Purificación de la afinidad del cloroplasto Translocon complejos utilizando la etiqueta de grifo

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cloroplasto, por ejemplo, la composición de la maquinaria de importación de proteínas de cloroplasto. Es esencial para el reverdeciente y la fotosíntesis y por lo tanto para la producción de alimentos en el planeta. La máquina molecular consta de dos complejos separados en el miembro externo e interno del cloroplasto llamado TOC y TIC, pero la composición no es completamente conocida.

La principal ventaja de esta técnica es que la purificación del complejo Arabidopsis TOC/TIC se puede lograr en un método de purificación de un solo paso, la purificación TAP-TOC. Es un método específico y eficiente. Generalmente, los investigadores nuevos en este método pueden tener problemas porque no están familiarizados con el aislamiento de fracciones de membrana de cloroplasto, detergente, solubilización o purificación de afinidad.

Después de preparar las plantas de Arabidopsis, moler 10 gramos de plántulas de tres semanas de edad en nitrógeno líquido, utilizando un mortero frío y pestillo con arena. Añadir 20 mililitros de tampón de molienda en frío a los tejidos del suelo. Mezclar bien y dejar que la mezcla se descongele sobre hielo.

A continuación, remoje dos capas de material de filtración rápida con tampón de molienda. Filtrar el homogeneizar a través de las dos capas de material de filtración en un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros. Centrifugar el filtrado a 1.500 veces g en cuatro grados Centígrados durante 10 minutos y transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífugo cónico fresco y preenfriado de 50 mililitros.

Repita la centrifugación una vez más en las mismas condiciones. Transfiera el sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga frío de 38,50 mililitros y recarje hasta 35 mililitros con tampón de molienda en frío. Utilice una ultracentrífuga para centrifugar la muestra a 100.000 veces g y cuatro grados centígrados durante una hora.

Usando un homogeneizador de teflón de vidrio, resuspender el pellet verde en el tampón de molienda. Centrifugar a 100.000 veces g y cuatro grados celsius durante una hora y deseche el sobrenadante. Utilice el homogeneizador de teflón de vidrio para resuspender el pellet verde en 18,75 mililitros de un tampón de molienda x.

A continuación, agregue otros 9.375 mililitros de un tampón de molienda x. Añadir 9.375 mililitros de cuatro x solución de solubilización para llevar el volumen final a 37,5 mililitros e incubar en una coctelera giratoria a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, utilice una ultracentrífuga para centrifugar la muestra a 100.000 veces g y cuatro grados celsius durante una hora.

Transfiera el sobrenadante que contiene las membranas solubilizadas a un tubo de centrífuga cónica fresco de 50 mililitros. Después de preparar la resina de agarosa IGG, transfiera la resina de agarosa IGG previamente lavada al tubo cónico de 50 mililitros que contiene los 37,5 mililitros de membranas solubilizadas. Incubar durante la noche en una coctelera giratoria a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, sedimento de la resina de agarosa IGG a 100 veces g y cuatro grados celsius durante cinco minutos. Utilice una pipeta para quitar el sobrenadante. Era la resina de agarosa IGG en 37,5 mililitros de tampón A e incubar en una coctelera giratoria a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Continúe sedimentando y lavando la resina como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, transfiera la resina de agarosa IGG a una columna de giro de 500 microlitrotro con un filtro de 35 micras. Lave las perlas dos veces con 300 microlitros de tampón de elución TEV para el equilibrio.

A continuación, añada 300 microlitros de tampón de elución TEV que contengan 10 microlitros de TEV proteasa. Incubar la columna de espín con perlas en un termomezclador a 16 grados celsius y 350 rpm durante dos horas. A continuación, abra la columna de centrifugado y colóquela en un tubo nuevo, limpio y de 1,5 mililitros.

Gire este tubo a 100 veces g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos para recoger el eluido. En este estudio se purifica un complejo de proteína de sobre de cloroplasto etiquetado con etiqueta DE TAP de plantas transgénicas de A.thaliana. El análisis de inmunoblot confirma que el aislado TAP-TOC159 interactúa con TOC75 y TOC33 del complejo de TOC.

La membrana exterior de cloroplasto quinasa, KOC1, que se sabe que fosforilato TOC159 también está co-aislada. La presencia de TIC110 revela que el complejo TAP-TOC159 aislado también contiene los componentes del complejo TIC. El anticuerpo FBN1A no reconoció el complejo TAP-TOC159, lo que indica la ausencia de contaminaciones.

En el control negativo, la proteína NTAP inmunoprepitada no se coaisla con ninguna de las proteínas TCA, TIC y confirma la especificidad de la purificación TAP-TOC159. Aunque este método puede proporcionar información sobre la importación de proteínas de cloroplasto, potencialmente se puede aplicar a cualquier otro complejo en el sistema de botellas Arabidopsis thaliana. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos, como la hinchazón occidental o la espectrometría de masas, para demostrar la presencia de componentes conocidos o para identificar nuevos componentes de los complejos TOC y TIC.

Esta técnica allanó el camino para la investigación en el campo de importación de proteínas de cloroplasto para explorar la función de los nuevos componentes de los complejos TOC y TIC.