después de una extirpación exitosa del tejido adiposo circundante, la glándula suprarrenal debe ser fácilmente detectable sin grasa visible adicional. La inmunostaining de las secciones de la glándula suprarrenal como se ha demostrado revela la tinción del factor esteroideogénico nuclear una tinción de las células adrenocorticales, tinción de tirosina hidroxilasa de las células medulares, tinción DAPI de los núcleos de las células no esteroideogénicas de la cápsula externa, y co-tinción con células adrenocorticales y medulares. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las suprarrenales del ratón son pequeñas y que sus posiciones son algo variables, lo que dificulta su detección.

Por lo tanto, es crucial tener una visión clara de la zona durante la disección. Estos procedimientos son técnicas básicas para el estudio de la glándula suprarrenal in vivo. Después de esto, se pueden realizar métodos adicionales de inmunosuchado para satisfacer necesidades científicas específicas.

Después de su desarrollo, la inmunosuferidad allanó el camino para que los investigadores en los campos de la ciencia biomédica exploraran la expresión de proteínas in situ, una herramienta útil en muchas disciplinas y campos.