Name: Medición de las interacciones de las proteínas globulares y filamentosas por espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Thermophoresis (MST) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende a medir interacciones proteína-proteína mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear y microescala termoforesis. Este protocolo permite detectar uniones directas a nivel atómico con proteínas marcadas con isótopos estables.

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Este proyecto ha sido apoyado por NSERC RGPIN-2018-04994, programa de innovación Campus Alberta (RCP-12-002 C) e Instituto de investigación de Alberta del prión / Alberta Innova Bio Solutions (201600018), otorgado a M.O y genoma Canadá y Fundación de Canadá para Becas de innovación otorgados al centro de Metabolómica de innovación (TMIC) y NANUC.

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Los autores no divulgar conflictos de interés.

2D 15experimento NMR resuelto N es uno de los más utilizados métodos para mostrar cómo dos moléculas interactúan. Es el método más rica en información que permite que las señales de ambos socios continuamente monitorizada durante un experimento de titulación en estado de solución. Aunque típicamente cualitativo en el caso de grandes complejos, el método puede también utilizarse en casos favorables para medir las afinidades de enlace donde se pueden rastrear señales NMR en espectros de alta resolución. Donde hacen las asignaciones pueden ser convenientemente, como en el caso de muchas proteínas bajo 20 KD de tamaño, los sitios de Unión pueden también asignarse. Ensayos complementarios como MST proporcionan información cuantitativa sobre interacciones en solución y requieren menos proteína en Estados sin etiqueta. Comparación de datos de enlace mutante es útil para proporcionar controles para asegurar que las interacciones que se evidencia por la ampliación de la línea de NMR son genuinas y no artefactos de, por ejemplo, cambios de agregación o la viscosidad.
Expresión de la proteína
Agilizar el proceso de expresión reduce la cantidad de producción de proteína intensiva de mano de obra. Parte de este proceso de optimización consiste en la identificación de una cepa apropiada de e. coli para la expresión recombinante de la proteína. Preferencia de cepa depende de elementos como la naturaleza del vector en uso y, más específicamente, la máxima estabilidad de la proteína recombinante expresada7. El riesgo de degradación de la proteína heteróloga por endógeno e. coli pueden reducirse por el uso de proteasas proteasas deficiente e. coli como la cepa BL21. Para los genes que contienen codones raros, se puede preferir una cepa como RIPL BL21-CodonPlus (DE3). Esta variedad combina el carácter deficiente de la proteasa de la cepa BL21 con copias adicionales de endógenas de codón raro tRNAs para arginina, isoleucina, prolina y leucina. Alternativamente, codones raros que pueden comprometer la sobreexpresión pueden evitarse ordenando una construcción optimizada de codón de una fuente comercial. Muchas cepas de e. coli están disponibles para la expresión de genes recombinantes, cada uno optimizado para la elusión de un problema particular en la expresión7. En el caso de este estudio, la cepa deficiente BL21(DE3) de proteasa estándar produce cantidades suficientes de proteína soluble para la posterior purificación y análisis.
Purificación de proteínas
El protocolo de purificación de una proteína dada es a menudo único en el sentido que cada proteína sigue siendo estable y soluble en diferentes condiciones tales como temperatura, concentración de sales o pH. La eficacia global de purificación mediante cromatografía de afinidad también es sensible a la concentración de especies liberador como imidazol en varios pasos durante el proceso de purificación. En este trabajo, las condiciones de amortiguamiento crítico para IMAC fueron pH para el E-PRD, imidazol concentración y para la VimRod. Un pH de 7.5 fue necesario para evitar la precipitación del PRD E después de elución inicial de la columna IMAC. Para la purificación de la IMAC de VimRod, aumentando la concentración de imidazol de 30 a 50 mM durante la etapa de lavado de columna fue encontrado para tener una mejora sustancial en la pureza de las fracciones elución final. La etapa de elución, aumentando la concentración de imidazol desde 250 hasta 350 m m también se han encontrado para mejorar el rendimiento de la elución final. Intentos iniciales a fin de eluir proteínas usando imidazol 250 mM llevaron a elución incompleta de VimRod según lo revelado por una tira de imidazol de 1 M final de la columna (datos no mostrados). Aumento de la concentración de imidazol hasta 350 m m para la elución fue suficiente para recuperar todo de la proteína enlazada a la columna. S puede servir a un propósito dual porque actúa como un paso de pulido para la purificación de la proteína mientras que simultáneamente realiza cambio de buffer. Cambio de buffer es un paso crítico para el análisis subsecuente de la Unión ya que elimina el imidazólico utilizado a fin de eluir proteínas etiquetadas His6. También sirve como una oportunidad para cambiar las condiciones tales como concentración de sal o pH, que puede afectar la eficacia de ciertas técnicas de aguas abajo o ensayos. Proteína de cambio térmico (PTS) puede utilizarse para identificar reservas óptimo para ensayos de aguas abajo, especialmente para aquellos que requieren proteínas estables para períodos prolongados de tiempo a temperatura ambiente8,9.
Análisis de enlace
Proteína que recién preparada es fundamental para los ensayos de Unión exacta, aunque congelado proteínas también pueden usarse siempre y cuando los resultados son comparados. Proteínas filamentosas como vimentina multimerize de una sal y pH dependiente, y por lo tanto la solución condicionan la necesidad de ser optimizado y el estado oligomérico estimada por un método como SEC10,11, dispersión de luz dinámica 12 o Ultracentrifugación analítica13,14,15. Espectroscopia de RMN es ideal para la medición de las interacciones ligando de pequeñas proteínas a resolución atómica. Sin embargo, cuando una proteína interactúa con la molécula más grande, sobreviene de secado más lento, y esto resulta en la pérdida de las señales, que pueden confirmar vinculante aunque no necesariamente permiten la asignación de sitios, que también requiere asignación de por lo menos de Unión columna vertebral resonancias. En este escenario, los experimentos NMR no permiten identificación del sitio de interacción. Por lo tanto sitio dirigido mutagénesis se aplica para identificar los residuos críticos necesarios para el enlace. Por lo tanto, estos mutantes no exhiben pérdida de señal. En el presente Protocolo, una forma mutante con una substitución en la posición 1914 conserva la intensidad de pico en la presencia de VimRod y confirma, por tanto, la interrupción de la interacción de E-PRD y VimRod. Asignación de las resonancias de columna vertebral y sidechain añadiría valor a este enfoque, particularmente como se ha resuelto la estructura de la E gratis-PRD por cristalografía de rayos x4. Futuras aplicaciones de la RMN incluyen la caracterización de las interacciones complejas entre las moléculas más grandes y se beneficiará de ultra alta imanes de campo y el uso de otros grupos observables como 13C-etiquetados y trifluoro metil grupos como reporteros.
MST tiene un número de ventajas para el estudio de las interacciones de enlace16. Los socios de la Unión son libres en solución y no inmovilizados. Análisis de la calidad de las muestras está incorporado en el software con control de calidad informes de agregación, adsorción en los capilares o etiquetado fluorescente insuficiente de la molécula objetivo. Se emplean pequeñas cantidades de la blanco, la concentración de la etiqueta meta es generalmente entre 20-50 nM en un 10-20 μL volumen de reacción. Este protocolo utiliza volúmenes de reacción muy pequeños (10 μL) para maximizar la concentración de ligando que se logra en las valoraciones que permite interacciones de enlace débil ser caracterizado. Esto requiere un pipeteo preciso y cuidado para evitar la introducción de burbujas durante la mezcla aún. Una mezcla adecuada es fundamental para la medición precisa y consistente de la fluorescencia a lo largo de la serie de diluciones seriadas. La cantidad de Tween-20 en los experimentos de MST se redujo de un estándar de 0.05% al 0.015% para disminuir la tendencia a crear burbujas y mejorar la mezcla.
El tinte rojo-Tris-NTA proporciona una manera rápida, fácil y conveniente de fluorescencia etiqueta cualquier proteína que tiene una etiqueta. El etiquetado es con eficacia completo en sólo 30 minutos y está muy apretado para que ningún procedimiento de eliminación de tinte es necesario. No hay modificaciones a residuos del aminoácido en la proteína que puede alterar las propiedades de enlace de ligando. Una advertencia es que solamente la proteína a ser etiquetados como debe tener una etiqueta de His6. Esto requiere la ruptura de la etiqueta de la proteína ligando, E-PRD y la eliminación de la etiqueta y uncleaved E-PRD con un segundo paso de columna IMAC. Si es posible, se preparara la proteína ligando sin el uso de una etiqueta. Por otra parte, las proteínas pueden ser covalente etiquetados como con un fluoróforo a amina a residuos de lisina o tiol a residuos de cisteína. Sin embargo, se debe tener cuidado al uso de estos sistemas desde el accesorio covalente de un fluoróforo puede afectar las interacciones de enlace electrostático o polar basándose en residuos de lisina o cisteína. La cuantificación de atar afinidad entre el VimRod y el E-PRD por MST era inusualmente sensible a la concentración de la sal. Este problema fue mitigado por diálisis inicialmente el objetivo y el ligando en el mismo lote de tampón de ensayo. Sin embargo, saturación de la curva de enlace de MST no podría ser alcanzado cuando se realiza el ensayo de MST en presencia de 150 mM de NaCl debido al comportamiento complejo de VimRod. Se obtuvieron datos confiables, completados una vez que la concentración de NaCl se redujo a 10 mM que permite el cálculo exacto de KD. Por lo tanto, se recomienda cuidadosa optimización de las condiciones de la solución y comparación con ensayos complementarios para lograr resultados robustos. Además, el MST puede utilizarse para cuantificar la dependencia sal de una determinada interacción, cuantificar las propiedades estequiométricas de las interacciones entre proteínas, plegamiento de la proteína del monitor y sonda en enzima cinética17.

Las interacciones entre las proteínas permiten la formación de máquinas moleculares que crear orden dentro de las células. Las interacciones individuales son a menudo débiles pero generalmente contribuyen a complejos polivalentes que pueden ser cooperativos y dinámicamente reglamentados. Ensayos sensibles que ofrecen resolución atómica e información cuantitativa acerca de tales interacciones complejas se necesitan deducir mecanismos y diseñar intervenciones como droga-como de moléculas. Espectroscopia de RMN es un método eficiente para la obtención de información sobre las interacciones entre proteínas y también se utiliza para la detección rápida de ligandos, incluyendo aquellos que se unen débilmente1. Los métodos de NMR se pueden categorizar en los que se observan proteínas o ligando observar. Este manuscrito utiliza el enfoque anterior en el que se adquiere un espectro de un isótopo estable etiquetado como proteína que es comparativamente pequeña (generalmente debajo de 20 kDa) y se titula el ligando sin etiquetar. Esto permitirá el etiquetado residuos implicados en la interacción que se asignará en casos favorables. Una vez que las formas complejas, hay cambios en los ambientes químicos de residuos de interacción que se manifiestan como cambios en la cambio química y forma de sus señales NMR. La magnitud de tales cambios se correlaciona con el grado de participación de estos grupos en la interacción. Perturbaciones de la cambio química (CSP) se pueden medir comparando una serie de espectros de RMN de la proteína en la ausencia y la presencia de cantidades variables del ligand. Para ligandos más grandes o complejas interacciones, el cambio en forma de pico o intensidad puede medirse para deducir las interacciones.
El experimento 2D más comun utilizado para la detección de las interacciones ligando es 15N heteronuclear quantum sola correlación (HSQC) experimento2. Esto requiere que una proteína uniformemente etiquetarse con 15N, que normalmente se consigue expresando como versiones etiquetadas con afinidad en cultivos bacterianos e. coli cultivadas en 15medios enriquecidos en N. Vinculante es evidente cuando se superponen los espectros HSQC reunidos durante la valoración, revelando cambios de pico para un subconjunto de los residuos implicados en la formación de complejos. La interacción puede ocurrir en el régimen de intercambio rápido donde las señales de estado libre y saturado de ligando colapsan en una población promediada pico. Por otra parte, en el caso de intercambio lento entre los Estados, ambas señales se observan con integrales que representan sus cantidades relativas. Mientras que el análisis de NMR lineshape pueden utilizarse para estimar las afinidades de enlace en algunos casos, métodos como el MST también han demostrado ser convenientes y proporcionan validación cruzada de las interacciones genuinas.
El ejemplo es de dos proteínas que se encuentran dentro de desmosomas. Median las ensambladuras entre las superficies de la célula y citoesqueleto y median interacciones multivalentes entre máquinas de adherencia de célula y los filamentos intermedios para mantener la integridad de la piel y los tejidos del corazón y soportar de las fuerzas de cizalla. Enfermedades pueden causar cuando desmosomal proteínas vimentina como desmoplaquina son comprometidas por mutaciones o autoanticuerpos, llevando a la desestabilización de las ensambladuras de la célula, y por lo tanto, sus interacciones son de importancia crítica3. La base estructural de ligando por desmosomal proteínas se caracteriza por espectroscopia de RMN, mientras que la interacción puede ser cuantificada por el MST. En este documento los métodos fueron utilizados para caracterizar las interacciones entre los dominios repetición plakin (PRDs) que a menudo están presentes como sistemas tándem que ofrecen canales básicos y el vimentin, un filamento intermedio que interactúa a través de una superficie ácida ofrece su helicoidal paquete4. Estos complejos se forman en la membrana celular donde ancla para filamentos intermedios del citoesqueleto de la célula a los desmosomas que unen a las células adyacentes, formando así una red de lazos adhesivos que irradia a lo largo de un tejido.

<table><tbody><tr><td>Monolito NT.115, incluye software de control y análisis</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-G008</td><td>Instrumento para termoforesis microscal</td></tr><tr><td>Kit de etiquetado His-Tag RED-Tris-NTA</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-L008</td><td>Colorante RED-tris-NTA para</td></tr><tr><td>capilares MST Estándar</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>CAPILARES MO-K022</td><td>para MST</td></tr><tr><td>HisTrap HP, 5 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>17524801</td><td>Columna IMAC</td></tr><tr><td>HisPur Resina Ni-NTA, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88222</td><td>Resina IMAC</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td>SEC</td></tr><tr><td>columna TEV proteasa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4455</td><td>escisión de su etiqueta de E-PRD</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527H</td><td>células para la expresión de proteínas</td></tr><tr><td>cOmplete Inhibidor de la proteasa Cocktail Tabletas sin EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td>inhibidores de la proteasa para la purificación de proteínas por IMAC</td></tr><tr><td>TCEP, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td>agente reductor para la purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Reactivos (HEPES, NaCl, etc)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>varios</td><td>Preparación de medios y tampones</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio (15N, 99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-467</td><td>Etiquetado de isótopos para RMN</td></tr><tr><td>D2O, óxido de deuterio (D, 99,8%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2259</td><td>Preparación de muestras de RMN</td></tr><tr><td>DSS, 2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfonato de sodio D6 (D,98%)</td><td>Referencia de Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-8206</td><td> para RMN</td></tr><tr><td>Tubos de RMN de precisión de 5 mm,</td><td>SJM/Deuterotubos</td> de 7" de largo Espectrómetro de RMN <td>BOROECO-5-7</td><td>Tubos de RMN</td></tr><tr><td>(14.1 Tesla)</td><td>Bruker</td><td></td><td>adquisición de datos de RMN</td></tr><tr><td>TCI 5mm z-PFG Adquisición</td><td>Bruker</td><td></td><td>de datos de RMN</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker TopSpin 4.0.1</td><td>Bruker</td><td></td><td>procesamiento de datos de RMN</td></tr><tr><td>MO. Tecnologías</td><td></td><td>de control NanoTemper</td><td>incluidas con Monlith NT.115</td></tr><tr><td>MO. Análisis de afinidad</td><td>Tecnologías</td><td></td> NanoTemper <td>incluidas con Monlith NT.115</td></tr></tbody></table>

medición de las interacciones de las proteínas globulares y filamentosas por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (rmn) y microescala thermophoresis (mst)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Proteínas filamentosas como vimentina proporcionan organización dentro de las células proporcionando un andamio estructural con los sitios que se unen a las proteínas que contienen plakin repite. Aquí, un protocolo para la detección y medición de tales interacciones se describe usando el dominio repetición del plakin globulares de envoplakin y la bobina helicoidal de vimentina. Esto proporciona una base para determinar si una proteína une vimentin (o proteínas filamentosas similares) y para la medida de la afinidad de la interacción. La proteína globular del interés marcada con 15N y tituló con vimentina proteína en solución. Un espectro de RMN bidimensional es adquirido para detectar las interacciones mediante la observación de cambios en forma de pico o cambios químicos y para dilucidar los efectos de las condiciones de la solución incluyendo los niveles de sal, que influyen en la estructura cuaternaria de la vimentina. Si la proteína de interés une el ligando filamentoso, se cuantifica la interacción vinculante por MST con las proteínas purificadas. El enfoque es una manera sencilla para determinar si una proteína de interés une a un filamento y para evaluar cómo alteraciones, tales como condiciones de la solución, o las mutaciones afectan la interacción.

El dominio E-PRD (residuos 1822-2014 clonados en HTC pProEX) del gene humano envoplakin y el dominio de VimRod (residuos 99-249 clonados en pET21a) de vimentin humano4 fueron expresadas con las etiquetas de His6 y purificada. Figura 6 y figura 7 muestran los niveles de pureza de VimRod (18,8 kDa) y E-PRD (21,8 kDa) obtenidos de este método de purificación de proteínas. La eliminación de His6 tag desde la construcción del PRD E es necesario para los experimentos de MST como la proteína VimRod se etiqueta con un tinte de His6 etiqueta obligatoria y cualquier E-PRD conserva su etiqueta de His6 puede competir para el atascamiento del tinte. La segunda columna IMAC después de la ruptura de la etiqueta con proteasa TEV elimina la proteasa TEV, la etiqueta exfoliada y cualquier uncleaved His6-E-PRD que seguía siendo. El paso de pulido final de la purificación es cromatografía por exclusión de tamaño. A pesar de ambas proteínas de tamaño similar, el VimRod elutes de la columna en un mL 51 mientras que el pico de elución E-PRD se centra en 72 mL donde se esperaría un monómero de la proteína de este tamaño. El aparente aumento de tamaño de VimRod es probable que debido a la sus características como una varilla larga filamentosa en forma de proteína analíticamente ultracentrífuga experimentos demostraron que la VimRod era monomérica4. Menores rendimientos de proteína se obtienen de las culturas cultivadas en M9 que de caldo rico debido a una menor cantidad de células que se producen en los medios de comunicación mínima. El crecimiento inicial de los cultivos más grandes para las preparaciones de M9 en TB permite la mejora de los rendimientos de la célula manteniendo la medida de 15N etiquetado es necesario para los experimentos de NMR.
El 15N -1HSQCs H fueron adquiridas para el tipo salvaje y mutante R1914E de E-PRD en presencia o ausencia de VimRod (figura 8A-8 D). El espectro del E-PRD en la figura 8A muestra el número esperado de picos bien resueltos, indicativos de una proteína bien plegada. En presencia de VimRod (figura 8B) el espectro muestra amplia línea ensanchamiento y desaparición de pico, correspondiente al enlace entre el E-PRD y VimRod. Este enlace se pierde por la mutación de R1914E según lo evidenciado por la comparación de la figura 8 y 8 D. Se observa poco cambio en el espectro con adición de VimRod a la mutante R1914E que indica una falta de unión entre este mutante E PRD y VimRod. Las intensidades de pico E-PRD en la presencia/ausencia de VimRod se compararon y trazadas como las intensidades pico relativo en figura 8E, que indica el rango de ampliación de pico en el complejo E-PRD. El mutante de R1914E E-PRD (no mostrado) retuvo cerca del 97% de los picos en 20% o más altas intensidades de pico en presencia de VimRod en comparación con alrededor del 20% para el tipo salvaje (figura 8E). Esto representa una pérdida del mutante de punto de función, con mutantes adicionales con efectos intermedios también después de haber sido estudiados4.
Para validar y cuantificar el atascamiento de análisis VimRod y PRD E MST utilizando His6-VimRod marcada con colorante fluorescente rojo-tris-NTA como destino mezclado con la disminución de las concentraciones de ligando E PRD de 1,28 mM a 39.1 nM fueron realizados. Tres titulaciones de Unión se llevaron a cabo y los resultados son un promedio y se muestra en la figura 9. Los datos se ajustaron con un modelo estándar del sitio de un ligando y dieron un KD de 25,7 μM ± 2.1. Evaluación de las uniones entre VimRod y E-PRD por la resonancia de plasmón superficial dio un valor de KD similar de 19,1 ± 1.3 μM4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig1.jpg"> Figura 1: pantalla de captura de la configuración del experimento NMR. La ventana mostrada se usa para configurar un experimento estándar para recoger un conjunto de datos HSQC. Parámetros del experimento se leen en junto al experimento. El experimento ZGPR que se muestra es escogido como un experimento inicial para cargar los parámetros estándar y solvente de protones dependiente. La ventana de título se usa para detalles experimentales para fines de mantenimiento de registros de entrada. Para recoger el espectro HSQC el experimento ZGPR se sustituye por SFHMQC3GPPH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig2.jpg"> Figura 2: ajuste de parámetros experimentales RMN. La ventana mostrada se usa para introducir los parámetros básicos para la secuencia de pulso NMR para optimizar la señal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig3.jpg"> Figura 3: RMN de procesamiento de datos. Parámetros utilizados para el procesamiento de cada una de las dos dimensiones del espectro NMR se muestran con flechas indicando que por lo general se ajustan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig4.jpg"> Figura 4: parámetros de cosecha pico RMN. Se muestran los parámetros utilizados para escoger NMR picos en el espectro NMR procesado con valores típicos. Ajustar la gama del ppm, la intensidad y el número de picos para optimizar los espectros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig5.jpg"> Figura 5: Representante Peaklist con intensidades de. Cada pico que se levanta en el espectro de RMN es dado un número y su 1H y 15N química cambia y se muestran la intensidad de la señal. Este peaklist entonces puede utilizarse para comparar los espectros obtenidos en ausencia y presencia de un socio de interacción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig6.jpg"> Figura 6: purificación del VimRod His6 tagged IMAC y S. A. El cromatograma para la elución de la columna IMAC muestra un pico importante de VimRod. B. el cromatograma para la elución de la columna S muestra un pico importante. C. SDS-PAGE de las fracciones recogidas a lo largo de purificación: normas MW con el MW indicaron en kDa a la izquierda del gel (M), lisado de células (1), fluir por IMAC (2), lavado (3), elución combinado (E1), agrupada S elución (E2). Bandas visibles en mayores pesos moleculares en líneas E1 y E2 son oligómeros de VimRod puro según lo confirmado por western blot (datos no mostrados). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig7.jpg"> Figura 7: purificación del E-PRD por IMAC y S. A. SDS-PAGE de la purificación de IMAC con los estándares de peso molecular con el MW indicados en kDa a la izquierda del gel (M) y el efluente de la primera columna IMAC (E1), la TEV escote productos (+ TEV) y el flujo a través de la segunda columna IMAC (FT). B. la cromatografía de la columna S muestra un pico importante. C. SDS-PAGE de los estándares de peso molecular (M) y las fracciones de pico S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig8.jpg"> Figura 8: HSQC espectros de tipo salvaje y mutante R1914E de E-PRD en presencia y ausencia de VimRod. Los espectros HSQC Mostrar tipo salvaje E-PRD (100 μm) en 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM TDT, pH 7 en la ausencia (A) o presencia de 50 μm VimRod (B). Los paneles C y D son los espectros HSQC del mutante R1914E (100μm) en la ausencia o presencia de 50 μm VimRod, respectivamente. En grupo E el pico de relativo 1H -15N intensidades del PRD E con o sin el atascamiento de VimRod se muestran en función del número máximo, que es asignado arbitrariamente y no se basa en la posición de la secuencia. Estos valores pueden utilizarse para definir un atajo de importancia para la reducción de la intensidad de pico sobre la adición de un ligando. Si las tareas están disponibles, a menudo se observan valores significativos para asignar a una zona de Unión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig9.jpg"> Figura 9: enlace de E-PRD a VimRod. E-PRD se diluyó en una serie de diluciones dobles de 1,28 mM a 39.1 nM y se incubaron con VimRod etiquetado antes de realizar el análisis de MST. Se combinaron los datos de tres ensayos independientes. Los datos se ajustaron a un modelo de KD dar un KD de 25,7 μM con una confianza de KD del μM ± 2.1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reactivo de</td>
			<td>Cantidad</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato de sodio, dibásico (anhidro)</td>
			<td>6,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato de potasio, fosfato monobásico (anhidro)</td>
			<td>3.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro de sodio</td>
			<td>0.5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Hasta 950 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Media M9 para el etiquetado isotópico.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reactivo de</td>
			<td>Cantidad</td>
		</tr>
<tr>
<td>
15 NH4Cl</td>
			<td>1.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucosa (o 13C-glucosa)</td>
			<td>2.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM CaCl2
</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL tiamina</td>
			<td>1,0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FECLAS de 3 mM3
</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metal Mix (cuadro 3)</td>
			<td>500 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Hasta 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2. Mezcla de nutrientes para medios de suplementación de M9.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reactivo de</td>
			<td>Cantidad</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mM ZnSO4
</td>
			<td>323 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM MnSO4
</td>
			<td>75,5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>4,7 mM H3BO3
</td>
			<td>145 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,7 mM CuSO4
</td>
			<td>55,9 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Hasta 500 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3. Metal Mix suplemento para enriquecer la mezcla de nutrientes de MT.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Muestra</td>
			<td>1 mM E-PRD en tampón A1 (μL)</td>
			<td>VimRod de 1mM en tampón A (μL)</td>
			<td>Buffer (μL)</td>
			<td>200 μm DSS en D2O (μL)</td>
			<td>Tampón B2 (μL)</td>
			<td>Total volumen (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD solo</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD + VimRod</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
1 Tampón A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM TDT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
2 Tampón B: 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 4. Preparación de la muestra de RMN.

Aquí, presentamos un protocolo para la producción y purificación de proteínas que están marcados con isótopos estables y posterior caracterización de las interacciones de la proteína-proteína usando la espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Los experimentos de Thermophoresis (MST).

Medición de las interacciones de las proteínas globulares y filamentosas por espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción proteica, como si la proteína se une directamente a una molécula pequeña o grande. La principal ventaja de esta técnica es que es una forma sencilla y rápida de detectar interacciones directas a nivel atómico. Encienda el flujo de aire con el comando de expulsión ej.Esto traerá la muestra del imán. Ahora, coloque la muestra dentro de un spinner en la parte superior del imán en la abertura. Inserte con el comando ij.Espere hasta que la muestra se asiente dentro del imán antes de continuar. Cree un nuevo conjunto de datos utilizando el comando edc y cargue los parámetros de RMN de protones estándar seleccionando el experimento ZGPR. Rellene los campos NOMBRE, número de experimento y número de carpeta de datos procesados.Seleccione el disolvente en el campo Establecer disolvente y haga clic en Ejecutar getprosol para leer los parámetros estándar dependientes del cabezal de sonda y del disolvente. Bloquee la muestra en el disolvente deuterado utilizando el comando de bloqueo y espere hasta que haya terminado de barrer y logre el bloqueo. Corrija la frecuencia de resonancia del imán ajustando la muestra utilizando el comando de ajuste automático atma.Supervise la curva del tambaleo hasta que se complete la sintonización automática. Shim el campo magnético usando topshim. El brillo hace el ajuste al campo magnético.Logre uniformidad alrededor de la muestra. Es recomendable almacenar esto en valores con el comando wsh y leerlos usando rsh antes de topshim, si se utilizan las mismas muestras o similares. Ahora ajuste la ganancia del receptor con el comando rga para lograr la máxima relación señal-ruido.Coloque el centro del espectro en el desplazamiento de resonancia de agua y ajuste el pulso de protones de 90 grados a alta potencia utilizando calibo1p1. Recoja el espectro de protones usando el comando zero go zg y procese con efp. Esto incluye la multiplicación exponencial, la descomposición de inducción libre que incorpora la ampliación de líneas, la transformación de Fourier de FID y pk para aplicar la corrección de fase.Aplique el apk de corrección de fase automática y la corrección automática de línea base absn utilizando el polinomio sin opción de integración. Cree un nuevo conjunto de datos para el experimento SOFAST HMBC seleccionando SFHMQC3GPPH en el experimento. Copie el P1 y el O1 optimizados del espectro de protones y rellene los pulsos dependientes de P1 usando el comando getprosol 1H p1 plw1, donde p1 es el valor optimizado P1, y plw1 es el nivel de potencia para P1. Ahora, optimice la constante CNST54 para establecer el desplazamiento para el desplazamiento químico de amida.Optimice también el CNST55 para definir el ancho de banda con el fin de abarcar las regiones espectrales de interés, permitiendo que la ganancia del receptor sea optimizada. Para seleccionar estos parámetros, extraiga el primer FID del espectro bidimensional y busque la señal observada para definirlos. Además, varíe el retardo de relajación, el número de escaneos y los escaneos ficticios para obtener una sensibilidad de señal aceptable con el comando gs, que permite ir y escanear para monitorear la calidad de los datos en tiempo real.Finalmente, registre los espectros usando Zero Go zg. Establezca los parámetros de procesamiento en el tamaño de las dimensiones F2 directas e indirectas F1 del espectro, con predicción lineal opcional en la dimensión indirecta. Seleccione QSINE como la función Ventana e introduzca un desplazamiento de campana sinusita de dos para procesar el espectro bidimensional.Introduzca el comando xfb para procesar los datos en ambas direcciones con la función de ventana y la transformación de Fourier. Utilice el comando apk2d para realizar la corrección automática de fase en ambas direcciones. Corrija la línea base con la función de corrección de línea base automática abs2 para datos 2D.Esto aplica una función polinómica entre los valores ppm definidos en los parámetros de procesamiento y producirá un espectro 2D para su posterior análisis. Si tiene previsto realizar el procesamiento en serie para la comparación de datos de interacción con otra molécula, almacene los parámetros de procesamiento con el comando wpar y recuérdelos con rpar. Ingrese el comando pp para comenzar el proceso de selección de picos.Defina el rango de ppm, la intensidad mínima y el número máximo de picos en función de los picos esperados. A continuación, haga clic en Aceptar. Verifique los resultados por inspección visual. Si es necesario, vuelva a ejecutar el proceso hasta que los resultados sean satisfactorios en función de la calidad de los espectros.Genere una lista de picos con el comando pp. Esta lista de picos contiene información de altura de datos e intensidad máxima de forma predeterminada. La lista de picos se puede exportar a espectros posteriores y puede ser leída por otros programas.Ahora observe los espectros de proteína HSQC para cambios en las intensidades máximas o movimiento en los cambios químicos que indican la interacción con otra molécula. Si la molécula que interactúa es grande, esperar reducciones en las intensidades máximas junto con la desaparición de algunos picos. Importe la lista de picos al siguiente conjunto de datos haciendo clic en la pestaña Picos y seleccionando Importar con un clic derecho en la ventana de picos.Visualice los picos sobre el espectro y, si es necesario, descútelos a nuevas posiciones. Haga clic en Restablecer intensidades para completar la tabla para generar una lista de picos para el espectro que incluye intensidades. Esta lista de picos transferirá la información de posición de la lista de picos almacenada.Exporte las listas de picos de diferentes conjuntos de datos a una hoja de cálculo u otro programa matemático para su análisis seleccionando la función Exportar. Calcular el cambio en las intensidades máximas con la intensidad máxima de la función en espectro complejo, intensidad máxima en el espectro de proteínas para cada pico. Los valores se pueden convertir a cambio porcentual por multiplicación por 100.Tenga en cuenta que los volúmenes máximos también son útiles, aunque las intensidades máximas son más fáciles de medir para los picos que se colocan cerca uno del otro, como suele ser el caso de las proteínas con una alta densidad de picos relativamente amplios. Los N15HSQC fueron adquiridos para el tipo salvaje E-PRD, así como el mutante R1914E, en presencia o ausencia de VimRod. El espectro de tipo salvaje E-PRD muestra el número esperado de picos bien resueltos, indicativo de una proteína correctamente plegada.En presencia de VimRod, el espectro muestra una ampliación de línea extensa y desaparición de picos, correspondiente a la unión entre E-PRD y VimRod. Se observan pocos cambios entre el espectro del mutante R1914E por sí solo y tras la adición de VimRod, lo que indica una falta de unión a este mutante E-PRD. Aquí las intensidades máximas de E-PRD en presencia y ausencia de VimRod se compararon y trazaron como las intensidades pico relativas para indicar el rango de ampliación de picos en el complejo E-PRD.Para validar y cuantificar la unión de VimRod y E-PRD, el análisis MST utilizando His6-VimRod etiquetado con tinte fluorescente RED-tris-NTA como objetivo, se realizó utilizando la disminución de las concentraciones del ligando E-PRD. Los datos se ajustaban a un modelo estándar de unión de ligando de un sitio y daban un KD de 25,7 más o menos 2,1 micromolares. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar condiciones idénticas de adquisición y procesamiento.luchará debido al acceso a muestras de proteínas etiquetadas con isótopos para la recolección de espectros de RMN. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de cáncer, infección o enfermedad neurodegenerativa porque implican la formación de interacciones proteicas que se ven comprometidas en la enfermedad.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

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