Name: Planta de crecimiento y transformación mediada por Agrobacterium de baño Floral de la Extremophyte Schrenkiella parvula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprende el método de inmersión floral para transformar Schrenkiella parvula mediante Agrobacterium. Este protocolo permite crear líneas transgénicas estables y estudiar adaptaciones de extremófilos a estrés salino.

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Este trabajo fue apoyado por un premio de la Fundación Nacional de Ciencias 1616827 de MCB.

1. crecimiento de la planta
<ol><li>
Esterilización de las semillas (opcional)
	<ol>
<li>Preparar la lejía de 50% en agua destilada doble (ddH2O) con 1 o 2 gotas de un detergente no iónico (véase Tabla de materiales) en un tubo de 50 mL. Invertir el tubo varias veces para mezclar la solución. Nota: Es preferible llevar a cabo la esterilización de las semillas en un flujo laminar con una superficie esterilizada UV durante 15 minutos.</li>
		<li>Añadir la solución de lejía a ~ 100-200 semillas S. parvula en un tubo de 1,5 mL. Mezcle bien y deje el tubo durante 5 minutos.</li>
		<li>Quitar el cloro del tubo y añadir etanol al 70%. Lavar las semillas mediante pipeteo varias veces y retire inmediatamente la solución de etanol.</li>
		<li>Lavar las semillas en agua esterilizada para extraer etanol y exceso de lejía y luego quitar el agua. Repita este paso 5 o 6 veces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estratificación de semillas
	<ol>
<li>Sumergir las semillas en agua esterilizada y guardar durante 5 a 7 días a 4 ° C. Alternativamente, siembre semillas secas no esterilizadas directamente en suelo mojado y coloque la bandeja de suelo de 5 a 7 días a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultivo de plantas en la preparación de la transformación
	<ol>
<li>Llenar el suelo mezclar (véase Tabla de materiales) en macetas de 7 x 6 cm2 , remojo las macetas en agua y rociar el agua de la parte superior para asegurar un medio de crecimiento uniformemente húmedo. Agregar granos de 5 – fertilizante (véase Tabla de materiales) en la superficie del suelo de cada maceta. Nota: Como hemos experimentado, S. parvula crece bien en cualquier mezcla de suelo donde puede crecer a. thaliana .</li>
		<li>Usando un palillo de dientes mojado, transferencia 20 ~ 25 semillas por maceta en la superficie del suelo. Nota: Una práctica conveniente es poner un lote de 4 a 5 semillas en las cuatro esquinas y el centro de la maceta (figura 1, día 15, el panel izquierdo).</li>
		<li>Cubrir la bandeja del pote con una cúpula transparente para mantener las semillas bajo alta humedad durante la germinación.</li>
		<li>Mantenga las bandejas de planta en una cámara de crecimiento con una intensidad de luz fijada en 130 μmol m−2 s−1 luz, 22 – 24 ° C de temperatura y 14 h por día/10 h / ciclo de noche. Retire las cúpulas 7-10 días después de la germinación. Añadir agua de la parte inferior de la bandeja para mantener el suelo humedecido uniformemente en un nivel deseable.</li>
		<li>Eliminar las plantas de semillero extras y dejar sólo 4 – 5 plántulas sanas por maceta bien separada entre sí (figura 1, día 15, panel derecho).</li>
		<li>Regar las plantas cada dos días y fertilizar con 0.2 x solución16 de Hoagland una vez cada dos semanas. Nota: Mantener la humedad del suelo a un nivel uniforme es clave al cultivo S. parvula constantemente y sano.</li>
		<li>Siguen creciendo las plantas para 8-10 semanas hasta inflorescencias múltiples producen 100 – 150 yemas florales por planta (figura 1, día 60 – 80). En el día previsto para la transformación de base floral dip (paso 4.5), quite todas silicuas maduras y en desarrollo de las plantas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. clonación en un Vector el elemento genética/genómica de interés para la transformación de la planta
<ol><li>Amplificar el fragmento de ADN de destino utilizando la polimerasa de reacción en cadena (PCR)17 y aislar el producto PCR mediante una extracción de gel kit (véase Tabla de materiales) según el protocolo del kit o cualquier otro método apropiado para purificar ADN mediante gel de agarosa electroforesis17,18. Verificar la secuencia de lo aislado del producto de PCR mediante secuenciación de Sanger19.</li>
	<li>Clon el producto deseado de la PCR en el vector de clonación y transformar el constructo clonado en la competente e. coli las células usando una topoisomerasa clonación basada en kit (véase Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Extensión 50 μl de los productos transformados en Luria-Bertani20 (LB) agar crecimiento bacteriano los medios de comunicación (tabla 1) con los antibióticos apropiados, ej., 50 μg / mL espectinomicina (véase Tabla de materiales) e incubar a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, seleccione colonias solo 5 – 10, inocular en medio LB líquido con los antibióticos apropiados e incubar con agitación suave a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Plásmidos aislados mediante un aislamiento del plásmido kit (véase Tabla de materiales) y verificar a través de la secuenciación de Sanger19 si la secuencia de destino amplificada en 2.1 se clona correctamente.</li>
	<li>Transferir el producto de PCR clonado y verificado a un vector de destino para la transformación de la planta compatible con clonación basada en la recombinación (véase Tabla de materiales), utilizando una mezcla de enzima recombinase kit siguientes (véase Tabla de materiales), instrucciones del fabricante del kit. Repita del paso 2.3 paso 2.5 para aislar y verificar clones albergar construcciones de plásmido adecuado.</li>
</ol>3. transformar la construcción de vectores para la transformación de la planta de Agrobacterium tumefaciens
<ol><li>Transformar el plásmido de la construcción del vector de 2,6 en la cepa de a. tumefaciens GV3101:pMP90RK21, que abriga un gene de resistencia rifampicina para la selección de fondo cromosómica. Uso de antibióticos apropiados, por ejemplo, gentamicina o kanamicina (véase Tabla de materiales), para la selección de la planta de transformación construir (plásmido Ti). Un protocolo breve de a. tumefaciens transformación por electroporación está incluido en la sección 3.2.</li>
	<li>
A. tumefaciens transformación por electroporación
	<ol>
<li>Descongelar las células competentes de a. tumefaciens 22 en hielo. Mezclar 0.1 – 1 μg de plásmido preparado a partir de 2.6, disuelto en 1-2 μl de ddH2O, con células competentes en el hielo. Transferir la mezcla en una cubeta de electroporación (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Realizar electroporación en la mezcla de células competentes de 3.2.1, usando un electroporator y plásmidos (véase Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante. Nota: Limpie la superficie de la cubeta antes de la electroporación.</li>
		<li>Transferir la mezcla de reacción de la cubeta a un tubo de microcentrífuga que contiene 1,5 mL de LB líquido y mezclar bien con el pipeteo e incubar durante 1 h a 28 ° C con agitación suave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inocular la transformada a. tumefaciens de la sección 3.2 en placas de LB que contengan antibióticos de selección apropiada (p. ej. kanamicina 25 μg / mL, espectinomicina 50 μg / mL, gentamicina 25 μg / mL y rifampicina 50 μg / mL) e incubar a 28 ° C durante 3 días.</li>
</ol>4. mediada por Agrobacterium transformación de S. parvula
<ol><li>Inocular el solo transforman colonias de las placas en 10 mL de medio líquido LB que contienen antibióticos (igual que en 3.3) en una estéril 50 mL cónico del tubo (véase Tabla de materiales). Incubar durante 24 h en un incubador de agitación (véase Tabla de materiales) a 250 rpm a 28 ° C.</li>
	<li>Transferir la solución bacteriana de 3.4.1 a un matraz estéril de 250 mL, agregar 40 mL de medio líquido LB con los antibióticos apropiados e incubar 12 h hasta que la densidad óptica en longitud de onda 600 nm (OD600) alcanza alrededor de 2.0.</li>
	<li>Centrifugar el a. tumefaciens cultureat 3.100 x g durante 10 minutos Retire el sobrenadante y resuspender el cultivo bacteriano en 40 mL de solución de infiltración de a. tumefaciens (tabla 1).</li>
	<li>Diluir el resuspendido a. tumefaciens con solución de infiltración para un final de OD600 de 0,8. Añadir 25 μl de solución de surfactante (tabla 1) a 50 mL de a. tumefaciens diluida de la solución y mezclar invirtiendo varias veces.</li>
	<li>Inmersión de la inflorescencia de las plantas en la solución de a. tumefaciens preparado en la sección 4.4 para 20 s. una fresca solución bacteriana después de la inmersión inflorescencia de seis botes. Asegúrese de que todas las flores están en contacto con la solución. Soluciones bacterianas pipeta directamente flores situados en la parte inferior de la inflorescencia no se sumergieron en la solución. Nota: Para la transformación de la primera ronda, asegúrese de quitar todos silicuas maduras y en desarrollo, utilizando un bisturí afilado o tijeras pequeñas. No retire silicuas en caso de transformación por segunda vez.</li>
</ol>5. transformación de la planta cuidado y la segunda transformación
<ol><li>Coloque las plantas florales-cruce horizontalmente en charolas limpias con cúpulas para cubrir las plantas y colocar en una habitación oscura crecimiento durante 1 – 2 días. Nota: Mantener las flores bajo alta humedad es importante en esta etapa (figura 1, las plantas después de la transformación).</li>
	<li>Volver las plantas a una posición vertical y las plantas de transferencia a un cuarto de crecimiento con un h 14 por día/10 h por ciclo nocturno, 130 μmol m-2 s-1 intensidad de la luz y temperatura de 22 a 24 ° C.</li>
	<li>Supervisar las inflorescencias sumergidas en la semana siguiente. Si un número significativo de las flores abortan (figura 2), repetir la inmersión floral (paso 4) después de 4 semanas o después de que recientemente ha desarrollado un gran número de flores. Nota: A diferencia de la etapa de preparación para la primera transformación (paso 1.3.7), no retire la preexistente o en desarrollo silicuas (figura 2) antes de la segunda ronda de la transformación.</li>
	<li>Crecer las plantas hasta que las semillas maduran y cosechan semillas en ~ 21 semanas.</li>
	<li>Semillas secas durante 2 – 3 semanas a temperatura ambiente en un recipiente hermético con llenan de desecantes (véase Tabla de materiales).</li>
</ol>6. selección de transformantes positivo
<ol><li>Planta las semillas de la T1 como se describe para las semillas de tipo salvaje en pasos 1.2 a 1.3.</li>
	<li>Crecer las plantas hasta que se convierten las 2 primeras hojas verdaderas, aproximadamente de 10 a 14 días después de la germinación.</li>
	<li>
Realizar la primera selección para resistencia a los herbicidas (figura 3A y 3B) como se detalla a continuación.
	<ol>
<li>Diluir el herbicida glufosinato-amonio (11.3%) (o BASTA) (tabla 1) para 1:1,000 (v/v). Spray solución diluida BASTA las plantas de semillero y las plantas con bóvedas de la cubierta durante la noche.</li>
		<li>BASTA pulverizar 2-3 veces de repetir cada 5 – 7 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realizar la segunda selección mediante una prueba de gota BASTA como se detalla a continuación.
	<ol>
<li>Identificar las plantas que sobreviven después de ser rociada 3-4 veces con solución BASTA. Crecer las plantas para otro 2-3 semanas hasta 3 a 5 hojas desarrollan un área superficial relativamente grande.</li>
		<li>Seleccione la hoja madura más grande por planta, frote la superficie de la hoja suavemente con un dedo para eliminar la capa de cera y coloque una gota de la solución diluida BASTA (de paso 6.3.1). Nota: Marque la ubicación de la hoja aplicada con la gota BASTA colocando una cinta de papel sobre el tronco más cercano.</li>
		<li>Seguimiento de las hojas aplicadas con la gota BASTA para detectar signos de marchitez durante hasta una semana. Seleccionar las plantas con hojas inafectadas por las gotas BASTA. Nota: Hojas de las plantas más falsos positivos comienzan a marchitarse dentro de dos días, mientras que hojas de verdaderos positivos están intactas, incluso después de que la gota de la solución BASTA seca (figura 3C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confirman positivo transformantes mediante PCR genomic.
	<ol>
<li>Obtener 2-3 hojas de las plantas sobrevivientes al paso 6.4.5.</li>
		<li>Extracto de ADN genómico de las hojas utilizando el método CTAB23 o cualquier otro DNA extracción método apropiado.</li>
		<li>Realizar PCR utilizando muestras de ADN genómicas extraídas de las plantas, las plantas de tipo salvaje (como controles negativos) y la construcción del plásmido en el paso 3.1 (como control positivo). Utilice un par apropiado de cebadores PCR específicas para el gen marcador selectivo, por ejemplo,, gen BASTA-resistente (bar), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (en adelante) y GTCAACCACTACATCGAGACAA (atrás).<ol>
<li>Para los iniciadores de la polimerización en cadena de ejemplo contra el gen bar , utilice las siguientes condiciones PCR: el paso de desnaturalización inicial a 98 ° C por 30 s; seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 98 ° C por 30 s, recocido a 59 ° C por 30 s y extensión a 72 ° C por 30 s; y la extensión final a 72 ° C durante 5 minutos. Nota: Para asegurar la inserción de la DNA de T toda, se recomienda también realizar genómica polimerización en cadena usando una cartilla PCR del gen marcador selectivo y otra cartilla PCR específica para la secuencia de destino clonados en el vector de transformación de plantas en el paso</li>
		</ol>
</li>
		<li>Confirmar la presencia del tamaño esperado del producto PCR amplificado bar por gel de agarosa electroforesis17 para las muestras de destino (figura 4A), así como mediante la secuenciación de aislados PCR producto19 usar el mismo procedimiento como en el paso 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El estado fisiológico de la planta influye significativamente en la eficiencia de transformación25. El uso de plantas sanas y vigorosas para la transformación es un requisito clave para la exitosa transformación en S. parvula. Agua o luz plantas tendrán menos flores en comparación con las plantas saludables ideales para la transformación (figura 1, panel central). Parvula de S. puede crecer en una intensidad de luz inferior a 130 μmol m-2 ...

En este protocolo, se describen el crecimiento y establecimiento de líneas transgénicas estables para el modelo extremophyte Schrenkiella parvula. La disponibilidad de un sistema eficiente de transformación es una característica distintiva de cualquier modelo genético. Plantas que prosperan en ambientes extremos, que se refiere como extremophytes, proporcionan un recurso crítico para la comprensión de adaptaciones de la planta al estrés ambiental. Schrenkiella parvula (anteriormente Thellungiella parvula y Eutrema parvulum) es una modelo extremophyte, con la expansión de recursos genómicos1,2,3,4,5. Sin embargo, protocolos de transformación aún no han sido denunciados por S. parvula en estudios publicados.
El genoma de S. parvula es el primer genoma de extremophyte publicado en Brassicaceae (familia de mostaza-col) y muestra un extenso synteny genoma total con el modelo no-extremophyte,1de Arabidopsis thaliana. Por lo tanto, estudios comparativos entre la a. thaliana y S. parvula podrían beneficiarse de la riqueza de los estudios genéticos realizados en a. thaliana para hacer hipótesis informativas sobre cómo ha evolucionado y regulado el genoma de S. parvula diferente para hacer frente a extremos ambientales destaca5,6,7. Parvula de S. es una de las especies más tolerantes a la sal (basadas en suelo NaCl LD50) entre conocidos parientes silvestres de a. thaliana8. Además de la tolerancia de NaCl, S. parvula sobrevive y completa su ciclo de vida en presencia de varios iones sal a altas concentraciones de tóxicos para la mayoría de las plantas7. En respuesta al estrés abiótico en su hábitat natural, ha evolucionado varios rasgos, entre los cuales varios han sido estudiados en la bioquímica o fisiológica nivel 8,9,10, 11.
Desde 2010, ha habido más de 400 publicaciones peer-reveiwed que utilizan S. parvula como una especie de objetivo o utilizan en comparación con otros genomas de plantas. Sin embargo, un evidente cuello de botella se podía identificar con un vistazo de qué tipo de estudios se han realizado. La mayoría de estos informes discutir el potencial uso de parvula S. en futuros estudios o usos en genómica comparativa y estudios de phylogenomic. Debido a la falta de un protocolo de prueba de concepto de transformación establecido por S. parvula, no se ha utilizado en estudios de genómica funcional, a pesar de tener uno de los genomas de plantas de calidad más alta disponibles hasta la fecha (> 5 Mb contig N50) montado y anotado en pseudomolecules nivel del cromosoma1.
El método de transformación mediada por Agrobacterium de inmersión floral se ha convertido en el método más ampliamente usado para crear líneas trasngenic en a. thaliana, y el desarrollo de un sistema reproducible de transformación fue un factor decisivo en su éxito como una modelo genético12,13. Sin embargo, no todas las especies de Brassicaceae se han demostrado para ser transformado con éxito usando el método de inmersión floral desarrollado de a. thaliana. Especialmente, las especies de Brassicaceae Lineage II que incluyen S. parvula ha sido recalcitrante a los métodos de transformación base floral dip14,15.
El hábito de crecimiento indeterminado de la floración de S. parvula, combinado con su morfología de hoja estrecha, ha hecho difícil adoptar el método de transformación de floral dip estándar mediada por Agrobacterium. En este estudio, Divulgamos el protocolo modificado que hemos desarrollado para la transformación reproducible de S. parvula.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-762</td><td>Bacto Agar Soldificante, BD Diagnostics</td></tr><tr><td>Vitaminas B5</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1019</td><td>Gamborg' s Desecante de solución vitamínica</td></tr><tr><td></td><td>W A Drierita Hammond, Xenia, OH</td><td>22005</td><td>Malla indicadora de DRIERITA 6</td></tr><tr><td>Vector de destino para la transformación de plantas</td><td>Vector TAIR</td><td>:6531113857</td><td>pKGWFS7</td></tr><tr><td>Cubeta de electroporación</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td>Cubeta de electroporación, tapa redonda, espacio de 0,2 cm</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td><td>1652100</td><td>MicroPulser Electroporator</td></tr><tr><td>Perlas de fertilizante</td><td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td><td>N/A</td><td>Osmocote Smart-Release Plant Food&nbsp; Flor & Kit</td></tr><tr>de<td>extracción de gel</td> vegetal <td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td><td>17289</td><td>MEGAquick-spin Kit de purificación de ADN de fragmentos totales</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1914-5G</td><td>Sulfato de gentamicina</td></tr><tr><td>Herbicida glufosinato de amonio (11,3%) (BASTA)</td><td>Bayer environmental science, Montvale, N</td><td>/A</td><td>FINALE herbicida</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>200004-444</td><td>Monosulfato de kanamicina</td></tr><tr><td>MES</td><td>Bioworld, Dublín, OH</td><td>41320024-2</td><td>MES, sal MS ácida libre</td></tr><tr><td></td><td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td><td>092621822</td><td>Mezcla de sales basales basales modificadas de Hoagland</td></tr><tr><td>N6-bencilaminopurina (BA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>B3274</td><td>Solución de 6-benzilaminopurina</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Alrich</td><td>S7653</td><td>Cloruro de sodio</td></tr><tr><td>Detergente no iónico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>9005-64-5</td><td>TWEEN 20&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de plásmidos</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>D4036</td><td>Kits de plásmidos Zyppy Kit</td></tr><tr>de<td>mezcla de enzimas recombinasas</td><td>Life Technology</td><td>11791-020</td><td>Gateway LR Clonasa II Mezcla de enzimas</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R3501-1G</td><td>Rifampicina, polvo, 
&#8805; 97% (HPLC)</td></tr><tr><td>Incubadora de agitación</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SHKE4450</td><td>MaxQ 4450 Agitadores orbitales de sobremesa</td></tr><tr><td>Mezcla de tierra</td><td>Sun Gro</td><td>SUN239223328CFLP</td><td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>IC15206705</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos estériles de 50 ml</td><td>USA Scientific, Ocala, FL</td><td>1500-1811</td><td>50 mL tubos cónicos con tapón de rosca, copolímero, gradillas,</td></tr><tr><td>sacarosa</td> estéril <td>VWR International, Radnor, PA</td><td>57-50-1</td><td>Sacarosa, solución de</td></tr><tr><td>surfactante</td> ACS <td>Semillas de Lehle, Round Rock, TX</td><td>VIS-02</td><td>Silwet L-77</td></tr><tr><td>Kit de clonación a base de topoisomerasa</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>K240020</td><td>Kit de clonación pENTR/D-TOPO, con One Shot TOP10 Químicamente Competente E. coli</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-282</td><td>BD Bacto Tryptone, BD Biosciences</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-722&nbsp;</td><td>Extracto de levadura BD Bacto, BD Biosciences</td></tr></tbody></table>

planta de crecimiento y transformación mediada por agrobacterium de baño floral de la extremophyte schrenkiella parvula

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula es un extremophyte adaptado a varios abiótico, incluyendo múltiples tensiones de la toxicidad de iones. A pesar de recursos genómicos de alta calidad disponibles para el estudio de cómo las plantas se adaptan a ambiente destaca, su valor como un modelo de genómica funcional y la herramienta ha sido limitada por la falta de un sistema de transformación posible. En este protocolo, informe cómo generar transgénicos estable S. parvula líneas utilizando un método de inmersión floral mediada por Agrobacterium. Modificamos el protocolo de transformación utilizado para a. thaliana para tener en cuenta las características únicas de S. parvula, como un hábito de floración indeterminada y un contenido alto de cera epicuticular en las hojas. Brevemente, las semillas de S. parvula se estratificaron a 4 ° C durante cinco días antes de la siembra. Las plantas fueron cultivadas en un fotoperiodo de luz 14 h y 10 h oscuro y una 130 μmol m-2s-1 intensidad de la luz, a 22 ° C a 24 ° C. Ocho a nueve semanas de edad las plantas con inflorescencias múltiples fueron seleccionado para la transformación. Estas inflorescencias se sumergieron en una solución de infiltración de Agrobacterium tumefaciens GV3101 llevan el plásmido pMP90RK . Se realizaron dos rondas de flor de inmersión con un intervalo de tres a cuatro semanas para aumentar la eficiencia de transformación. Las semillas de T1 fueron recogidas y secadas durante cuatro semanas en un recipiente con desecante antes de germinación a pantalla para candidato transforma líneas. Resistencia a la BASTA fue utilizada para plantas de T1. Pulveriza la solución BASTA tres veces con un intervalo de tres días a partir de dos semanas de edad las plantas reducir falsos positivos. Se realizó una prueba de gota BASTA de sobrevivir las plantas individuales para identificar transformantes positivo verdadero. La eficiencia de transformación fue 0,033%, obtención de plantas transgénicas de 3 a 4 por 10.000 semillas T1 propagadas.

Hemos desarrollado un protocolo de transformación que permite recolección de semillas de T0 a 150 días, utilizando un método de inmersión floral modificado de la de a. thaliana. La figura 1 muestra un resumen de la línea de tiempo y S. parvula plantas que representan la etapa óptima para ejecutar la transformación a través de floral dip. Se seleccionaron S. parvula plantas con 70 –80 flores en inflorescencias múltiples a ...

Transformación mediada por Agrobacterium utilizando un método de inmersión floral puede ser empleado con éxito para crear líneas transgénicas estables del modelo extremophyte Schrenkiella parvula. Presentamos un protocolo modificado de eso para Arabidopsis thaliana, teniendo en cuenta los hábitos de crecimiento diferentes y características fisiológicas de la extremophyte.

Planta de crecimiento y transformación mediada por Agrobacterium de baño Floral de la Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Este método, un protocolo de transformación reproducible para Schrenkiella parvula, puede ayudar a responder preguntas en el campo de la generación comparativa y funcional de plantas, especialmente estudios que investigan adaptaciones de plantas a entornos hostiles. Esta técnica permite realizar investigaciones de funciones rutinarias en Schrenkiella parvula en el extremofito adaptado a las tensiones salinas multiiónicas. También permite estudios comparativos que también miran a su pariente cercano, el padre madre Aribidopsis Thaliana.La comparación de Schrenkiella Parvula con Aribidopsis Thaliana puede proporcionar información sobre las varianzas en la regulación y función genética que permiten la adaptación única de Schrenkiella parvula. El protocolo de transformación de Arabidopsis Thaliana ya está bien establecido. El método ahora permite estudios comparativos utilizando plantas transgénicas de Schrenkiella Parvula.Generalmente los investigadores nuevos en este método lucharán debido al hábito de floración y la morfología de las hojas de las plantas de Schrenkiella Parvula que dificultan la transformación efectiva utilizando una inmersión de flora, así como la selección de verdaderos transformadores. Para comenzar, utilice un palillo de dientes húmedo para transferir alrededor de 20 a 25 semillas de S.Parvula a suelo húmedo. Luego estratifica las semillas a cuatro grados centígrados durante cinco a siete días.Después de la estratificación, devolver las semillas a la cámara de crecimiento durante siete a 10 días. Una vez que todas las plántulas han germinado, deje sólo una plántula en cada una de las cuatro esquinas y en el centro de las ollas. Cultivar las plantas durante ocho a 10 semanas en la cámara de crecimiento hasta que floreen.El día de la transformación, seleccione S.Parvula plants según el protocolo de texto. Utilice fórceps y tijeras pequeñas para eliminar las inflorescencias polinizadas que ya se están convirtindo en silicosas. Después de que las plantas estén listas, prepare una solución de infiltración de agrobacterio.Después de esto, sumergir la inflorescencia S.Parvula en solución de infiltración de agrobacterium durante 20 segundos. Aquí se muestra la etapa más temprana de las plantas que se pueden utilizar para la transformación, siempre y cuando los silicos ya desarrollados se eliminen antes de la transformación, se pueden utilizar plantas más viejas con más flores. Después de la transformación, coloque las plantas sumergidas en flor horizontalmente en bandejas limpias con cúpulas para cubrir las plantas.A continuación, coloque las plantas en una sala de crecimiento oscuro durante uno o dos días. Devolver las plantas a una posición vertical y transferirlas a la sala de crecimiento. En la semana siguiente, monitoree las inflorescencias sumergidas.Diez días después de la primera inmersión floral, las plantas de S.Parvula seguirán produciendo nuevas inflorescencias y silicosas. Se puede realizar una segunda ronda de inmersión floral para transformar aún más las nuevas inflorescencias emergentes. Cultivar las plantas hasta que las semillas maduren, y cosechar las semillas alrededor de 21 semanas.Seque las semillas durante dos a tres semanas a temperatura ambiente en un recipiente hermético lleno de desecantes. Plantar las semillas T one de acuerdo con el protocolo de texto. Cultivar las plantas hasta que se desarrollen las dos primeras o tres hojas verdaderas.Para realizar la primera selección de resistencia a herbicidas, diluir el herbicida de amonio con glufosinato y rocíelo en las plántulas. Cubra las plántulas con las cúpulas durante la noche. Vuelva a colocar las bandejas en la sala de crecimiento y retire la cúpula.Espere hasta que la mayoría de las plántulas sean seleccionadas por el herbicida. Para comenzar la segunda selección, identifique las plantas que sobreviven después de ser rociadas de tres a cuatro veces con la solución BASTA. Después de cultivar las plantas durante dos a tres semanas más, seleccione la hoja madura más grande en cada planta.A continuación, frote suavemente la superficie de la hoja con un dedo para eliminar la capa de cera. A continuación, coloque una gota de la solución basta diluida en la hoja. Supervise las hojas tratadas con la solución basta en busca de signos de marchitamiento durante una semana.Finalmente seleccione las plantas con hojas no afectadas por las gotas BASTA para su posterior análisis. En este protocolo, S.Parvula se transformó con agrobacterium utilizando un método de inmersión floral. La infección por agrobacterium dio lugar al aborto de algunas flores.Sin embargo, las plantas de S.Parvula continuaron produciendo nuevas flores después de la primera inmersión de flores, y podrían transformarse de nuevo. Usando las pruebas de pulverización y caída basta, los verdaderos transformadores positivos pueden ser identificados con precisión. El número de muestras analizadas mediante la confirmación de PCR se puede reducir.Si bien este método es similar a la transformación de Arabidopsis Thaliana, es importante recordar las diferencias en el crecimiento y la morfología de Schrenkiella Parvula. Modificar el protocolo para reflejar estas diferencias es fundamental para una transformación correcta. Esta técnica podría ayudar a los investigadores a explorar la evolución de las variaciones genómicas que conducen a múltiples adaptaciones de estrés salino en el modelo de extremofito, Schrenkiella Parvula.Combinando esta técnica con la información sobre las funciones de Aradopsis Thaliana, otra planta estrechamente relacionada con Schrenkiella Parvula. Los investigadores pueden estudiar las variaciones en la regulación y las funciones que estas son dos estructuras distintas entre estas dos especies. Durante el proceso de transformación, es importante contener toda la solución de infiltración de agrobacterium en recipientes autoclavebles.Esterilice y deseche de forma segura todos los materiales que entraron en contacto con agrobacterium, incluidos guantes, puntas de pipeta macro y toallas de papel.

plant-growth-agrobacterium-mediated-floral-dip-transformation

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

En este artículo se ilustra el método de inmersión floral...

Floral dip transformación de la Arabidopsis thaliana Para el Examen de PTSO2:: β-glucuronidasa Reporter Expresión Génica

Fuente: Lee, H. et. al., Sistema de proteínas fluorescentes verdes divididas para visualizar efectores entregados por bacterias durante la infección. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra un método para monitorear la infección bacteriana y la administración de proteínas efectoras en células vegetales utilizando la complementación de proteína fluorescente verde de supercarpeta dividida (sfGFP) combinada con microscopía confocal. El enfoque permite una visualización precisa de la translocación...

Monitoreo de infecciones bacterianas y administración de proteínas efectoras en células vegetales

En este video, demostramos la generación de plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan un transgén estable a través de la transformación de genes basados en cromosomas artificiales bacterianos binarios mediados por Agrobacterium.

Transformación de genes basada en vectores cromosómicos artificiales bacterianos binarios en plantas de Arabidopsis: una técnica para generar plantas transgénicas con inserción de una sola copia

A continuación, presentamos un protocolo para transformar el lino utilizando Agrobacterium transformación de plantas mediada a través floral por inmersión. Este protocolo es simple de realizar y de bajo costo, sin embargo, produce una tasa de transformación más alta que los métodos actuales disponibles para la transformación de lino.

Floral-Dip transformación de lino ( Linum usitatissimum) Para generar transgénicos progenies con una alta tasa de Transformación

Usando un vector binario pBIBAC-GW hace generar plantas transgénicas con inserciones intactas de solo-copia, un proceso fácil. Aquí, se presenta una serie de protocolos que guían al lector a través del proceso de generación de plantas transgénicas de Arabidopsis y prueba de las plantas para la integridad y copiar el número de los insertos.

Generación de plantas transgénicas con inserciones de la solo-copia usando Vector binario BIBAC-GW

Enfoques basados en proteína fluorescentes para monitorear efectores secretados por las bacterias en las células del huésped son desafiantes. Esto es debido a la incompatibilidad entre proteínas fluorescentes y el sistema de secreción tipo III. Aquí, un optimizado superfolder GFP sistema se utiliza para la visualización de efectores secretados por las bacterias en la célula de la planta huésped.

Sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección

Aquí, presentamos dos protocolos para transformar plantas de patata. La transformación Agrobacterium tumefaciens conduce a una planta transgénica completa mientras que la Agrobacterium rhizogenes produce transgénicas raíces pilosas en una sesión de tipo salvaje que puede ser auto propagado. Entonces detectamos actividad de promotor por tinción de las raíces transformadas de GUS.

Tumefaciens de la agrobacteria y rhizogenes de la agrobacteria-transformación mediada de la patata y la actividad de promotor de un Gene del Suberin por GUS Staining

Aquí presentamos protocolos fáciles de usar para producir y purificar metabolitos diterpenoides a través de la expresión combinatoria de enzimas biosintéticas en Escherichia coli o Nicotiana benthamiana,seguido según el producto cromatográfico Purificación. Los metabolitos resultantes son adecuados para diversos estudios, incluyendo caracterización de la estructura molecular, estudios funcionales enzimáticos y ensayos de bioactividad.

Un enfoque personalizable para la producción enzimática y la purificación de productos naturales diterpenoides

Este protocolo describe la utilización de la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar genes de interés en el genoma nuclear de la microalga verde Chlorella vulgaris, lo que conduce a la producción de transformantes estables.

Agrobacterium tumefaciens-Ingeniería genética mediada por microalgas verdes, Chlorella vulgaris

Presentamos un protocolo eficiente y optimizado para la transformación mediada por Agrobacterium de una especie anfibia asexual de Brassicaceae, Rorippa aquatica, sin procedimientos intensivos en recursos de cultivo de tejidos estériles. Utilizando un marcador de transformación visual y una tubería de regeneración de brotes se generaron con éxito transformantes casi clonales, avanzando así en los futuros estudios sobre la adaptación de las plantas al entorno submarino.

Transformación eficiente basada en regeneración mediada por agrobacterias de una especie anfibia asexual de Brassicaceae, Rorippa aquatica

Presentamos un protocolo sencillo, eficaz y reproducible para la transformación mediada por Agrobacterium en Phytophthora palmivora, que también es aplicable a P. capsici.

Un método simplificado para la transformación mediada por agrobacterias de Phytophthora palmivora

Aprende el método de inmersión floral para transformar Schrenkiella parvula mediante Agrobacterium. Este protocolo permite crear líneas transgénicas estables y estudiar adaptaciones de extremófilos a estrés salino.

Planta de crecimiento y transformación mediada por Agrobacterium de baño Floral de la Extremophyte Schrenkiella parvula

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