Name: Cultivo de bacterias magnétotactiques del género Magnetotacticum: cepas MSR-1, 1 AMB y MS-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprende a cultivar bacterias magnetotácticas del género Magnetospirillum (MSR-1, AMB-1, MS-1) con control optimizado de oxígeno en medios líquidos y semisólidos. Este protocolo garantiza condiciones reproducibles.

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Agradecemos a Richard B. Frankel por su ayuda con MTB culturas Adam P. Hitchcock y Xiaohui Zhu su apoyo durante la configuración de las culturas MTB en la Universidad de McMaster y Marcia Reid para la formación y el acceso a las instalaciones de microscopía electrónica (McMaster University, Facultad de Ciencias de la salud). Este trabajo fue apoyado por las ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC) y la Fundación Nacional de ciencia.

1. instalación de la estación2 de N
Nota: Elija el diámetro interno de la tubería por lo que se puede conectar al tanque de gas con fuga mínima y para que el cilindro de una jeringa de plástico de 1 mL se ajusta firmemente en esta tubería. Para ilustrar el completa N2 estación de burbujeo se proporciona en la figura 1.
<ol><li>Con seguridad, instale un tanque de gas N2 cerca de un banco en el que hay espacio suficiente para configurar la estación de2 N (una longitud de aproximadamente 50 cm).</li>
	<li>Conectar al tanque de un pedazo de tubo tiempo suficiente para llegar a la zona donde se construirá la estación. Si es necesario, aplique cinta de teflón en la salida del tanque para evitar cualquier fuga.</li>
	<li>Para construir una estación capaz de burbujeantes cinco botellas de medio al mismo tiempo, cortar cuatro piezas de tubo de aproximadamente 5 cm de longitud.</li>
	<li>Montar las piezas de la tubería en una línea con tres vías en forma de T plástico conexiones. Conecte un extremo de esta línea a la pieza de tubería en la salida del tanque2 N a través de una conexión adicional en forma de T. Añadir un codo de 90° guarnición en el otro extremo.</li>
	<li>Use cinta para fijar la estructura a una barra metálica horizontal colocado aproximadamente 30 cm por encima del Banco.</li>
	<li>Conectar cinco pedazos de tubería (aproximadamente 20 cm de longitud) a las salidas libres de los accesorios instalados en paso 1.4.</li>
	<li>Sacar los pistones de cinco jeringas de plástico de 1,0 mL y cortar el extremo más grande de estas jeringas (es decir., la opuesta al lado de la aguja), manteniendo únicamente la parte graduada. Llene las jeringas con algodón, no demasiado.</li>
	<li>Coloque las jeringas en las piezas vertical largo 20 cm de la tubería y utilice agua jabonosa para asegurarse de que no hay ninguna salida cuando fluye N2 .</li>
	<li>Retire las tapas de cinco agujas de 25 G (0,5 x 25 mm) e inserte estas agujas en las piezas de 10 cm de tubo fino. Asegúrese de que las agujas se ajustan firmemente en el tubo. PRECAUCIÓN: Existe el riesgo de apuñalar durante este paso. Hacerlo lentamente y con cuidado.</li>
	<li>Coloque las agujas preparadas en paso 1.9 para las jeringuillas de la estación de2 N. Asegúrese de que N2 está fluyendo a través de todas las líneas de cinco y mantener la estación en modo de espera.</li>
</ol>2. preparación de medio de crecimiento
Nota: Es posible ajustar la cantidad del medio preparado, como se explica en los puntos 2.1.2, 2.2.2 y 2.3.8. La cantidad de agua y sustancias químicas utilizadas sólo ajustarse proporcionalmente. El papel de todos los componentes del medio se describe en la tabla adicional 1.
<ol><li>Preparación de medio de crecimiento líquido para MSR-1<ol>
<li>Preparar una solución de citrato férrico 10 mM mediante la adición de 0,245 g de citrato férrico a 100 mL de agua destilada desionizada. Calentar y agitar hasta para disolver, hasta un amarillo naranja claro se obtiene la solución. Autoclave de la solución utilizando un estándar de ciclo (por lo menos 15 min de exposición a 121 ° C) y luego almacenar esta solución a temperatura ambiente en la oscuridad. Nota: Deseche la solución de citrato férrico cuando un precipitado se vuelve evidente.</li>
		<li>En un vaso de precipitados que contiene 1 L de agua destilada desionizada, agregue lo siguiente en orden mientras revuelve: 1,0 mL del mineral traza suplemento solución, 0,1 g de KH2PO4, 0.15 g de MgSO4.7 H2O, 2,38 g de HEPES, 0,34 g de NaNO3 , 0,1 g de levadura extracto, 3.0 g de peptona de Soya bean, 4,35 mL de lactato de potasio (solución al 60% w/w) y 5 mL de la solución stock de fe (III) citrato de 10 mM. Nota: Ajuste las cantidades proporcionalmente si se necesita una menor cantidad de medio de cultivo. Para una estación de2 N capaz de burbujeantes cinco botellas al mismo tiempo, como el construido en el paso 1 de este protocolo, preparar 300 mL de medio. PRECAUCIÓN: Oligoelementos minerales y stock de fe (III) citrato las soluciones deben mantenerse estériles. Para evitar la contaminación, utilizar técnica estéril cuando usarlos (llama abierta tapas de botellas con un mechero de Bunsen) y usar puntas de pipeta estériles para dispensador. Almacenar la solución mineral en el refrigerador a 4 ° C.</li>
		<li>Después de la adición de todos los productos químicos, ajustar el pH a 7,0 con solución de NaOH de 1 M. Dispense el medio recién preparado en botellas de 125 mL suero. Verter 60 mL de medio en cada botella.</li>
		<li>Burbuja N2 en el medio durante 30 minutos eliminar el disuelto O2, usando el tubo pequeño conectado con la estación de2 N se describe en el paso 1. Coloque un tapón de goma butílica encima de cada botella, dejando una pequeña abertura para permitir que el exceso de gas salir de la botella. PRECAUCIÓN: Puede formar espuma mientras burbujeando con N2. Ajustar en consecuencia el flujo de gas para evitar la producción de espuma.</li>
		<li>Doble sello de cada botella con el tapón preparado y un sello de aluminio. El sello de aluminio asegura que la botella permanece cerrada durante el resto del protocolo.</li>
		<li>Desconecte la estación de2 N las agujas y la tubería delgada y reemplazarlos con agujas limpias (1 pulgada, ≤ 23 G). Ajuste las válvulas del tanque2 N para que un suave flujo continuo de gas sale del tanque (alrededor de 50 mL/min). Nota: Mayor de 23G de agujas pueden dejar permanentes unsealable agujeros en el tapón.</li>
		<li>Inserte una de las agujas conectadas al tanque de2 N en una botella de medio, a través del tapón de goma. Inmediatamente inserte otra aguja limpia en la misma botella. Repita este paso para las otras botellas y deje N2 flujo durante unos 30 minutos reemplazar el aire de las botellas por N2.</li>
		<li>Desconecte una botella desde la estación de2 N retirando la aguja correspondiente. Espere unos segundos hasta que la presión en la botella del medio disminuye a la presión atmosférica y quitar la segunda aguja. Repita este paso para todas las botellas restantes. PRECAUCIÓN: Para impedir que vuelva a entrar en las botellas de medio de cultivo después paso 2.1.4 O2 , realice los pasos 2.1.4 - 2.1.8 en rápida sucesión. Si todas las botellas no se puede conectar a la estación de2 N al mismo tiempo, continuar con pasos 2.1.4-2.1.8 para el primer conjunto de botellas y repita estos pasos para las restantes botellas.</li>
		<li>Autoclave de las botellas. Dejan enfriar a temperatura ambiente durante la noche y almacenar a temperatura ambiente luego.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de medio de crecimiento líquido para AMB-1 y MS-1<ol>
<li>Preparar una solución de quinate férrico de 10 mM. Primero disolver 0,19 g de ácido quínico en 100 mL de agua desionizada destilada, luego añadir 0,27 g de FECLAS3.6H2O. remover para disolver, hasta obtener una solución clara, rojo oscurezca. Autoclave de la solución usando un ciclo estándar (por lo menos 15 min de exposición a 121 ° C). Nota: Almacene la solución quinate férrica a temperatura ambiente en la oscuridad como una solución estéril. Desechar la solución cuando un precipitado se vuelve evidente.</li>
		<li>En un vaso de precipitados que contiene 1 L de agua destilada desionizada, agregue lo siguiente en orden mientras revuelve: 10,0 mL de la solución de suplemento de vitamina, 5,0 mL de la solución de suplemento de minerales de rastro, 0,68 g de KH2PO4, 0,848 g de succinato de sodio dibásico hexahidrato, 0,575 g de di-Sodio tartrato dihidrato, 0,083 g de acetato de sodio trihidrato, 0,45 mL 0.1% acuosa resazurina, 0,17 g de NaNO3, 0.04 g de ácido ascórbico y 3,0 mL de la solución madre de fe (III) quinate de 10 mM. Nota: Ajuste las cantidades proporcionalmente si se necesita una menor cantidad de medio de cultivo. Para una estación de2 N capaz de burbujeantes cinco botellas al mismo tiempo, como el construido en el paso 1 de este protocolo, preparar 300 mL de medio. PRECAUCIÓN: Vitaminas, minerales traza y quinate soluciones stock de fe (III) deben mantenerse estériles. Para evitar la contaminación, utilizar técnica estéril estándar y las puntas de pipeta estériles del despachador. Almacenar las soluciones de vitaminas y minerales en un refrigerador a 4 ° C.</li>
		<li>Después de la adición de todos los productos químicos, ajustar el pH a 6.75 usando solución de NaOH de 1 M.</li>
		<li>Se refieren a pasos 2.1.3-2.1.9 para el resto del protocolo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de medio de cultivo semisólido para MSR-1<ol>
<li>Preparar un 0,5 M fosfato buffer solución pH 7.0 disolviendo 3,362 g de K2HPO4 y 4,178 g de KH2PO4 en 100 mL de agua destilada desionizada. Compruebe si el pH es 7.0 y ajustar el pH con KH2PO4 o NaOH si es necesario. Almacenar la solución en un frasco de vidrio sellado (preferible al plástico con el fin de evitar el intercambio de oxígeno).</li>
		<li>Preparar 100 mL de una solución de clorhídrico de 0.02 M. Añadir 0,2 g de FECLAS2.4H2O a esta solución y mezclar para disolver para obtener una solución de cloruro de hierro de 10 mM. Almacenar la solución en la oscuridad en un frasco de vidrio sellado.</li>
		<li>Preparar una solución de bicarbonato de sodio de 0,8 M disolviendo 6,72 gramos de NaHCO3 en 100 mL de agua destilada desionizada. Almacenar la solución en un frasco de vidrio sellado.</li>
		<li>Autoclave de las soluciones preparan en pasos 2.2.1 - 2.2.3 usando un ciclo estándar (por lo menos 15 min de exposición a 121 ° C). Almacena soluciones como estériles en la oscuridad.</li>
		<li>En un vaso de precipitados que contiene 1 L de agua destilada desionizada, agregue lo siguiente en orden mientras revuelve: 5 mL de la solución de suplemento de minerales de rastro, 0.2 mL de solución acuosa de resazurina al 1%, 0,4 g de NaCl, 0,3 g de NH4Cl, 0,1 g de MgSO4.7H2 O, 0,05 g de CaCl2.2 h2O, 1 g de succinato de sodio, 0.5 g de acetato de sodio 0,2 g de levadura extracto, 1,6 g de agar.</li>
		<li>Cubrir el vaso con papel de aluminio y autoclave la solución preparada en el paso 2.3.5.</li>
		<li>Justo antes del final del ciclo de autoclave, preparar un fresco 4% L-cysteine· HCl· Solución de H2O por disolver 0,8 g de L-cysteine· HCl· H2O 20 ml de agua destilada desionizada. Neutralizar la solución a pH 7,0 con solución de NaOH de 5 M. PRECAUCIÓN: es importante que la solución de cisteína se prepara fresco para evitar la oxidación de la cisteína. Almacenar la solución mineral en el refrigerador a 4 ° C.</li>
		<li>Después de la esterilización en autoclave, deje enfriar el medio hasta 50 – 60 ° C y poner el vaso bajo la llama de un mechero de Bunsen. Retire el papel de aluminio y añadir rápidamente los siguientes en orden agitando suavemente: 0,5 mL de la solución de vitamina, 2,8 mL de la solución madre del tampón de fosfato estéril, 3 mL de la solución madre de hierro estéril cloruro, 1,8 mL del stock de bicarbonato de sodio estéril solución y 10 mL de solución de cisteína filtro esterilizado. Nota: Ajuste las cantidades proporcionalmente si se necesita una menor cantidad de medio de cultivo. Normalmente es conveniente preparar un lote de 120 mL de medio. PRECAUCIÓN: Todas las soluciones deben permanecer estériles para uso futuro. Realizar paso 2.3.8 utilizar técnica estéril y pipeta estéril consejos del despachador.</li>
		<li>Después de la adición de todos los productos químicos, transferir el medio caliente en tubos de 16 mL tapa a rosca estéril Hungate. Transferir 12 mL de medio en cada tubo y sellar los tubos. PRECAUCIÓN: Para evitar la contaminación, realizar paso 2.3.9 bajo la llama de un mechero de Bunsen. Realizar antes de que el agar se solidifica, mientras que el medio es a 40 ° C o superior.</li>
		<li>Deje los tubos reposar durante varias horas hasta que el agar se solidifica y la OAI se hace evidente, materializando como un rosado a incoloro interfaz, aproximadamente 1 a 3 cm debajo de la superficie del medio. Nota: El medio debe girar lentamente descolorido en el tubo. La cantidad de tiempo necesario para esta transición es variable y depende de la cantidad de O2 disuelto inicialmente en el medio.</li>
	</ol></li>
</ol>3. inoculación de MTB
Nota: Los cultivos de las cepas AMB-1, MS-1 y MSR-1 pueden obtenerse comercialmente (Tabla de materiales).
PRECAUCIÓN: Realice los siguientes pasos en condiciones estériles, bajo la llama de un mechero de Bunsen.
<ol><li>Inoculación de las cepas MSR-1, 1 AMB y 1 MS en medio líquido<ol>
<li>Sellar una botella de suero vacío 125 mL con un tapón de goma butílica y un sello de presión de aluminio. Inserte dos agujas en la botella con el tapón y conectar una jeringa preparada como en 1.7 paso a uno de ellos. Conectar la jeringa a un cilindro de O2 por el mismo tipo de tubería que el utilizado para la estación de2 N.</li>
		<li>Que flujo de O2 a través de la botella durante unos 30 minutos, para asegurar que todo el aire en la botella es sustituido por O2. Retirar ambas agujas, lo que permite una ligera sobrepresión en la botella y entonces el autoclave. Deje que la botella se enfríe a temperatura ambiente antes de usar. Nota: Para ahorrar tiempo, realice los pasos 3.1.1 y 3.1.2 durante la preparación media y autoclave la botella junto con el medio o las soluciones stock.</li>
		<li>Esterilizar las tapas de los tapones de la botella de medio fresca y la botella de2 O aplicando unas gotitas de solución de etanol 70% encima de ellos y pasar a través de la llama de un mechero de Bunsen.</li>
		<li>Utilizando una jeringa y una aguja estériles, extraer 1 mL de O2 de la botella de2 O y transferencia dentro de la botella de medio fresca. Asegúrese que la aguja firmemente en la jeringa durante este paso para evitar el aire en la jeringa.</li>
		<li>Si el inóculo de otra cultura en una botella de vidrio, esterilizar los tapones de la botella de medio fresca y el frasco de cultivo mayores aplicando unas gotitas de solución de etanol 70% encima de ellos y pasar a través de la llama de un mechero de Bunsen. Si utiliza el inóculo de un tubo de cultivo congelado, sólo que caliente hasta la temperatura ambiente con el tubo de sellado bajo la llama de un mechero de Bunsen.</li>
		<li>Si el inóculo de otra cultura en una botella de vidrio, inocular 1 mL de la mayor cultura en el medio fresco. Si el inóculo de un stock congelado, inocular solamente 0,1 mL para diluir el glicerol o dimetil sulfóxido (DMSO) utilizado en el proceso de congelación. En ambos casos, utilice una aguja estéril y una jeringa estéril.</li>
		<li>Incubar el cultivo a 32 ° C e inocular en medio fresco después de 4 a 7 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculación de MSR-1 en medio semisólido gradiente de O2<ol>
<li>Verifique que el tubo de medio fresco muestra una OAI bien definido, materializado por un color de rosa a incoloro interfaz.</li>
		<li>Si el inóculo procede de otra cultura semisólida gradiente de la concentración de O2 , recoger las bacterias por Pipetear 50 μl de la cultura con una pipeta estéril a la banda formada por las bacterias. Lentamente inocular estas bacterias en la OAI en el medio fresco (interfaz de color de rosa/descolorido), evitando molestar a la interfaz. Si el inóculo procede de una cultura congelada, proceda de la misma manera con 100 μl del inóculo en su lugar.</li>
		<li>Sellar el tubo y deje que las bacterias crecen entre 25 ° C y 30 ° C. Transferencia a medio fresco con el mismo procedimiento antes de la banda de bacterias llega a la superficie del medio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. observación de las bacterias
<ol><li>Esterilizar el tapón de la botella de cultivo aplicando solución de etanol 70% en la parte superior y pasar por la llama de un mechero de Bunsen. Para el medio semisólido, abra el tubo con la llama de un mechero de Bunsen. Use una aguja estéril y una jeringa estéril para extraer las bacterias.</li>
	<li>Uso el colgante gota método8 para asegurar que las bacterias son magnéticas y móviles. Nota: Microscopio de contraste de fase da grandes resultados pero no es obligatorio. Son aumentos que van desde 10 X hasta 60 X.</li>
	<li>Utilizar microscopia electrónica de transmisión (TEM) para observar la estructura celular y los magnetosomes en detalle8.</li>
</ol>

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<li>Uebe, R., Schüler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosome+biogenesis+in+magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621(2016).</li>
<li>Faivre, D., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+bacteria+and+magnetosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic bacteria and magnetosomes.</a> Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).</li>
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<li>Lefèvre, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+magneto-aerotactic+behaviors+and+oxygen+sensing+mechanisms+in+cultured+magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria.</a> Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los requisitos específicos de concentración de2 O de MTB hacen no trivial para crecer en el laboratorio. Un paso clave del Protocolo de medio líquido es la eliminación inicial de todos O2 del medio para el control de la concentración final mediante la adición de un volumen definido de O2, justo antes de la inoculación. Se ha demostrado que el MSR-1 crece en condiciones aerobias casi completamente, sin embargo, el magnetismo de las células se reduce drásticamente. Los resultados del mismo ...

Magnétotactiques bacterias (MTB) representan una amplia gama de procariotas gramnegativos ubicuos en ambientes acuáticos de agua dulce y marinos1. Estas bacterias comparten la habilidad de producir cristales magnéticos de magnetita (Fe3O4) o greigite (Fe3S4), que son en la mayoría de los casos montada en cadenas dentro de las células. Este motivo estructural particular es debido a la presencia de varias proteínas específicas que actúan tanto en el citoplasma de la bacteria y la membrana lipídica que envuelve cada cristal2. Cada cristal individual y su vesícula de membrana circundante se llama un magnetosome y es que van en tamaño desde unos 30 a 50 nm en Magnetotacticum especies3. Debido a la disposición de la cadena de magnetosomes, estas bacterias poseen un permanente momento de dipolo magnético que hace alinear pasivamente con campos magnéticos aplicados externamente. Por lo tanto, estas bacterias nadan activamente a lo largo de líneas del campo magnético, actuando como automotores micro-brújulas presumiblemente más efectivamente localizar las condiciones más favorables (por ej., concentración de O2 ) para el crecimiento.
Una propiedad interesante de MTB es su capacidad para regular la química y la cristalografía de los cristales de magnetosome. Mayoría de las cepas produce cristales de pureza relativamente elevada de magnetita o greigite, aunque algunos biomineralize ambos minerales4. En todos los casos, las bacterias son capaces de controlar con precisión el tamaño y la forma de sus cristales solo dominio magnético. Esto explica por qué una gran cantidad de investigación se lleva a cabo para desarrollar una mejor comprensión de cómo MTB realizar este proceso de biomineralización. Comprender este proceso permitiría a los investigadores a adaptar-hacer nanocristales magnéticos para muchos usos médicos y comerciales.
Un obstáculo importante a la investigación extensa sobre MTB ha sido la dificultad de cultivarlas en el laboratorio. Mayoría de las especies, incluyendo las cepas utilizadas en este trabajo, es obligatoriamente microaerofílico cuando se cultiva con O2 como aceptor terminal de electrones. Esto explica por qué estas bacterias más a menudo se encuentran en la zona de transición entre condiciones anóxicas y óxicas (la interfaz oxic-anoxic, OAI). Esto claramente muestra que MTB O2 concentración requerimientos precisos que obviamente debe tenerse en cuenta al elaborar medios de cultivo para estos organismos. Por otra parte, la gran diversidad existente de MTB implica que diferentes cepas tendrán diferentes tipos de gradientes químicos y nutrientes para lograr un crecimiento óptimo.
En este trabajo, describimos los métodos para el cultivo de tres de la MTB más ampliamente estudiado: magneticum Magnetotacticum (cepa AMB-1), M. Magnetospirillum (MS-1) y M. gryphiswaldense (MSR-1). Estas especies pertenecen a la clase Alphaproteobacteria en el phylum proteobacterias filogenéticamente, son helicoidales en morfología y poseen un flagelo polar en cada extremo de la célula. Proporcionamos los protocolos para el cultivo de cepa MSR-1 en líquido y O gradiente de concentración semisólidos medios2 , basados en recetas medio previamente publicados5,6. También presentamos un protocolo detallado para el cultivo de cepas 1 AMB y 1 MS en modificado magnético Spirillum crecimiento medio (MGSM)7.

<table><tbody><tr><td>AMB-1 Colección de</td><td>Cultivos Tipo Americano (ATCC)</td><td>ATCC 700264</td><td></td></tr><tr><td>MS-1</td><td>ATCC</td><td>ATCC 31632&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MSR-1</td><td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)</td><td>DSM 6361</td><td></td></tr><tr><td>Citrato férrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3388-250G</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de oligoelementos</td><td>ATCC</td><td>MD-TMS</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7 H2O</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop Canada Inc</td><td>HEP001.250</td><td></td></tr><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5506-250G</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fischer scientific</td><td></td> DF210929 <td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Fischer scientific</td><td>DF0436-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Solución de L-lactato de potasio (60%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60389-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-Ácido quínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138622</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3.6H2O</td><td>Fischer scientific</td><td>I88-100</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento vitamínico</td><td>ATCC</td><td>MD-VS</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de sodio hexahidratado</td><td>Fischer scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>L-tartrato de sodio dihidrato dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio trihidrato</td><td>EMD</td><td>SX0255-1</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Difco</td><td>0704-13</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Caledon</td><td>6620-1-65</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2 .4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44939-250G</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>EMD</td><td>SX0320-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2 H2O</td><td>EMD</td><td>1023820500</td><td></td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>FB0010</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína.HCl.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880-100G</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mL jeringas</td><td>Fischer scientific</td><td>B309659</td><td></td></tr><tr><td>25G&nbsp; x 1 agujas</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>125 mL frascos de suero</td><td>Wheaton</td><td>223748</td><td></td></tr><tr><td>20 mm sellos de aluminio</td><td>Wheaton</td><td>224223-01</td><td></td></tr><tr><td>Engarzadora E-Z de 20 mm</td><td>Wheaton</td><td>W225303</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de caucho butílico</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>2048-11800</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Hungate</td><td>Chemglass (VWR)</td><td>CLS-4208-01</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de tabique, 13 mm, Hungate</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>2047-11600</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de vidrio</td><td>Corning (VWR)</td><td>9826-16X</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico 36,5-38%, Biorreactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>11,6 - 12 N</td></tr></tbody></table>

cultivo de bacterias magnétotactiques del género magnetotacticum: cepas msr-1, 1 amb y ms-1

Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1

Magnétotactiques bacterias son procariotas Gram-negativos, móviles, principalmente acuáticos ubicuos en hábitats de agua dulce y marinos. Se caracterizan por su capacidad de magnetosomes biomineralize, que son magnéticos cristales tamaño de nanómetros de magnetita (Fe3O4) o greigite (Fe3S4) rodeados por una membrana de bicapa lipídica, en su citoplasma. Para la mayoría de las bacterias conocidas magnétotactiques, magnetosomes se montan en cadenas dentro del citoplasma, lo que confiere un permanente momento de dipolo magnético a las células y haciendo que alinear pasivamente con campos magnéticos externos. Debido a estas características específicas, magnétotactiques las bacterias tienen un gran potencial para aplicaciones comerciales y médicas. Sin embargo, la mayoría de especies son microaerofílicas y O2 concentración requisitos específicos, haciéndolos más difícil de cultivar rutinariamente que muchas otras bacterias como Escherichia coli. Aquí presentamos protocolos detallados para el cultivo de tres de las cepas más ampliamente estudiadas de bacterias magnétotactiques, todos pertenecientes al género Magnetotacticum. Estos métodos permiten un control preciso de la concentración de O2 a disposición de las bacterias, con el fin de asegurarse de que crecen normalmente y sintetizar magnetosomes. Cultivo de bacterias magnétotactiques para futuros estudios con estos procedimientos no requiere el experimentador a ser un experto en Microbiología. Los métodos generales presentados en este artículo pueden usarse para aislar y cultura otras bacterias magnétotactiques, aunque es probable que composición química de los medios de crecimiento tendrán que modificarse.

Exitosa preparación de los medios de crecimiento puede ser evaluada como sigue. Al final del proceso, claro soluciones (es decir., libre de cualquier precipitado) se debe obtener (esto es válido para los medios líquidos y el medio semisólido gradiente de O2 ). Una foto mostrando el aspecto esperado de medio líquido de MSR-1 antes de la inoculación puede verse en la Figura 2a. Un éxito medio semisólido O2 gradiente de concentraci...

Presentamos un procedimiento para el crecimiento de varias cepas de Magnetotacticum en dos tipos diferentes de medios de cultivo. Cepa gryphiswaldense Magnetotacticum MSR-1 se cultiva en líquido y gradiente de la concentración de O2 medios semisólidos mientras M. magneticum cepa 1 AMB y M. Magnetospirillum cepa MS-1 se cultivan en medio líquido.

Cultivo de bacterias magnétotactiques del género Magnetotacticum: cepas MSR-1, 1 AMB y MS-1

Magnetotactic bacteria are Gram-negative, motile, mainly aquatic prokaryotes ubiquitous in freshwater and marine habitats. They are characterized by their ...

Este método permite el cultivo de tres especies diferentes de bacterias magnetotácticas llamadas MSR-1, AMB-1 y MS-1. Todas las especies de agua dulce, y todas del género magnetospirillum. Es un primer paso esencial para cualquier tipo de investigación reproducible que involucre a estos organismos.Las bacterias magnetotácticas tienen requisitos de oxígeno muy específicos, por lo que desarrollaron un sistema de navegación magnética. Por lo tanto, es muy importante controlar la cantidad de oxígeno disponible para ellos. Todo este protocolo ha sido optimizado para algunas cepas específicas de magnetospirilla de agua dulce.Sus detalles se pueden optimizar para adaptarse a los requisitos de oxígeno y nutrientes de otras bacterias magnetotácticas. Instale de forma segura un tanque de gas nitrógeno cerca de un banco en el que haya suficiente espacio para instalar la estación de nitrógeno. Conecte un trozo de tubo al tanque que sea lo suficientemente largo como para llegar a la zona donde se construirá la estación.Si es necesario, aplique cinta de teflón a la salida del tanque para evitar cualquier fuga. Para construir una estación capaz de burbujear cinco botellas de medio al mismo tiempo, cortar cuatro trozos de tubo de aproximadamente cinco centímetros de longitud. Montar las piezas de tubo en una línea con tres accesorios de plástico en forma de T de 3 vías.Conecte un extremo de esta línea a la pieza de tubo a la salida del tanque de nitrógeno a través de un accesorio adicional en forma de T. Agregue un accesorio de codo de 90 grados en el otro extremo. Utilice cinta adhesiva para fijar la estructura a una varilla metálica horizontal colocada aproximadamente 30 centímetros por encima del banco.Conecte cinco piezas de tubo de aproximadamente 20 centímetros de longitud a las tres salidas de los accesorios instalados. Retire los pistones de cinco jeringas de plástico de un mililitro y corte el extremo más grande de estas jeringas, manteniendo sólo la parte graduada. Llene estas jeringas con algodón, teniendo cuidado de no empacar demasiado apretado.Inserte las jeringas en las piezas verticales de tubo de 20 centímetros de largo. Encienda el gas y use agua jabonosa para asegurarse de que no haya fugas cuando el nitrógeno fluya. Retire las tapas de cinco agujas de calibre 25 e inserte estas agujas en trozos de tubo delgado de 10 centímetros.Fije las agujas preparadas a las jeringas de la estación de nitrógeno. Asegúrese de que el nitrógeno fluye a través de las cinco líneas y mantenga la estación en espera. Preparar una solución de citrato férrico de 10 milímetros añadiendo 0,245 gramos de citrato férrico a 100 mililitros de agua desionizada destilada.Caliente y revuelva para disolver hasta obtener una solución transparente de naranja. Autoclave la solución utilizando un ciclo estándar de al menos 15 minutos de exposición a 121 grados Celsius antes de almacenar la solución de stock esterilizado a temperatura ambiente en la oscuridad. Para preparar cinco botellas de medio de crecimiento líquido para MSR-1, agregue los productos químicos enumerados en un protocolo de texto a un vaso de precipitados que contenga 300 mililitros de agua desionizada destilada.La adición del citrato férrico estéril y las soluciones minerales deben realizarse bajo la llama de un quemador Bunsen utilizando técnicas de esterilización. Las condiciones estériles son esenciales para evitar la contaminación del cultivo por otras especies bacterianas. Después de la adición de todos los productos químicos, ajuste el pH a 7.0 con una solución de hidróxido de sodio molar.Dispensar el medio recién preparado en botellas de suero de 125 mililitros, vertiendo 60 mililitros de medio en cada botella. Burbuja de nitrógeno en el medio durante 30 minutos para eliminar el oxígeno disuelto utilizando el pequeño tubo conectado a la estación de nitrógeno. Coloque un tapón de goma de butilo en la parte superior de cada botella, dejando una pequeña abertura para permitir que el exceso de gas salga de la botella.Después de 30 minutos, engarce cada botella con el tapón preparado y un sello de aluminio. El sello de aluminio asegura que la botella permanezca sellada durante el resto del protocolo. Desconecte las agujas y el tubo delgado de la estación de nitrógeno y reemplácelas con agujas limpias.Ajuste las válvulas del tanque de nitrógeno para que un flujo suave y continuo de gas salga del tanque. Ahora, inserte una de las agujas conectadas al tanque de nitrógeno en una botella de medio a través del tapón de goma. Inserte inmediatamente otra aguja limpia en el mismo frasco.Repita este paso para las otras botellas y deje que el nitrógeno fluya durante unos 30 minutos para reemplazar el aire de las botellas por nitrógeno. Después de 30 minutos, desconecte una botella de la estación de nitrógeno retirando la aguja correspondiente. Espere unos segundos hasta que la presión en la botella de medio disminuya a la presión atmosférica y retire la segunda aguja.Repita este paso para todas las botellas restantes. Para preparar 120 mililitros de medio de crecimiento semisólido para MSR-1, cubra el vaso con papel de aluminio y autoclave la solución preparada como se describe en el protocolo de texto. Justo antes del final del ciclo de autoclave, preparar una solución fresca de 4% de cisteína y ajustar el pH a 7.0 con una solución de hidróxido de sodio de cinco molares, como se describe en el protocolo de texto.Después del autoclaving, deje que el medio se enfríe a 50 a 60 grados Celsius, y lleve el vaso bajo la llama de un quemador Bunsen. Retire la lámina de aluminio y agregue rápidamente los productos químicos enumerados en el protocolo de texto utilizando técnicas estériles mientras agita suavemente. Añadir 1,2 mililitros de solución de cisteína esterilizada por filtro.Después de la adición de todos los productos químicos, transferir el medio caliente en 16 mililitros tubos de tornillo estéril Hungate. Transfiera 12 mililitros del medio a cada tubo y selle los tubos. Para inocular cepas MSR-1, AMB-1 y MS-1 en medio líquido, enmasca las tapas de las botellas medianas de oxígeno y fresco aplicando etanol en los tapones y pasándolas a través de la llama de un quemador Bunsen.Con una jeringa estéril y una aguja, extraiga un mililitro de oxígeno de la botella de oxígeno y transfiéralo al frasco mediano fresco. Si utiliza el inóculo de otro cultivo cultivado en una botella de vidrio, entella ambas botellas. Luego inocular un mililitro de la cultura más antigua en el medio fresco.Incubar el cultivo a 32 grados centígrados, e inocularlo en medio fresco después de cuatro a siete días. Para inocular MSR-1 en gradiente de oxígeno, medio semisólido, verifique que el tubo de medio fresco muestre un OAI bien definido, materializado por una interfaz de color rosa a incoloro de uno a tres centímetros por debajo de la superficie del medio. Si el inóculo proviene de otro cultivo semisólido gradiente de concentración de oxígeno, cosecha las bacterias aspirando 50 microlitros del cultivo con una punta de pipeta estéril colocada en la banda formada por las bacterias.Inocular lentamente estas bacterias en la OAI en el medio fresco, evitando perturbar la interfaz. Sella el tubo y deja que las bacterias crezcan entre 25 grados Centígrados y 30 grados centígrados. Para asegurarse de que las bacterias son magnéticas y modales, coloque una gota de cultivo en el resbalón de la cubierta del microscopio.Voltee el resbalón de la cubierta e instálelo en una junta tórica que descansa sobre un portaobjetos de vidrio. Asegúrese de que la caída no toque la diapositiva inferior. Coloque la gota colgante debajo de un microscopio y concéntrese en un borde de la gota.Coloque el polo sur de un imán cerca de ese borde, y observe cómo las bacterias nadan hacia el borde. Voltear el imán para hacerlos nadar en la dirección opuesta. Aquí se muestran las botellas de medios líquidos antes de la inoculación y después del crecimiento bacteriano.La turbidez en la segunda botella indica que las bacterias están creciendo. Esta película acelerada dos veces muestra el resultado esperado de un experimento de gota colgante para un cultivo de bacterias magnetotácticas modales y magnéticas. Las bacterias inicialmente nadaron hacia el borde de la gota cuando se aplica un campo magnético.Cuando se invierte la dirección del campo del imán, las bacterias nadan lejos del borde donde se aplica el campo magnético. Aquí se muestran tubos de medio semisólido antes de la inoculación y después del crecimiento bacteriano. Como era de esperar, una banda de bacterias se forma en la interfaz oxic-anoxic y migra con el tiempo a medida que se consume oxígeno y la interfaz se mueve hacia arriba.Aquí se muestra un micrografo electrónico representativo de un spirillum magnético. La flagelación se indica mediante las flechas negras, mientras que las flechas rojas muestran los magnetosomas. Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar que las bacterias magnetotácticas tienen requisitos de nivel de oxígeno muy específicos para crecer adecuadamente y producir magnetosoma.Este protocolo muestra cómo controlar y monitorear los niveles de oxígeno en los medios de crecimiento con el fin de lograr las micro condiciones preferidas por estos organismos. Siguiendo este método, se pueden obtener altas concentraciones de células sanas y altamente magnéticas. De esta manera, se pueden realizar experimentos que requieren grandes cantidades de bacterias, como la extracción de magnetosomas, estudios genómicos y genéticos, o la observación del movimiento colectivo por microscopía.La posibilidad de cultivar bacterias magnetotácticas en el laboratorio es realmente lo que ha permitido a los científicos explorar de manera sistemática las fascinantes propiedades bioquímicas y físicas de estos organismos.

growing-magnetotactic-bacteria-genus-magnetospirillum-strains-msr-1

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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