Name: Estructura cristalina del dominio N-terminal del Receptor de rianodina de Plutella xylostella (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprende cristalografía de rayos X para determinar la estructura del dominio N-terminal del receptor de rianodina de Plutella xylostella. Este método revela mecanismos de apertura del canal y facilita el diseño de insecticidas específicos.

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La financiación para esta investigación fue proporcionada por: nacionales de investigación clave y programa de desarrollo de China (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), nacional naturaleza ciencia Fundación de China (31320103922, 31230061) y proyecto de nacional investigación básica (973) programa de China (2015CB856500, 2015CB856504). Estamos muy agradecidos al personal en la línea BL17U1 en instalaciones de Radiación Sincrotrón Shanghai (SSRF).

1. clonación de genes, expresión de la proteína y purificación
<ol><li>PCR amplificación ADN correspondiente a la proteína de interés (residuos 1-205 de DBM RyR, Genbank según no. AFW97408) y clonar en pET-28a-HMT vector de clonación de ligadura-independiente (LIC)25. Este vector contiene una etiqueta histidina, etiqueta MBP y un sitio de la hendidura de proteasa TEV en el N-terminal15.
	<ol>
<li>Diseño Lic. primers para la amplificación del gene de la blanco con 5' extensiones de LIC-compatible con: Primer avance de LIC: 5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3' Cartilla LIC inversa: 5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'</li>
		<li>Combinar los componentes de la reacción (50 μL): tampón 1 μL de plantillas de la DNA (100 ng/μL), 1 μL de cebador forward (10 μM), 1 μL de cebador reverso (10 μM), 0,5 μL de ADN polimerasa (NEB), 5 μL de reacción 10 x, 1 μL de dNTP (25 mM) , 40,5 μL de Rnasa free Dec2O.<ol>
<li>Coloque la mezcla de reacción en una máquina PCR y ejecutar el siguiente programa.</li>
			<li>Incubar a 95 ° C por 3 min, y luego ejecutar 30 ciclos de (95 ° C por 30 s, 58 ° C durante 15 s, 72 ° C por 1 min). Incubar a 72 ° C por 5 min y luego mantener a 4 ° C.</li>
			<li>Ejecutar la mezcla de reacción entera (50 μL) en un gel de agarosa al 2% y extracto con un Kit de extracción de Gel. Seguir el protocolo del fabricante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Independiente de la ligadura de clonación (Lic.)<ol>
<li>Realizar digestión SspI (60 μL): 20 μL de vector de ADN (50 ng/μL), 6 μL de 10 x buffer de reacción, 4 μL de SspI y 30 μL de ddH2O. incubar a 37 ° C por 3 h. ejecutar la reacción entera mezcla en gel de agarosa 1% y extraer con un Kit de extracción de Gel. Seguir el protocolo del fabricante.</li>
			<li>Realizar tratamiento de polimerasa de la DNA de T4 del vector e insertar ADN. Combinar los siguientes: 5 μL de ADN vector o inserto (50 ng/μL), 2 μL de tampón de polimerasa de la DNA de x T4 10, 1 μL de dGTP (25 mM) para el vector o 1 μL de dCTP (25 mM) para insertar DNA, 1 μL de la TDT (100 mM), 0.4 μL de T4 DNA polimerasa (LIC-calificado) y 9,6 μL de ddH2O. reacciones de incubar a temperatura ambiente durante 40 minutos Inactive por calor enzima a 75 ° C por 20 min. Nota: El vector LIC e insertar ADN deben ser tratados en reacciones separadas.</li>
			<li>Realizar el LIC recocido reacción. Combinar los siguientes: 2 μL de ADN inserto tratados con T4, 2 μL de LIC tratados con T4 ADN del vector. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transformar BL21 (DE3) e. coli las células con este plásmido recombinante.<ol>
<li>Descongelar las células competentes (50 μL en el tubo de microcentrífuga) en hielo.</li>
		<li>Añadir aproximadamente 1 μL (50 ng) del plásmido en el tubo. Mezcle las células y ADN sacudiendo suavemente el tubo de 2 – 3 veces. Coloque el tubo en hielo por 20 min.</li>
		<li>Caliente golpes a 42 ° C 40 lugar s. el tubo en hielo nuevamente por 2 minutos agregue 1 mL de medio de temperatura LB al tubo.</li>
		<li>Lugar el tubo de mezcla en la coctelera de 250 rpm a 37 ° C durante 45 minutos difundir 150 – 200 μL de la mezcla sobre las placas de selección. Invierta la placa e incubar durante una noche a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Escoge una sola Colonia y cultura las células en medio de 2YT 100 mL que contiene 50 kanamicina μg/mL a 37 ° C durante la noche. A la mañana siguiente, inocular medio de 2YT 1 L que contiene kanamicina 50 de μg/mL con 10 mL de la noche a la mañana cultura e incubar en la incubadora de la coctelera de 37 ° C a 250 rpm, hasta el OD600 ~ 0.6. Después de eso inducir la cultura con IPTG para una concentración final de 0,4 mM y crecer para otro 5 h a 30 ° C.</li>
	<li>La cosecha de las células por centrifugación a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C, recoger las células y resuspender cada células de 10 g en 40 mL de tampón de lisis (10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 10 mM β-mercaptoetanol, lisozima de 25 μg/mL, 25 μg/mL DNasa 1 mM PMSF).<ol>
<li>Interrumpir por sonicación en amplitud de 65% por 8 min con 1 s s 1 y el apagado. Eliminar los restos celulares por centrifugación a 40.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Filtrar el sobrenadante por pasando por 0,22 μm filtro y cargar en el bucle de muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificar la proteína de fusión, hienden la etiqueta y volver a purificar la proteína diana.<ol>
<li>Purificar la proteína de fusión utilizando columna de Ni-NTA (tampón de Unión: pH HEPES 10 mM 7.4, 250 mM KCl, tampón de elución: pH HEPES 10 mM 7.4, 250 mM KCl, imidazol de 500 mM) y purificar mediante un sistema de purificación, con un degradado lineal de imidazol 20-250 mM.</li>
		<li>Unirse a la proteína diana eluídas con proteasa TEV (1:50 cociente) durante la noche a 4 ° C.</li>
		<li>Purificar la mezcla de reacción de hendidura utilizando columna de resina de amilosa (tampón de Unión: pH HEPES 10 mM 7.4, 250 mM KCl, tampón de elución: pH HEPES 10 mM 7.4, 250 mM KCl, maltosa 10 mM) y la columna de Ni-NTA para quitar la etiqueta y proteasa TEV. La proteína diana estará en la fracción de flujo a través de estas dos columnas.</li>
		<li>Dializan la muestra contra tampón de diálisis (10 mM Tris-HCl pH 8.8, 50 mM KCl, 10 mM β-mercaptoetanol para reducir la concentración de sal. Purificar la muestra en una columna de intercambio aniónico (tampón de Unión: 10 mM Tris-HCl de pH 8.8, 10 mM β-mercaptoetanol, tampón de elución: 10 mM Tris-HCl de pH 8.8, de 1 M de KCl, 10 mM β-mercaptoetanol) por un degradado lineal de 20 – 500 mM KCl en el tampón de elución.</li>
		<li>Como paso final en el proceso de purificación, concentrado de la proteína usando el concentrador centrífugo (10 kDa MWCO) e inyecte en una columna de gel filtración Superdex 200 26/600 para comprobar la homogeneidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Examinar la pureza de la proteína ejecutándolo en un 15% de SDS PAGE. Nota: Todas las columnas se ejecutan en un sistema de purificación de proteína con un caudal de enlace de 2 mL/min y un caudal de elución de 4 mL/min excepto filtración de gel de 1 mL/min.</li>
</ol>2. cristalización y la preparación de la proteína
<ol><li>Concentrar la muestra de proteína purificada a 10 mg/mL utilizando el concentrador centrífugo (10 kDa MWCO) y cambio de buffer a buffer de cristalización antes de guardarlo a-80 ° C.</li>
	<li>Realizar proyección de cristalización (proporción 1:1, 200 nL de proteína y 200 nL de amortiguamiento de la reserva) por la sesión caiga método de difusión de vapor a 295 K con varios kits de cristalización utilizando un sistema robótico en un formato de 96 pocillos para manejo de líquidos automatizados. Nota: Usamos equipos de investigación de dimensiones moleculares y Hampton y el grifo automático de manejo de líquidos.</li>
	<li>Sellar la placa de 96 pocillos cristalización para evitar la evaporación y permitir el equilibrio de la caída de la proteína con el búfer de reserva. Entonces, mantener las placas en la incubadora de cristal a 18 ° C.</li>
	<li>Verifique las placas de 96 pozos periódicamente con un microscopio de luz para controlar el crecimiento y la formación de cristales.</li>
	<li>Para diferenciar cristales proteicos de cristales de sal, usar un tinte de proteína. Añadir 1 μl de colorante a la gota del destino. Espere aproximadamente 1 h y observar bajo el microscopio. Los cristales de proteína dará vuelta al azules.</li>
	<li>Utilizar las condiciones de cristalización positiva (sulfato de amonio de 1.5 M, 0.1 M Tris pH 8.0) para optimizar aún más los cristales con colgante gota método de difusión de vapor en placas de 24 pocillos.<ol>
<li>Optimizar el pH de 7.0 a 8.5 con intervalo de unidad de pH 0,5 cada paso. Optimizar la concentración de sulfato de amonio de 1.2 M a 1,7 M con intervalos de 0.1 M cada paso. (En nuestro caso las mejores condiciones de producir grandes cristales en forma de placa era sulfato de amonio de 0.1 M HEPES pH 7.0 y 1.6 M)</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cristal de montaje, recogida de datos de la radiografía y determinación de la estructura
<ol><li>Montar cristales en un cryoloop y flash-cool en nitrógeno líquido con depósito solución que contiene 20% de glicerol como crio-protector. Coloque los cristales en unipuck para el almacenamiento y transporte.</li>
	<li>La pantalla cristales de la proteína usando un Rigaku en difracción de rayos x. Elija los mejores con las resoluciones más altas para la recolección de datos en las instalaciones de sincrotrón (nuestro conjunto de datos fue tomado del BL17U1 en instalaciones de Radiación Sincrotrón de Shanghai).<ol>
<li>Utilice el software de control de línea BluIce26 montaje y centro de los cristales por la función de centrado automática o manual. Realizar exposiciones de prueba para determinar la estrategia de recolección de datos, incluyendo a partir de ángulo, tiempo de exposición, distancia del detector, ancho de marco y números.</li>
		<li>Recoger datos por consiguiente (hemos recogido 180 marcos con tiempo de exposición de 1 s, ancho de marco de 1° y la distancia del detector de 350 mm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Índice, integrar y ampliar el conjunto de datos utilizando HKL2000 suite27. Primero la función Buscar para encontrar los puntos de difracción y luego índice los puntos y seleccione el grupo de espacio a la derecha. Tras la integración del pico, escala del conjunto de datos con el modelo de error apropiado y guarde el archivo de .sca salida.</li>
	<li>Resolver el problema de la fase de reemplazo molecular usando Phaser28 en PHENIX29.<ol>
<li>Para calcular el número de copias posibles de las moléculas de proteína en la unidad asimétrica Xtriage30.</li>
		<li>Busca las plantillas de estructura adecuada con semejanza de la identidad y estructural de la secuencia alta como la proteína de la blanco usando estructuras conocidas de la literatura o los modelos generados por servidor de predicción de estructura como Phyre231 (utilizamos conejo RyR1 NTD como un modelo de búsqueda, ID de PDB 2XOA).</li>
		<li>Ejecute el Phaser usando el archivo de datos de difracción, el archivo de estructura de la plantilla y el archivo de secuencia de la proteína para encontrar la solución.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar autocompilación32 en PHENIX29 para generar el modelo inicial utilizando el archivo de salida de Phaser y el archivo de secuencia de la proteína diana.</li>
	<li>Manual construir la estructura en la densidad del electrón experimental modificado con focha33 y perfeccionar utilizando phenix.refine34 en ciclos iterativos.</li>
	<li>Validar el modelo final con las herramientas de validación de PHENIX18.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este papel, describimos el procedimiento para expresar por vía recombinante, purificar, cristalizar y determinar la estructura de DBM RyR NTD. Para la cristalización, un requisito crucial es obtener proteínas con homogeneidad, pureza y alta solubilidad. En nuestro protocolo, decidimos utilizar vector pET-28a-HMT ya que contiene un hexahistidine etiqueta y etiqueta de la MBP, que pueden ser utilizados para que la purificación obtener una mayor pureza de doblez. Además, el MBP etiqueta SIDA en la solubilidad de la prote...

Receptores de rianodina (RyRs) son canales iónicos específicos que median la penetración de iones de Ca2 + en las membranas del retículo sarcoplásmico (SR) en las células musculares. Por lo tanto, juegan un papel importante en la contracción excitación proceso de acoplamiento. En su forma funcional, la RyR monta como un homo-tetrámero con una masa molecular de > 2 MDa, con cada subunidad compuesta por residuos del aminoácido del ~ 5000. En los mamíferos, existen tres isoformas: RyR1 de tipo músculo esquelético, músculo cardiaco tipo de RyR2 - y RyR3-ubicuo se expresa en diferentes tejidos1.
En insectos hay un único tipo de RyR, que se expresa en el tejido muscular y nervioso2. RyR insectos es más similar a los RyR2 mamíferos con una identidad de secuencia de aproximadamente 47%3. Diamida insecticidas dirigidos a RyR de lepidópteros y coleópteros se han desarrollado y comercializado por grandes empresas como Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) y Syngenta (cyantraniliprole). Desde su reciente lanzamiento, diamida insecticidas se han convertido en uno de la clase de más rápido crecimiento de insecticidas. Actualmente, las ventas de estos tres insecticidas cada año han cruzado 2 billones de dólares con una tasa de crecimiento de más del 50% desde 2009 (Agranova).
Recientes estudios han reportado el desarrollo de resistencia en los insectos después de algunas generaciones de uso de estos insecticidas4,5,6,7,8. Las mutaciones de la resistencia en el dominio transmembrana de RyRs de la polilla del diamondback (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) y las posiciones correspondientes de minador del tomate, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) muestran que la región podría participar en el enlace de insecticida diamida como esta región es conocida por ser crítica para la compuerta del canal4,8,9. A pesar de extensas investigaciones en esta área, los mecanismos moleculares exactos de diamida insecticidas permanecen fuera de alcance. Por otra parte, no está claro si las mutaciones de resistencia afectan las interacciones con diamides directamente o allosterically.
Estudios anteriores han reportado la estructura de varios dominios de RyR de especies de mamíferos y la estructura de cuerpo entero RyR1 mamíferos y RyR2 por cristalografía de rayos x y microscopia del cryo-electrón, respectivamente10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Pero hasta el momento, ninguna estructura de insecto RyR se ha divulgado, que nos impide entender los entresijos moleculares de la función del receptor, así como los mecanismos moleculares de acción insecticida y el desarrollo de resistencia a los insecticidas.
En este manuscrito, presentamos un protocolo generalizado para la caracterización estructural de dominio β-trébol de N-terminal del receptor de rianodina de palomilla, una plaga destructiva que infectan cultivos crucíferas a nivel mundial22. La construcción fue diseñada según el conejo publicado RyR1 NTD cristal estructuras23,24y cryo-EM modelos estructurales16,17,18,19, 20 , 21. esta es la primera estructura de alta resolución para insectos RyR, que revela el mecanismo de compuerta canal y proporciona una plantilla importante para el desarrollo de insecticidas específicos usando el diseño de fármacos basado en estructura. Para la aclaración de la estructura, se empleó Cristalografía de rayos x, que se considera como el gold standard para la determinación de la estructura de proteínas en cerca de resolución atómica. Aunque el proceso de cristalización es impredecible y mano de obra, este protocolo paso a paso le ayudará a los investigadores a expresar, purificar y caracterizar otros dominios de insecto RyR o cualquier otras proteínas en general.

<table><tbody><tr>Vector <td></td><td></td><td>pET-28a-HMT</td><td>Este vector pET modificado contiene una marca de hexahistidina, una proteína de fusión MBP y un sitio de escisión de la proteasa TEV en el extremo N-terminal (Lobo y Van Petegem, 2009)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) cepa</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>Columna HisTrapHP (5 mL)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-325</td><td></td></tr><tr><td>Columna de resina de amilosa</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Q Columna de alto rendimiento Sepharose&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>Concentradores Amicon (10 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 26/600 columna de filtración de gel&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-36</td><td></td></tr><tr><td>Sistema robótico automatizado de manejo de líquidos&nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>Gryphon</td><td></td></tr><tr><td>96 Well CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-494</td><td></td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD7-601</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop montado - 20 micras</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-955</td><td></td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de carga Puck dewar</td><td>Molecular Dimensiones</td><td>MD7-607</td><td></td></tr><tr><td>Nano drop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Incubadora NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Crystal</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD5-605</td><td></td></tr><tr><td>Difracactor de rayos X</td><td>Rigaku</td><td>FRX</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR</td><td>Eppendorf</td><td>Nexus GX2</td><td></td></tr><tr><td>Mini-kit de preparación de plásmidos</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Extracción de gel kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>SspI endonucleasa de restricción</td><td>NEB</td><td>R0132S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polimerasa</td><td>Novagen</td><td>2868713</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Scientific Chemical</td><td>25389940</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Genview 367931</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Genview</td><td>7365459</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Centrífuga Genview</td><td>60242</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Scientific</td><td>Sorvall LYNX 6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sonnicator</td><td>Scientz</td><td>II-D</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificación de proteínas</td><td>GE Healthcare</td><td>Akta Microscopio de luz pura</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>IzIt tinte cristalino</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-710</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de electroforesis</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora agitadora</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2401</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla de cristal de índice</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Estructura pantalla de cristal</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD1-01</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla de cristal ProPlex</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD1-38</td><td></td></tr><tr><td>PACT pantalla de cristal premier</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD1-29</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla de cristal JCSG-plus</td><td>Molecular Dimensiones</td><td>MD1-37</td><td></td></tr></tbody></table>

estructura cristalina del dominio n-terminal del receptor de rianodina de plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Desarrollo de insecticidas potentes y eficientes dirigidos a receptores de insectos rianodina (RyRs) ha sido de gran interés en el área de control de plagas agrícolas. Hasta la fecha, varios de diamida de insecticidas contra plagas que ryrs han sido comercializados, que genera ingresos anuales de 2 billones de dólares. Pero la comprensión del modo de acción de insecticidas dirigidas a RyR es limitada por la falta de información estructural sobre insectos RyR. Esto a su vez restringe la comprensión del desarrollo de resistencia a los insecticidas en las plagas. La polilla del diamondback (DBM) es una plaga devastadora destruyendo cultivos crucíferos a nivel mundial, que también se ha reportado que muestran resistencia a los insecticidas de la diamida. Por lo tanto, es de gran importancia práctica para el desarrollo de nuevos insecticidas contra el RyR DBM, especialmente dirigidos a una región diferente del sitio de unión de la diamida tradicional. Aquí, presentamos un protocolo para caracterizar estructuralmente el dominio N-terminal de RyR de DBM. La estructura cristalina de la radiografía fue solucionada por reemplazo molecular con una resolución de 2.84 Å, que muestra un motivo plegamiento beta-trébol y una hélice alfa que flanqueaban. Este protocolo puede ser adaptado para la expresión, purificación y caracterización estructural de otros dominios o proteínas en general.

Purificación del
El dominio N-terminal de DBM RyR se expresó como proteína de fusión con una etiqueta de hexahistidine, una etiqueta MBP y un sitio de la hendidura de proteasa TEV. Hemos seguido una estrategia de cinco pasos de purificación para obtener una proteína altamente pura, adecuada para el propósito de la cristalización. En primer lugar, la proteína de fusión fue purificada de la fracción soluble de lisado de células por c...

En este artículo se describen los protocolos de determinación de la expresión, purificación, cristalización y la estructura de la proteína del dominio N-terminal del receptor de rianodina de polilla del diamondback (xylostella de Plutella).

Estructura cristalina del dominio N-terminal del Receptor de rianodina de Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Resolver la estructura del dominio del receptor de ryanodina puede ayudar a nuestra comprensión del mecanismo molecular de la función proteica, la acción de insecticidas y el desarrollo de la resistencia a los insecticidas. Esta medida implica el uso de cristalografía de rayos X para la ilustración de la estructura, que se considera un estándar de oro para la determinación de la estructura proteica a una resolución casi atómica. Esta estructura de alta resolución del dominio del receptor de ryanodina de insectos revela el mecanismo de medición de canales y proporciona una plantilla importante para el desarrollo de insecticidas específicos de especies utilizando enfoques de diseño de fármacos basados en estructuras.Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán, porque los futuros cristalógrafos de proteínas deben ser competentes en bioquímica, biofísica, ciencias de la computación y matemáticas. Comience por amplificar el ADN correspondiente a la proteína de interés por reacción en cadena de la polimerasa. Al final de la reacción, ejecutar los 50 microlitros enteros de mezcla de reacción en un gel de 2% agarosa, y extraer el ADN con un kit de extracción de gel de acuerdo con los protocolos estándar.A continuación, linealice el ADN vectorial LIC mezclando 20 microlitros del ADN vectorial con 6 microlitros de tampón de reacción 10X y 4 microlitros de enzima de restricción SspI en 30 microlitros de agua doble destilada. Incubar esta mezcla de reacción durante tres horas a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, ejecute toda la mezcla de reacción en un gel de 1% de agarosa, seguido de la extracción del ADN vectorial linealizado con un kit de extracción de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.A continuación, realice tratamientos separados de la polimerasa del ADN T4 en 5 microlitros del ADN vectorial linealizado y el ADN de inserción amplificado PCR, de acuerdo con los protocolos estándar. Incubar durante 40 minutos a temperatura ambiente, seguido de 20 minutos de inactivación del calor enzimático a 75 grados centígrados. Realice la reacción de recocido de clonación independiente de la ligadura combinando 2 microlitros del ADN de inserción tratado T4 con 2 microlitros del ADN vectorial LIC tratado T4 para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente.Para transformar las células BL21(DE3)E. Coli con el plásmido recombinante, descongelar 50 microlitros de células competentes en hielo, y añadir aproximadamente 1 microlitro del plásmido recocido al tubo. Mueva suavemente el tubo dos o tres veces para mezclar las células y el ADN, y coloque el tubo de nuevo sobre hielo durante 20 minutos.Al final de la incubación, impacta el calor de las células a 42 grados Celsius durante 40 segundos, seguido de dos minutos de nuevo sobre hielo. A continuación, agregue un mililitro de medio LB a temperatura ambiente al tubo, y coloque las células en un agitador de 250 RPM durante 45 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación del temblor, placa 150 a 200 microlitros de esta mezcla en placas de selección, e invertir las placas durante la noche a 37 grados centígrados.Al día siguiente, cultivar una sola colonia en 100 mililitros de medio 2-YT, complementado con kanamicina, en una incubadora de coctelera a 37 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, inocular un litro de medio 2-YT, complementado con kanamicina, con 10 mililitros de cultivo nocturno, e incubar a 37 grados celsius con temblor hasta que la lectura OD600 alcanza aproximadamente 0.6. Luego, inducir el cultivo con IPTG a una concentración final de 0,4 milimolar, y crecer las células durante cinco horas a 30 grados centígrados.Al final de la incubación, cosechar las células por centrifugación, y volver a suspender el pellet a 10 gramos de bacterias por cada 40 mililitros de concentración de tampón de la lysis. Interrumpe las paredes celulares por sonicación a una amplitud del 65%, y un segundo en un segundo de descuento, durante ocho minutos. Retire los restos celulares por centrifugación.A continuación, filtre el sobrenadante a través de un filtro de 22 micrómetros y cargue la solución en un bucle de muestra. Para purificar la proteína de fusión, inyecte el sobrenadante filtrado del lazo de la muestra en una columna de níquel-nitrolotriacético de cinco mililitros en un sistema de purificación con un gradiente lineal de 20 a 250 imidazol mililolar. Cortar la proteína diana elutada con la proteasa del virus de la proteína de color de tabaco, en una proporción de 1 a 50, durante la noche a 4 grados Celsius, y purificar la mezcla de reacción de escisión en una columna de resina de amilosa, y una columna de níquel-nitrolotriacético, para eliminar la etiqueta y la proteasa del virus de tabaco etch.Dialifear el flujo a través de la columna níquel-nitrolotriática contra el tampón de diálisis para reducir la concentración de sal, y purificar la muestra en una columna de intercambio de aniones por un gradiente lineal de cloruro de potasio de 20 a 500 mililitrolares en el tampón de elución. Luego, concentra la proteína en un concentrador centrífugo. Inyecte la proteína concentrada en una columna de filtración de gel Superdex 200 26/600 para comprobar la homogeneidad y evalúe la pureza de la proteína en un 15%SDS-PAGE.Para preparar la proteína para la cristalización, concentre la muestra de proteína purificada en 10 miligramos por mililitro en el concentrador centrífugo, y el intercambio de tampón a tampón de cristalización antes de un almacenamiento de 80 grados Centígrados. Para realizar el cribado de cristalización, utilice el método de difusión de vapor de gota sentada a 295 Kelvin, con varios kits de cristalización, y un sistema automatizado de manipulación de líquidos en un formato de 96 pozos. Al final del ajuste de caída, selle la placa de cristalización de 96 pocillos para evitar la evaporación y para permitir el equilibrio de la gota de proteína dentro del tampón del depósito.Coloque las placas en una incubadora de cristal a 18 grados centígrados. Revise las placas periódicamente bajo un microscopio de luz para monitorear la formación y el crecimiento del cristal. Para diferenciar los cristales de proteína de los cristales de sal, agregue un microlitro de colorante de proteína cristalina a la gota objetivo, y observe los cristales bajo el microscopio después de una hora.Los cristales proteicos aparecerán azules. Para optimizar aún más los cristales, utilice las condiciones positivas de cristalización y el método de difusión de vapor colgante en placas de 24 pocillos, seguido de incubación en la incubadora de cristales a 18 grados centígrados. Para determinar la estructura proteica, monte los cristales en una crioolopo bajo un microscopio de luz para la refrigeración del flash en nitrógeno líquido, y coloque los cristales en un unibuck para su almacenamiento y transporte.Preseleccione los cristales en un difusor de rayos X interno, utilizando la función de centrado manual para montar y centrar los cristales. A continuación, utilice el software de difracción de rayos X para recopilar los datos. Para indexar, integrar y escalar el conjunto de datos, utilizando el conjunto HKL-2000, seleccione primero el detector y cargue el conjunto de datos.A continuación, lleve a cabo la función de búsqueda de picos para encontrar los puntos de difracción. Indexe los puntos, seleccione el grupo de espacio correcto y realice la integración de picos. A continuación, escale el conjunto de datos.Ajuste el modelo de error y escale de nuevo. Guarde el archivo sca de salida. Para determinar la estructura mediante el paquete de software Phenix, cree un nuevo proyecto.En primer lugar, ejecute Extriage con el archivo sca para calcular el posible número de copias de moléculas de proteína en la unidad asimétrica. A continuación, para resolver el problema de fase mediante reemplazo molecular, ejecute Phaser, utilizando el archivo de datos de difracción, el archivo de estructura de plantilla con identidad de alta secuencia y similitud estructural como la proteína de destino, y el archivo de secuencia de proteínas, para encontrar la solución. Realice la compilación automática en Phoenix para generar el modelo inicial, utilizando el archivo de salida de Phaser y el archivo de secuencia de la proteína de destino.Construir manualmente la estructura en la densidad de electrones experimentales modificados utilizando COOT, y refinar usando Phenix refinar en ciclos iterativos. Valide el modelo final utilizando las herramientas de validación de Phoenix. En este experimento representativo, la purificación del dominio terminal final de la proteína receptora de ryanodina de polilla de diamante, como se demostró, produjo una sola banda de aproximadamente 21 kilodaltons por análisis STS-PAGE.El volumen de elución de la columna de filtración de gel confirmó que el dominio terminal final del receptor de ryanodina purificado era un monómero. Para la cristalización, las condiciones más óptimas bajo las cuales se formaron cristales en forma de placa de alta calidad fueron en presencia de 1 HEPES molar de un pH de 7, y 1,6 sulfato de amonio molar. La determinación de la estructura proteica a partir del conjunto de datos de difracción utilizando softwares como se ha demostrado reveló el dominio terminal final del receptor de ryanodina de polilla diamondback que abarca residuos 1 a 205.Las proteínas con gran desorden, regiones flexibles o con afnos débiles son difíciles de cristalizar. En estos escenarios, las estrategias de ingeniería de proteínas como la reducción de la entropía superficial, el truncamiento del bucle y la reticulación pueden aumentar la probabilidad de obtener mejores cristales proteicos. Además de revelar estructuras proteicas de alta resolución, la cristalografía de rayos X también se puede utilizar para estudiar las interacciones proteína-pesticida, lo que podría ayudar con el diseño de pesticidas basados en la estructura.

crystal-structure-n-terminal-domain-ryanodine-receptor-from-plutella

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

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