Medición de las interacciones de las proteínas globulares y filamentosas por espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Thermophoresis (MST)

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción proteica, como si la proteína se une directamente a una molécula pequeña o grande. La principal ventaja de esta técnica es que es una forma sencilla y rápida de detectar interacciones directas a nivel atómico. Encienda el flujo de aire con el comando de expulsión ej.

Esto traerá la muestra del imán. Ahora, coloque la muestra dentro de un spinner en la parte superior del imán en la abertura. Inserte con el comando ij.

Espere hasta que la muestra se asiente dentro del imán antes de continuar. Cree un nuevo conjunto de datos utilizando el comando edc y cargue los parámetros de RMN de protones estándar seleccionando el experimento ZGPR. Rellene los campos NOMBRE, número de experimento y número de carpeta de datos procesados.

Seleccione el disolvente en el campo Establecer disolvente y haga clic en Ejecutar getprosol para leer los parámetros estándar dependientes del cabezal de sonda y del disolvente. Bloquee la muestra en el disolvente deuterado utilizando el comando de bloqueo y espere hasta que haya terminado de barrer y logre el bloqueo. Corrija la frecuencia de resonancia del imán ajustando la muestra utilizando el comando de ajuste automático atma.

Supervise la curva del tambaleo hasta que se complete la sintonización automática. Shim el campo magnético usando topshim. El brillo hace el ajuste al campo magnético.

Logre uniformidad alrededor de la muestra. Es recomendable almacenar esto en valores con el comando wsh y leerlos usando rsh antes de topshim, si se utilizan las mismas muestras o similares. Ahora ajuste la ganancia del receptor con el comando rga para lograr la máxima relación señal-ruido.

Coloque el centro del espectro en el desplazamiento de resonancia de agua y ajuste el pulso de protones de 90 grados a alta potencia utilizando calibo1p1. Recoja el espectro de protones usando el comando zero go zg y procese con efp. Esto incluye la multiplicación exponencial, la descomposición de inducción libre que incorpora la ampliación de líneas, la transformación de Fourier de FID y pk para aplicar la corrección de fase.

Aplique el apk de corrección de fase automática y la corrección automática de línea base absn utilizando el polinomio sin opción de integración. Cree un nuevo conjunto de datos para el experimento SOFAST HMBC seleccionando SFHMQC3GPPH en el experimento. Copie el P1 y el O1 optimizados del espectro de protones y rellene los pulsos dependientes de P1 usando el comando getprosol 1H p1 plw1, donde p1 es el valor optimizado P1, y plw1 es el nivel de potencia para P1. Ahora, optimice la constante CNST54 para establecer el desplazamiento para el desplazamiento químico de amida.

Optimice también el CNST55 para definir el ancho de banda con el fin de abarcar las regiones espectrales de interés, permitiendo que la ganancia del receptor sea optimizada. Para seleccionar estos parámetros, extraiga el primer FID del espectro bidimensional y busque la señal observada para definirlos. Además, varíe el retardo de relajación, el número de escaneos y los escaneos ficticios para obtener una sensibilidad de señal aceptable con el comando gs, que permite ir y escanear para monitorear la calidad de los datos en tiempo real.

Finalmente, registre los espectros usando Zero Go zg. Establezca los parámetros de procesamiento en el tamaño de las dimensiones F2 directas e indirectas F1 del espectro, con predicción lineal opcional en la dimensión indirecta. Seleccione QSINE como la función Ventana e introduzca un desplazamiento de campana sinusita de dos para procesar el espectro bidimensional.

Introduzca el comando xfb para procesar los datos en ambas direcciones con la función de ventana y la transformación de Fourier. Utilice el comando apk2d para realizar la corrección automática de fase en ambas direcciones. Corrija la línea base con la función de corrección de línea base automática abs2 para datos 2D.

Esto aplica una función polinómica entre los valores ppm definidos en los parámetros de procesamiento y producirá un espectro 2D para su posterior análisis. Si tiene previsto realizar el procesamiento en serie para la comparación de datos de interacción con otra molécula, almacene los parámetros de procesamiento con el comando wpar y recuérdelos con rpar. Ingrese el comando pp para comenzar el proceso de selección de picos.

Defina el rango de ppm, la intensidad mínima y el número máximo de picos en función de los picos esperados. A continuación, haga clic en Aceptar. Verifique los resultados por inspección visual. Si es necesario, vuelva a ejecutar el proceso hasta que los resultados sean satisfactorios en función de la calidad de los espectros.

Genere una lista de picos con el comando pp. Esta lista de picos contiene información de altura de datos e intensidad máxima de forma predeterminada. La lista de picos se puede exportar a espectros posteriores y puede ser leída por otros programas.

Ahora observe los espectros de proteína HSQC para cambios en las intensidades máximas o movimiento en los cambios químicos que indican la interacción con otra molécula. Si la molécula que interactúa es grande, esperar reducciones en las intensidades máximas junto con la desaparición de algunos picos. Importe la lista de picos al siguiente conjunto de datos haciendo clic en la pestaña Picos y seleccionando Importar con un clic derecho en la ventana de picos.

Visualice los picos sobre el espectro y, si es necesario, descútelos a nuevas posiciones. Haga clic en Restablecer intensidades para completar la tabla para generar una lista de picos para el espectro que incluye intensidades. Esta lista de picos transferirá la información de posición de la lista de picos almacenada.

Exporte las listas de picos de diferentes conjuntos de datos a una hoja de cálculo u otro programa matemático para su análisis seleccionando la función Exportar. Calcular el cambio en las intensidades máximas con la intensidad máxima de la función en espectro complejo, intensidad máxima en el espectro de proteínas para cada pico. Los valores se pueden convertir a cambio porcentual por multiplicación por 100.

Tenga en cuenta que los volúmenes máximos también son útiles, aunque las intensidades máximas son más fáciles de medir para los picos que se colocan cerca uno del otro, como suele ser el caso de las proteínas con una alta densidad de picos relativamente amplios. Los N15HSQC fueron adquiridos para el tipo salvaje E-PRD, así como el mutante R1914E, en presencia o ausencia de VimRod. El espectro de tipo salvaje E-PRD muestra el número esperado de picos bien resueltos, indicativo de una proteína correctamente plegada.

En presencia de VimRod, el espectro muestra una ampliación de línea extensa y desaparición de picos, correspondiente a la unión entre E-PRD y VimRod. Se observan pocos cambios entre el espectro del mutante R1914E por sí solo y tras la adición de VimRod, lo que indica una falta de unión a este mutante E-PRD. Aquí las intensidades máximas de E-PRD en presencia y ausencia de VimRod se compararon y trazaron como las intensidades pico relativas para indicar el rango de ampliación de picos en el complejo E-PRD.

Para validar y cuantificar la unión de VimRod y E-PRD, el análisis MST utilizando His6-VimRod etiquetado con tinte fluorescente RED-tris-NTA como objetivo, se realizó utilizando la disminución de las concentraciones del ligando E-PRD. Los datos se ajustaban a un modelo estándar de unión de ligando de un sitio y daban un KD de 25,7 más o menos 2,1 micromolares. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar condiciones idénticas de adquisición y procesamiento.

luchará debido al acceso a muestras de proteínas etiquetadas con isótopos para la recolección de espectros de RMN. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de cáncer, infección o enfermedad neurodegenerativa porque implican la formación de interacciones proteicas que se ven comprometidas en la enfermedad.