Utilizando tomografía de coherencia óptica y respuesta Optokinetic como lecturas de sistema Visual estructural y funcional en ratones y ratas
10 de enero de 2019
Se presenta un protocolo detallado para la evaluación de lecturas visuales y estructurales en roedores por coherencia óptica tomografía y optoquinéticas respuesta. Los resultados proporcionan información valiosa para la investigación oftalmológica y neurológica.
Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurología y la oftalmología, y ayudar a evaluar una gran variedad de retinopatías y manifestaciones de la retina en varios modelos de roedores. La principal ventaja de estas técnicas es que se pueden realizar investigaciones longitudinales no invasivas, reduciendo la variabilidad y reduciendo el número de animales necesarios para los experimentos. Estos métodos permiten la investigación cuantitativa in vivo de la estructura y la función que se pueden utilizar para investigar las condiciones patológicas, o para evaluar la utilidad potencial de las nuevas terapias.
Sin embargo, especialmente la aplicación de la tecnología de tomografía de coherencia óptica en los modelos de roedores sigue siendo difícil, principalmente debido al tamaño de los ojos pequeños. Demostrando los procedimientos estará Michael Dietrich, un estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Después de anestesiar el roedor, aplicar una gota de fenilefrina tropicamida en cada ojo para la dilatación pupilar.
Limpie el exceso de gotas húmedas después de un minuto. Y lubricar los ojos metilcelulosa a base de gel oftálmico para evitar secar el ojo y crear una córnea turbia. Luego usa fórceps para colocar una lente de contacto personalizada en el ojo.
Pulse el botón Inicio en la esquina derecha de la pantalla del panel de control para iniciar el modo de adquisición. A continuación, para imaginar el ojo izquierdo, coloque el soporte para asegurarse de que la bombilla del ojo izquierdo del roedor se enfrenta a la cámara. Establezca el nivel de filtro en R y seleccione BR y OCT para reflejos azules fundus imaging y B-scan acquisition en el software.
A continuación, ajuste la distancia de enfoque a aproximadamente 38 dioptrías, utilizando la perilla de enfoque en la parte posterior de la cámara. Y acerca la retina, hasta que la exploración OCT sea visible en la pantalla. A continuación, para asegurar un camino de haz a través del centro de la pupila, con un ángulo ortogonal de la retina en todos los planos, coloque el disco óptico en el centro del campo iluminado.
Y ajuste la línea horizontal y vertical B-scans a un nivel horizontal girando el soporte. En la pantalla del software, seleccione el modo de escaneo de volumen y establézcalo en 25 B-scans en modo de alta resolución a 50 seguimientos automáticos en tiempo real. Centre el centro de la cuadrícula de escaneo de volumen en el disco óptico e inicie la adquisición presionando la perilla de sensibilidad negra, y luego Adquiera en el panel de control.
Una vez completada la adquisición, establezca el nivel de filtro en A.Seleccione Autofluorescencia azul en el panel de control. Y ajuste el brillo de la imagen con la perilla de sensibilidad. Presione la perilla de sensibilidad y luego Adquiera para poner a prueba las celdas fluorescentes o los depósitos autofluorescentes.
Para el análisis de los análisis de volumen, utilice la segmentación automatizada del software del dispositivo OCT haciendo clic con el botón derecho en el análisis. Y seleccione Segmentación y, a continuación, Todas las capas. Realice la corrección manual de las capas haciendo doble clic en el escaneo deseado.
Seleccione Perfil de espesor. Y haga clic en Editar segmentaciones de capas. Seleccione una capa a la vez.
Y si es necesario corrija la línea verde moviendo los puntos rojos arrastrando y soltando a la posición correcta. A continuación, seleccione la pestaña Mapa de espesor. Elija la cuadrícula ETDRS de 1, 2, 3 milímetros.
Centre el círculo interior en el disco óptico. Por último, calcular el espesor de las capas de retina a partir de los valores de espesor proporcionados por el software para los diferentes sectores de la retina de interés. Para calcular los valores de espesor principales de los escaneos de volumen, utilice toda la cuadrícula ETDRS de 1, 2, 3 milímetros que cubre un ángulo de aproximadamente 25 grados, excluyendo el círculo interno de un milímetro que contiene el disco óptico.
Comience seleccionando una plataforma para medir los roedores. Abra la ventana Ajustes preajustes haciendo doble clic en el software. Seleccione Nuevo grupo y elija el nombre del grupo, el número de sujetos, las especies y las cepas.
Seleccione un estímulo variable, frecuencia espaciotemporal, sensibilidad al contraste, velocidad u orientación en el menú desplegable y pulse Crear nuevo grupo. Concéntrese en la plataforma manipulando el anillo de enfoque de la cámara en la parte superior de la cámara. Y calibrar el sistema alineando el círculo rojo alrededor del círculo negro en la plataforma.
A continuación, coloque el roedor en la plataforma y déjelo adaptarse al entorno durante unos cinco minutos. A continuación, inicie la medición seleccionando la flecha izquierda para sí o el cuadrado para no, si el animal rastrea o no realiza un seguimiento respectivamente. Seleccione manualmente el tamaño del paso del estímulo haciendo clic en las flechas arriba y abajo junto al estímulo variable.
Por último, seleccione la pestaña Resumen y haga clic en Archivo, Exportar tabla o Gráfico para exportar el conjunto de datos deseado. Los resultados indican que la degeneración de las capas internas de la retina se reduce. Y una puntuación clínica EAE se atenúa durante el curso EAE cuando se administró la sustancia 1.
Además, OKR revela una mejor agudeza visual de los animales tratados con la sustancia 1 en comparación con los ratones MOG EAE no tratados medidos por pruebas de umbral de frecuencia espacial durante un período de 120 días. Al realizar mediciones de PTU, un paso crítico es la orientación ortogonal del rayo láser en todos los planos en relación con la retina para garantizar la calidad y reproducibilidad de los valores de espesor. Para la técnica OKR, distinguir entre el seguimiento y los movimientos conductuales normales del animal, requiere cierto entrenamiento del investigador.
Es importante ser cegado para el grupo experimental. Después de estas investigaciones de daños estructurales y funcionales que ocurren en el contexto de la encefalomielitis autoinmune experimental, el procedimiento también puede ser útil en otros modelos que involucran el sistema visual, incluyendo pero no limitado a los modelos de retinopatías, o lesión del nervio óptico. Estas técnicas allanan el camino para la investigación in vivo en los campos de la neurología y la oftalmología y son fácilmente transferibles a los ensayos clínicos.
Visión general
Este artículo presenta un protocolo integral para evaluar lecturas estructurales y visuales en modelos de roedores utilizando tomografía de coherencia óptica (OCT) y respuesta optocinética (OKR). Estas técnicas no invasivas proporcionan información aplicable tanto a la investigación oftalmológica como neurológica, permitiendo estudios longitudinales con menor variabilidad y menos sujetos animales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oftalmología
- Modelos de roedores
Antecedentes
- El estudio se centra en evaluar retinopatías y manifestaciones retinales en roedores.
- Destaca los desafíos asociados con la aplicación de OCT debido al pequeño tamaño de los ojos de los roedores.
- OCT y OKR facilitan la investigación cuantitativa in vivo de la estructura y función retinal.
- Estos métodos proporcionan datos valiosos para evaluar posibles terapéuticos y comprender condiciones patológicas.
Propósito del estudio
- Desarrollar y demostrar un protocolo para el uso de OCT y OKR en la investigación con roedores.
- Investigar el daño estructural y funcional en el contexto de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE).
- Evaluar la efectividad de nuevas sustancias de tratamiento en modelos preclínicos.
Métodos utilizados
- Los roedores fueron anestesiados para comodidad durante los procedimientos de OCT y OKR.
- Las imágenes de OCT se realizaron utilizando una lente de contacto personalizada y configuraciones específicas de software para escaneos de alta resolución.
- La plataforma OKR implicó presentar varios estímulos para evaluar las capacidades de seguimiento visual.
- Los pasos clave incluyeron procedimientos cuidadosos de calibración y adquisición para garantizar resultados confiables de imagen y seguimiento.
Resultados principales
- Los resultados indicaron una disminución en la degeneración de las capas retinales internas en los roedores tratados.
- Se observó una agudeza visual mejorada en los animales tratados en comparación con los controles no tratados.
- Los datos sugieren que estas técnicas pueden medir de manera confiable los cambios retinales y la función visual a lo largo del tiempo.
Conclusiones
- Este estudio demuestra la viabilidad de OCT y OKR como herramientas poderosas para la investigación in vivo en neurología y oftalmología.
- Los hallazgos permiten una exploración adicional de la patología retinal y la evaluación de nuevas intervenciones terapéuticas.
- Las metodologías presentadas podrían contribuir significativamente a los diseños de ensayos clínicos y la comprensión de los trastornos del sistema visual.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Combining structural and functional visual system readouts enables longitudinal, quantitative assessment of retinal integrity and visual function in rodent models, supporting mechanistic de-risking in preclinical neurology and ophthalmology programs. This dual-modality approach reduces experimental variability and animal use while providing translatable endpoints for evaluating neuroprotective or disease-modifying therapeutics. The methodology enhances predictive confidence in target validation by correlating retinal structural changes with functional visual outcomes across disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying retinal layer thickness as a structural biomarker of neurodegeneration or neuroprotection.
- Operational Value: Provides reproducible, noninvasive structural readouts that support functional target validation in visual pathway modulation.
- Predictive Value: Correlates OCT-derived retinal structural changes with OKR-measured visual acuity to strengthen target engagement and pathway modulation confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized OCT and OKR procedures for quantitative in vivo imaging and behavioral tracking, enabling reliable compound screening.
- Reproducibility: Facilitates longitudinal tracking of retinal structure and function, reducing inter-animal variability and improving assay precision.
- Scalability: Supports high-throughput adaptation through customizable stimulus parameters and automated segmentation for consistent data output across studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrates applicability in autoimmune encephalomyelitis (EAE) models, linking retinal structural preservation to functional visual improvement and clinical symptom attenuation.
- Translational Continuity: Provides a bridge from discovery to preclinical validation by measuring both retinal neurodegeneration and visual function recovery over extended periods.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by demonstrating substance-induced reduction in inner retinal layer degeneration and improved spatial frequency thresholds over 120 days.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, offering structural and functional endpoints that inform biological activity and therapeutic potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantitative in vivo investigation of retinal structure and function in neurodegeneration and neuroprotection models.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible structural thickness maps and functional tracking metrics for reliable compound evaluation in visual system assays.
- Analytics: Generates layer-specific thickness profiles and spatial frequency thresholds that enable cross-condition comparison and dose-response analysis.
- Translational Research: Connects structural retinal preservation with functional visual acuity recovery, supporting biomarker alignment and preclinical continuity in neurologic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal visual system assessment across multiple disease indications and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through correlated structural and functional visual system readouts.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via calibrated imaging protocols and blinded behavioral tracking procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, translatable biomarkers of retinal and visual function change, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating both retinal structural preservation and visual functional improvement in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, ophthalmic preparation, and OCT/OKR system operation for reliable data acquisition.
- Depends on customized holders, contact lenses, and calibrated imaging systems to accommodate small rodent eye size and ensure beam alignment.
- Necessitates cross-team standardization of anesthesia, dilation, lubrication, and imaging protocols to maintain consistency across sites or studies.
- Involves adaptation considerations for varying stimulus parameters (spatiotemporal frequency, contrast, speed) in OKR assays across species and strain models.
- Includes practical limitations such as the need for investigator training to distinguish true optokinetic tracking from normal behavioral movements and ensure blinding during assessment.
