Name: Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende la técnica de inyección intratecal directa de virus adeno-asociados en ratones adultos usando lidocaína al 1% como indicador de éxito. Este método mejora la eficiencia de la transducción en el sistema nervioso central para investigaciones de terapia génica.

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Este trabajo fue financiado por una subvención de HEBEI Provincial Departamento de recursos humanos y Seguridad Social (CY201605) y una beca de la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Hebei (H2017206101), y estamos muy agradecidos al Dr. para Gao Guangping, quien proporcionó la AAV para Este estudio.

Ratones FVB/NJ fueron criados en las instalaciones de animales de laboratorio clave de Hebei Neurología. Todos los experimentos de ratón fueron aprobados por el segundo Hospital de Hebei médica Universidad Comité de ética y llevado a cabo conforme a las normas de la gerencia del animal de laboratorio promulgada por el Ministerio de ciencia y tecnología de la República Popular de China.
1. preparación de solución madre del clorhidrato de lidocaína 20%
<ol><li>Pesar 2 g de clorhidrato de lidocaína. Añadir 5-6 mL de agua estéril y agitar suavemente. Aumentar el volumen a un total de 10 mL con agua estéril.</li>
	<li>1.2 filtro de la solución a través de filtros de 0.2 micrones. Alícuota de la solución, 1 mL por microcentrífuga de 1.5 mL del tubo y sellar con una película. Almacenar a 4 ° C.</li>
</ol>2. dirigir la entrega intratecal AAV en despiertas ratones
<ol><li>Limpie el área de trabajo utilizando una gasa estéril con etanol al 70% y prepare los suministros necesarios como se menciona en la tabla 1.</li>
	<li>Preparar 100 μl de clorhidrato de lidocaína AAVrh.10/1% complejo agregando 95 μl de la solución madre de rAAVrh10 (5 x 1012 genoma copias/mL) en un tubo de microcentrífuga estéril de 200 μl y añadir 5 μl de solución stock de clorhidrato de lidocaína 20%. Mezclar por pipeteo arriba y abajo. A continuación, guarde la solución antivirus en hielo (4 ° C). Nota: se utilizarán 8 μl por ratón4 .</li>
	<li>
Preparar la jeringa con la solución de AAV para inyección
	<ol>
<li>Montar un 25 μl de Hamilton de la jeringuilla con una aguja de 27 G y alinear la punta biselada de la aguja con la escala volumétrica en la jeringa.</li>
		<li>Dibujar 8 μl con 4 x 1010 copias de genoma de la solución de virus dentro de la jeringa suavemente. Asegúrese de eliminar burbujas de aire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando el ratón Nota: hombre o mujeres ratones FVB/NJ (30-70 días de edad) fueron utilizados en este estudio. Inyección de ti fue operada en la campana.<ol>
<li>Esterilizar el área de trabajo en una campana con etanol al 70%. Ponga el ratón despierto (masculinos o femeninos, 30-70 días de edad, 13-20 g de peso) en un bedpiece en una posición prona en la campana. Cubrir la parte superior del cuerpo con una gasa estéril para calmar el ratón y evitar ser mordido.</li>
		<li>Fijar el animal sujetando apropiadamente y firmemente en su faja pélvica con un pulgar en un lado y el dedo índice, medio dedo en el otro lado. Mantenga la piel entre fajas de pélvica bilaterales tensos con el dedo pulgar y el índice. Sostenga suavemente en la parte superior del cuerpo del animal con la palma.</li>
		<li>Afeitar el pelo en la espalda entre los cinturones pélvico bilaterales, entonces esterilizar la superficie de la piel con un yoduro scrub y el 70% etanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intratecal de inyección12
	<ol>
<li>Sentir el espacio intervertebral a lo largo de la línea media entre los cinturones pélvico bilaterales con un dedo pulgar o el dedo índice de la otra mano y presione una mella con la uña del dedo para indicar el espacio intervertebral de L5-L6 (localizar el sitio de inyección).</li>
		<li>Gire la base de la cola un poco y suavemente para indicar la línea media de la columna vertebral. Ajustar el bisel de la aguja hacia la cabeza del animal antes de la inyección (mencionada en el paso 2.3.1).</li>
		<li>Asegúrese de que los animales están fijados firmemente y alinean la aguja a lo largo de la línea media de la columna vertebral.</li>
		<li>Inserte la aguja suavemente y vertical (o ligeramente la inclinación 70 – 80°) en la intersección de la indentación y mantenga la jeringa en un plano sagital central. Reducir el ángulo de aproximadamente 30° lentamente cuando se conecta el hueso, luego deslizar la aguja en el espacio intervertebral. Nota: Una película de evidente cola repentino es una señal de entrada exitosa en el espacio intradural. Una vez que la aguja entra en el espacio intervertebral, punta de la aguja se siente firmemente sujeta. La aguja de 27 G, utilizada en este estudio es adecuada para la entrega es en ratones pero no ratas.</li>
		<li>Inyecte la solución de vector (mencionada en el paso 2.2). Iniciar el temporizador e inyecte 8 μl de la solución del vector a una velocidad de 1 μl/4 s. retener la aguja aproximadamente 1 min después de acabar entrega. Retire la aguja con rotación suave para evitar fugas.</li>
		<li>Anotar la debilidad transitoria del ratón miembros inmediatamente después del parto para evaluar la calidad de la inyección4. Nota: El estándar es el siguiente4. Puntuación 0: ninguna debilidad; Puntuación 1: menor debilidad de los miembros posteriores sin anormalidad de la marcha; puntuación 2: moderada debilidad de las extremidades traseras con anormalidad obvia marcha; puntuación 3: completa parálisis de las extremidades posteriores; puntaje 4: completa parálisis de las extremidades posteriores, dificultad para respirar y debilidad moderada de las extremidades anteriores; y la puntuación 5: completa parálisis de las cuatro extremidades y evidente falta de aliento.</li>
		<li>Mueva el ratón hacia atrás a la jaula para la recuperación de la parálisis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Limpiar
	<ol>
<li>Enjuague la jeringa con 1 mL de agua estéril. Ordenar suministros de laboratorio y recoger todos los materiales no desechables para la esterilización en autoclave. Limpie el Banco con etanol al 70%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. tejido preparación para la coloración de Immunohistochemical
<ol><li>
Colección de tejido
	<ol>
<li>Anestesiar ratones después de la inyección 21 días con hidrato de cloral 3% (0,1 mL/10 g) profundamente por inyección intraperitoneal.</li>
		<li>Perfusión transcardially con 20 mL de PBS de 0,01 M helada (NaCl 147 mM; NaH2PO4 1,9 mM; K2HPO4 8,1 mM, pH 7,4) en primer lugar, luego helada paraformaldehído al 4% (en PBS de 0.01 M) con la bomba (10 mL/min durante 1 minuto, luego 5 mL/min por 9 min). PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es cancerígeno y tóxico. Manejar sólo en la campana usando guantes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Disección de la médula espinal y el cerebro
	<ol>
<li>Fijar las extremidades y cabeza de cada animal en una posición prona en una caja de la espuma cubierta con agujas de jeringa, luego tira y quitar la piel de la cabeza al sacro con tijeras.</li>
		<li>Clip del cráneo entre los ojos, corte al lado de la ruta media del cráneo y la línea horizontal sobre el cerebelo, y abrir el cráneo a cada lado.</li>
		<li>Levante el hueso occipital con las pinzas y abrir el canal espinal bilateral con tijeras oftálmicas. Corte las costillas en ambos lados y retire la mitad superior de las vértebras con cuidado.</li>
		<li>Levante el cerebro con pinzas curvas y cortar los nervios de la base del cráneo, luego disecar cuidadosamente todo el cerebro y médula espinal. -Fijar los tejidos en paraformaldehído al 4% durante 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de cortes de tejido
	<ol>
<li>Cryoprotect el cerebro y la médula espinal cervical y lumbar en solución de sacarosa al 30% durante la noche a 4 ° C. Incrustar el tejido en la temperatura de corte óptimo (OCT) compuesto y congelar con nitrógeno líquido.</li>
		<li>Cortar el tejido en 25 μm con un criostato y guarde las secciones congeladas en PBS de 0.01 M a 4 ° C para su uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. inmunohistoquímica
<ol><li>Trate previamente las secciones flotan libremente en el 1% H2O2 durante 10 minutos, luego lavar en PBS durante 10 minutos incubar en una solución de bloqueo que contiene 5% de suero y detergente no iónico de 0.3% en PBS durante 1 hora.</li>
	<li>Incubar las rebanadas con anticuerpos primarios correspondientes durante la noche a 4 ° C. Lávese las secciones en SAFT (0.2% Tween 20 en PBS) durante 30 minutos (3 veces por 10 minutos cada uno).</li>
	<li>Incubar las rebanadas con el anticuerpo secundario biotina correspondiente a temperatura ambiente durante 1 h. lavado en SAFT durante 30 minutos (3 veces por 10 minutos cada uno).</li>
	<li>Incubar las secciones con peroxidasa de afinidad biotina complejo durante 40 min y mancha con agente de achromogenic. Monte las secciones en diapositivas y secar correctamente.</li>
	<li>Sumerja los portaobjetos en etanol anhidro por 5 min y xileno durante 10 min, luego sellar las diapositivas con un medio de montaje. Finalmente, imágenes de las diapositivas con un microscopio equipado con un dispositivo de carga acoplada (CCD) en 100 x, 200 x y 400 aumentos de x.</li>
</ol>

<ol><li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).</li>
<li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22001604">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li>
<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+a+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li>
<li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).</li>
<li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li>
<li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li>
<li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1%28G93A%29+Mice+and+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li>
<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K%2FAkt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Técnicamente, hay varios pasos críticos durante la inyección de IT en ratones despiertos. En primer lugar, adecuado gesto y firma el control de los ratones a lo largo de toda la operación es un requisito previo para la entrega exitosa. En segundo lugar, el punto más difícil es sentir el espacio intervertebral con la punta de la aguja, ya que es necesario no introducir demasiado profundamente sin resistencia o introduzca por la fuerza bajo fuerte resistencia en el caso de herir a los animales o doblar la punta de la aguja...

AAV puede mediar la expresión génica a largo plazo y generalizados en la transducción del CNS con pocos efectos secundarios y por lo tanto, se ha convertido en uno de los vehículos más prometedoras para la terapia génica para el tratamiento de enfermedades del SNC incluyendo la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), Huntington enfermedad (HD), enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedades de depósito lisosomal (LSD), la enfermedad de Gaucher (GD) y neuronal ceroid lipofuscinosis ceroid (NCL)1. En la actualidad, más de 100 serotipos AAV se han aislado de los seres humanos y animales. Entre ellos, al menos 12 han sido utilizados en preclínicos y ensayos clínicos, incluyendo el más comúnmente utilizan vectores del gene como AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 y rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Enfermedades del SNC diferentes requieren diferentes estrategias de entrega AAV debido a las diversas regiones afectadas de CNS y tipos de la célula. Las regiones de CNS y célula tipos que AAV puede transducir varía según el serotipo así como método de entrega. Por ejemplo, rAAVrh10 ha demostrado que transduce predominantemente astrocitos al entregado por la inyección intravenosa sistémica (IV), mientras que transduced las neuronas y glia entrega intratecal inyectable4,7. Además, inyección de parénquima dio lugar en la transducción de local a los alrededores del sitio de inyección, mientras que la inyección en el líquido cerebroespinal (CSF) a través de intraventricular o intratecal inyectable resultó en la transducción generalizada de CNS8 . Estudios también han demostrado potencia terapéutica de terapia génica AAV-entregado en trastornos neurodegenerativos por él administración9,10,11. En enfermedades que afectan a amplias zonas del SNC como ALS, inyección intratecal en el LCR se ha demostrado para cubrir la mayoría de las áreas que es afligida por la enfermedad con una dosis más baja, en comparación con un método de entrega sistémica4,10. Estudios recientes también han demostrado que la punción lumbar se puede utilizar para inyectar AAV en modelos de ratón de ALS, que evita posibles lesiones asociadas con cateterización de laminectomía e intratecal4.
Una punción lumbar directa experimental primero fue utilizada para entregar a agentes, especialmente los anestésicos, a la médula espinal para analgesia y anestesia en 188512,13. En este informe, nos ilustran el método de inyección es en ratones adultos con la ayuda del 1% clorhidrato de lidocaína, un anestésico local derivado de amida, en la solución de la inyección para evaluar y controlar la calidad de la inyección la punción lumbar. Inyecciones de éxito fueron marcadas por parálisis transitoria inducida por la lidocaína, mientras que inyecciones no mostró este comportamiento. Clasificamos el nivel de debilidad transitoria como uno de cinco grados para ayudar a predecir la eficacia de la inyección. Finalmente, nos muestran que el nivel de la transducción de rAAVrh10 puede predecirse por el grado de parálisis. Por lo tanto, este método de la entrega intratecal AAV puede utilizarse para mejorar el AAV-mediated gene-entrega para el tratamiento de enfermedades del SNC.

<table><tbody><tr><td>Ratones FVB/NJ</td><td>Charles River Laboratories China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de lidocaína monohidrato</td><td>HEOWNS</td><td>73-78-9</td><td></td></tr><tr><td>AAV</td><td>Viral Vector Core del Centro de Terapia Génica de la Facultad de Medicina de la Universidad</td><td></td><td></td>de Massachusetts</tr><tr><td>25 &micro; L&nbsp; Jeringa Hamilton/aguja 27-30 G</td><td>GASTIGHT</td><td>1702</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T compond</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>H 2O 2</td><td>SHUI HUAN PAI</td><td></td><td></td></tr> 170401 <tr><td>Suero de cabra</td><td>Solarbio S9070</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>LIFE SCIENCES</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-GFP</td><td>Life tech</td><td>G10362</td><td>Dilución 1:333</td></tr><tr><td>El segundo anticuerpo (cabra-anti conejo)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>111-005-144</td><td>dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>REACTIVO VECTASTAIN ABC</td><td>Vector Lab</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Kit de sustrato de peroxidasa</td><td>Vector Lab</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje para fluorescencia con DAPI</td><td>Vectorshield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Yong Da Chemical</td><td>307699</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de adherencia</td><td>CITOGLAS</td><td>17083</td><td>25 mm x 75 mm</td></tr><tr><td>SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td><td>Electromicroscopía Siences</td><td>72236-60</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>15 mL Tubo de centrífuga</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos colector de cultivo celular</td><td>Coster</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>24 pocillos colector de cultivo celular</td><td>Coster</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>WEN ZHI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gasa</td><td>Wei AN</td><td>05171112</td><td>8 cm x 10 cm x 12 cm 1</td></tr><tr><td>mL jeringa</td><td>Hong Da</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtubos</td><td>Micropipeta plasmada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peppet tips</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centirifuge</td><td>eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Regerator</td><td>Haier</td><td>BCD-539WT</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>MILLEX GP</td> Bomba <td>R4PA42342</td><td></td></tr><tr><td></td><td>LongerPump</td><td>BT-100-2J/YZ1515X</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo congelador</td><td>Leica</td><td>CM1520</td><td></td></tr></tbody></table>

directa de la inyección intratecal de virus adeno-asociado recombinantes en ratones adultos

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

La inyección intratecal (IT) de virus adeno-asociado (AAV) ha atraído un considerable interés en la terapia génica del CNS en virtud de su eficacia de transducción excelente, seguridad y noninvasiveness en el SNC. Estudios anteriores han demostrado la potencia terapéutica de terapia génica AAV-entregado en trastornos neurodegenerativos por su administración. Sin embargo, se han reportado altas tasas de fracaso impredecible debido a la limitación técnica de administración de TI en pequeños animales. Aquí, hemos establecido un sistema de puntuación para indicar el grado de éxito de la punción lumbar en pequeños animales mediante la adición de clorhidrato de lidocaína 1% en la solución de la inyección. Se muestra más que el grado de debilidad transitoria después de la inyección puede predecir la eficiencia de la transducción de AAV. Por lo tanto, puede utilizarse este método de inyección de TI para optimizar los ensayos terapéuticos en modelos murinos de enfermedades del SNC que afligen a grandes regiones del SNC.

Los ratones mostraron diferentes grados de debilidad transitoria justo después de que inyección de solución AAV en clorhidrato de lidocaína 1% debido a varios calidad de inyección intratecal. Según el sistema de puntuación grado 5 semi cuantitativo hemos establecido, hemos probado los patrones de transducción de AAV en ratones con diferentes grados de debilidad de la extremidad inducida por lidocaína (puntuación de 0, n = 2; puntuación 1, n = 1, puntuación 4, n = 4; puntuación 5, n = 3). ...

Aquí presentamos una técnica de inyección directa intratecal con clorhidrato de lidocaína 1% en una solución viral para asegurar la entrega eficiente de virus adeno-asociado a pequeños animales y establecer un sistema de puntuación para predecir la eficiencia de la transducción de señales en la central sistema nervioso según el grado de debilidad transitoria inducida por la lidocaína.

Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Este método facilita la administración intratecal eficiente de transgenes virales adeno asociadas en animales pequeños despiertos para el tratamiento experimental de enfermedades del sistema nervioso central como la ELA. La principal ventaja de este método es que la solución viral incluye 1%clorhidrato de lidocaína que induce una parálisis transitoria después de una inyección exitosa. Aunque este método proporciona un indicador visual para juzgar el éxito de la situación automatizada intratecal, la práctica suficiente es esencial para mejorar la tasa de éxito de la entrega.Antes de comenzar el procedimiento, coloque una aguja de calibre 27 en una jeringa Hamilton de 25 microlitrotros y alinee la punta biselada de la aguja con la escala volumétrica de la jeringa. A continuación, cargue cuidadosamente 8 microlitros de 4 x 10 a las copias del genoma 10 de la solución del virus en la jeringa, teniendo cuidado de evitar burbujas. A continuación, coloque un ratón despierto de 30 a 70 días de edad de 12 a 30 gramos sobre una pieza de cama en la posición propensa en una capucha de bioseguridad y cubra la parte superior del cuerpo con gasa estéril para calmar al ratón y evitar ser mordido.Agarre firmemente el ratón sobre su faja pélvica con el pulgar en un lado y el dedo índice y medio en el otro lado manteniendo la piel entre las fajas pélvicas bilaterales tensas con un pulgar y un dedo índice. A continuación, afeitar el pelaje entre las fajas pélvicas bilaterales y esterilizar la piel expuesta con un exfoliante a base de yodo y 70%etanol. Para la administración intratecal directa de la solución vírica asociada al adeno, palpar el espacio intervertebral a lo largo de la línea media entre las fajas pélvicas bilaterales y utilizar una uña para deprimir una sangría en la piel para indicar el espacio intervertebral L5 a L6.Gire la base de la cola ligeramente y suavemente para revelar la línea media de la columna vertebral y ajustar el bisel de la aguja hacia la cabeza del animal. Con el ratón firmemente fijado en su posición, alinee la aguja a lo largo de la línea media de la columna vertebral e inserte la aguja suavemente y verticalmente en el centro de la sangría manteniendo la jeringa en un plano sagital central. Cuando la aguja entra en contacto con el hueso, disminuya lentamente el ángulo a aproximadamente 30 grados y deslice la aguja en el espacio intervertebral.Un movimiento de cola repentino es un signo de una entrada exitosa en el espacio intradural. Cuando la aguja entra en el espacio intervertebral, la punta se sentirá firmemente sujeta. Inyecte la solución vectorial y mantenga la aguja dentro del espacio intradural durante un minuto.A continuación, retire lentamente la aguja con rotación para minimizar las fugas. Puntuar inmediatamente la debilidad transitoria de las extremidades del ratón para evaluar la calidad de la inyección y devolver el ratón a su jaula para su recuperación de la parálisis. En el punto final experimental adecuado, fije las extremidades y la cabeza del ratón inyectado en la posición propensa en una cubierta de la caja de espuma y use tijeras para quitar y quitar la piel de la cabeza al sacro.Recorta el cráneo entre los ojos, corta a lo largo de la línea media del cráneo y la línea horizontal por encima del cerebelo y abre el cráneo a cada lado. Use pinzas para extraer el hueso occipital y use tijeras oftálmicas para abrir el canal espinal bilateralmente. Corte las costillas de ambos lados y retire cuidadosamente la sección superior de las vértebras.Usa pinzas curvas para levantar el cerebro y cortar los nervios de la base del cráneo. Luego extrae cuidadosamente todo el cerebro y la médula espinal y fija los tejidos en 4%paraformaldehído durante 24 horas. Al final del período de fijación, crioprotece el cerebro y la médula espinal cervical y lumbar en una solución de 30% de sacarosa durante la noche a 4 grados centígrados seguido de la incrustación en un compuesto óptimo de temperatura de corte antes de congelar el nitrógeno líquido.A continuación, utilice un criostato para obtener secciones de 25 micrómetros de espesor de cada tejido, almacenando las secciones congeladas en 0,01 PBS molar a 4 grados centígrados a medida que se obtienen. Para el análisis inmunohistoquímico de los tejidos, pretrata las secciones flotantes libres con 1%peróxido de hidrógeno durante 10 minutos seguido de un lavado de 10 minutos en PBS. A continuación, incubar las muestras en solución de bloqueo que contengan 5% de suero y 0,3% detergente no iónico en PBS durante 1 hora seguido de etiquetado nocturno a 4 grados Centígrados con los anticuerpos primarios de interés adecuados.Al día siguiente, lavar las secciones con 3 lavados de 10 minutos en PBS más Tween e incubar los portaobjetos con los anticuerpos secundarios biotinilados correspondientes a temperatura ambiente durante 1 hora después del último lavado. Al final de la incubación, lavar las secciones 3 veces en PBST fresco como acaba de demostrar e incubar las muestras con complejo de biotina peroxidasa infinita durante 40 minutos seguido de tinción con un agente cromogénico adecuado. Monte las secciones etiquetadas en portaobjetos de microscopio de vidrio y remoje los portaobjetos en etanol anhidro durante 5 minutos una vez que las secciones montadas se hayan secado por completo.A continuación, remoje los portaobjetos en xileno durante 10 minutos y séquelos con un medio de montaje adecuado. A continuación, imagine las diapositivas con un microscopio de luz equipado con un dispositivo acoplado de carga a 100, 200 y 400 aumentos. La inmunostaining eGFP de secciones del tejido espinal cervical y lumbar revela poca o ninguna transducción en la médula espinal lumbar de ratones con una puntuación de debilidad de 0, transducción ligeramente mejorada en ratones con una puntuación de debilidad de 1, y transducciones fuertes y generalizadas en ratones con una puntuación de debilidad de 4 o 5.La cuantificación de la intensidad de tinción de la PFNM de las secciones del tejido de la médula espinal de ratones que muestran varios grados de debilidad transitoria de las extremidades indica que la gravedad de la debilidad después de la inyección de la solución del virus se correlaciona estrechamente con la extensión de la transducción de la médula espinal. En el cerebro, se detectan señales eGFP robustas en la bombilla olfativa, la corteza prefrontal dorsolateral, el giro denato y la zona CA3 del hipocampo, la corteza cerebelosa y las zonas marginales del tronco cerebral, incluyendo el núcleo facial, el plexo coroideo y las células epiteliales ependimales. Las neuronas motoras en los cuernos anteriores también se trans inducen fuertemente en diferentes niveles de la médula espinal.Además, en la corteza, se detectan neuronas positivas de GFP, incluidas las células piramidales, así como varios tipos de células gliales, como microglia, astrocitos y oligodendrocitos. Esta técnica permite a los investigadores en el campo de la neurología explorar los efectos terapéuticos del parto intratecal directo en pequeños animales despiertos en enfermedades del sistema nervioso central.

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Investigación

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Transducción generalizada de neuronas neocorticales de ratón mediante inyección subaracnoidea de AAV2

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Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos

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