Name: Un modelo de ratón controlado para la Sepsis Neonatal polimicrobiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Aprende a preparar inóculos de suspensión cecal para inducir sepsis neonatal polimicrobiana en ratones de siete días. Este protocolo estandarizado permite identificar puntos finales humanitarios mediante evaluación conductual.

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Agradecimiento especial a Claire Harrison y el Animal centro de cuidados en British Columbia Infantil Hospital investigación Instituto (BCCHR) por su apoyo en el trabajo animal, así como al Dr. Po-Yan Cheng por su orientación y entrada de control animal y bienestar.

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+causes+of+child+mortality+in+2000-13%2C+with+projections+to+inform+post-2015+priorities%3A+an+updated+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis.</a> The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mortality+and+altered+immunity+in+neonatal+sepsis+produced+by+generalized+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis.</a> Shock. 28 (6), 675-683 (2007).</li>
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<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+innate+immunity+predisposes+murine+neonates+to+poor+sepsis+outcome+but+is+reversed+by+TLR+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists.</a> Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).</li>
<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CXC+ligand+10%2FCXC+receptor+3+signaling+in+the+murine+neonatal+response+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis.</a> Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+immunity+and+defects+in+the+neonatal+and+elderly+immune+response+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis.</a> Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).</li>
<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+emergency+myelopoiesis+following+polymicrobial+sepsis+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates.</a> Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+emergency+myelopoiesis+and+survival+in+neonatal+sepsis+by+caspase-1%2F11+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation.</a> Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+IL-17A+attenuates+neonatal+sepsis+mortality+induced+by+IL-18%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).</li>
<li>Fallon, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Program+Cell+Death+Receptor-1-Mediated+Invariant+Natural+Killer+T-Cell+Control+of+Peritoneal+Macrophage+Modulates+Survival+in+Neonatal+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1469(2017).</li>
<li>Young, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+after+induction+of+sepsis+by+cecal+slurry+in+PD-1+knockout+murine+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates.</a> Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).</li>
<li>Rincon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+pretreatment+with+alum+protects+neonatal+mice+in+sepsis+through+myeloid+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation.</a> Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).</li>
<li>Starr, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cecal+slurry+preparation+protocol+with+improved+long-term+reproducibility+for+animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis.</a> PLoS ONE. 9 (12), e115705(2014).</li>
<li>Hansen, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+milk+fat+globule-epidermal+growth+factor-factor+8+exacerbates+organ+injury+and+mortality+in+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).</li>
<li>Fujioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+heme+oxygenase-1+attenuates+the+severity+of+sepsis+in+a+non-surgical+preterm+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22SHOCK%22%5BJournal%5D)">Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model.</a> SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).</li>
<li>Al Asmari, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+quinacrine+against+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> BMC Nephrology. 18, PMC5273840(2017).</li>
<li>Geng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+gene+expression+profiles+and+signaling+pathways+in+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+ameliorates+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Experimental+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice.</a> Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).</li>
<li>Nara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluations+of+lipid+peroxidation+and+inflammation+in+short-term+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).</li>
<li>Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%3A+determinants+and+characteristics+of+the+injury-induced+hyperinflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).</li>
<li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+Endpoints+for+Infectious+Disease+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).</li>
<li>Canadian Council on Animal Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+on%3A+choosing+an+appropriate+endpoint+in+experiments+using+animals+for+research%2C+teaching+and+testing%22">Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing</a>. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).</li>
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</ol>

Dr. James Wynn recibe el apoyo de los institutos nacionales de salud (NIH) / National Institute of General Medical Sciences (R01GM128452) y del NIH / nacionalEunice Kennedy Shriver Instituto de salud infantil y desarrollo humano (NICHD) () R01HD089939).

Ratones de neonatales postnatales tienen muy limitada la movilidad y no se justo después de ser situados en su espalda, incluso cuando indiscutido. 7 DOL, la edad de los ratones desafiados en este modelo, un rango de movimiento que abarca desde los derechos móvil a FTR-Mobile se observó en ratones indiscutible, con una diferencia importante, es decir, que un ratón indiscutible a esta edad no se mostraban comportamiento letárgico FTR. Sólo ratones desafiados con sepsis polimicrobiana se observaron a ser FTR-letárgico; por lo tanto, esta respuesta puede ser un marcador de severidad de la enfermedad. Estar atentos al corte de un ángulo de 90° de horizontal para el movimiento de cadera permite la asignación consistente y exacta del movimiento de cadera letárgico o móvil en ratones. El marco de tiempo de 4 s a ver si un ratón puede correcto sí mismo fue seleccionado porque indiscutible ratones pudieron constantemente a la derecha ellos mismos dentro de este marco de tiempo. Repite la medición del mismo ratón fue evitado, mientras que el tiempo a sí mismos y la medición de la movilidad de cadera fue limitada a 4 s, para evitar cansarse excesivamente el ratón, que de lo contrario podría afectar su capacidad para obtener alimentos y calor y podría afectar a su pronóstico mejor. Corregir a sí mismo de la izquierda y la derecha fueron observadas, y la mayor de las puntuaciones fue utilizado para determinar si el ratón estaba en un extremo humano, porque algunos ratones fueron encontrados para mostrar Nonmobile FTR en un lado pero tiene una mayor movilidad en el otro lado y b e recuperar eventualmente.
El sistema de puntuación utilizado para evaluar la salud de ratón se basó en la aplicación de cortes categóricos a lo que es un espectro de movimiento y, por tanto, podría ser propenso al sesgo individual. El personal fue entrenado juntos para que cada persona anotó los ratones de la misma; sin embargo, probablemente se mantendrá un nivel de subjetividad que conduce a la variación. Se evaluó la consistencia de la puntuación por tener siete investigadores que no habían realizado previamente el seguimiento neonatal del ratón aprender los requisitos descritos en este protocolo y el video y, entonces, independientemente asignar comportamientos y determinar humanos punto final. Una exactitud de 97% se observó con puntaje en 60 ratones desafiados, sugiriendo que sesgo individual no desempeña un papel substancial en las asignaciones de comportamiento de este modelo. El protocolo de monitoreo conductual presentado se basa en observaciones de animales desafiados en DOL 7, sin embargo, ratones menores de 6 días en un estado saludable sin respuesta no constantemente a la derecha ellos mismos. Así, los criterios de punto final humanitario descrito no podrían aplicarse directamente a los ratones más jóvenes. Si se utilizan ratones más jóvenes en este modelo experimental o si se aplica un modelo de desafío diferente con cinética de diferentes enfermedades, entonces criterios de punto final humanitario adecuado deben ser desarrollados y pilotados para evitar la eutanasia de ratones que de lo contrario, con el tiempo, recuperar. El sistema de puntuación muestra un método robusto de mejorar clasificación extremo humano que prueba y confirmación, potencialmente podría ser aplicado a otros modelos.
Cada preparación de la mezcla de ciego o el uso de una nueva cepa de ratón necesaria la retitration de la dosis de mezcla cecal a administrar para alcanzar una dosis letal similar. Cada preparación fue estandarizado por la lectura de interés, es decir, supervivencia, en lugar de dar el mismo recuento bacteriano. Concentración bacteriana viable de cada preparación de la mezcla ciego variada ligeramente, potencialmente debido a diferencias en las bacterias comensales del donante o a variaciones en el peso a la izquierda en el colador de la célula de la postfiltration bolsa cecal de la mezcla. Durante la valoración de la mezcla del ciego, las dos primeras camadas fueron divididas en dos grupos y cada mitad de la camada fueron desafiados con una de las dos dosis para que cada una de las dosis sería probada en dos camadas. Si la tasa de supervivencia resultante no coincide con el nivel requerido, entonces la dosis de desafío aumentada o disminuida en un 5% - 10% y repite el experimento. Se utilizaron varias camadas para tener en cuenta las diferencias de la camada a camada que podrían provocar resistencia o mayor susceptibilidad a la sepsis a través de una camada. Era importante título exactamente el stock de mezcla cecal con cada nueva preparación para asegurarse de que la nueva valoración de lodos ciego era comparable a preparaciones de cecal de la mezcla anterior. Se observaron períodos de excesivo ruido y vibraciones, específicamente durante la compactación de asfalto y la construcción de un edificio cercano y de camino, para aumentar la tensión en las presas. Esto correlaciona con aumento de las tasas de canibalización y afecta la mortalidad de los experimentos de supervivencia, incluso afectando a ratones sin respuesta, indicando que pueden ser extraños efectos sobre la supervivencia neonatal que también deben ser controlados para.
Anteriores métodos para preparación de stock la mezcla cecal incluyen el uso de la mezcla fresca de cecal o la preparación de la mezcla cecal congeladora, usando una variedad de métodos, incluyendo el almacenaje en glicerol que inevitablemente sería transferido durante el desafío. Mientras que el uso de la mezcla cecal fresco proporciona la ventaja de tener una composición bacteriana más cercana al original contenido cecal, existe el riesgo de variación entre ratones donantes individuales debido a la variación de bacterias comensales. Cuando esto fue minimizado mediante el uso de donantes cecales al mismo vendedor con mínimo tiempo entre llegada y progresión del experimento, esto podría convertirse en una opción coste-prohibitivos para algunos laboratorios y presenta otro desafío de logística de distribución que experimentan de ratones de edad comparable disponibles al partir de una mezcla de cecal en ratones neonatales que fueron 7 días de edad. Se utilizó un método alternativo al uso de lodos cecal fresco, donde contenido cecal de múltiples donantes adultos se agruparon, resuspendió en D5W, congelados a-80 ° C sin glicerol y descongelado una alícuota en un momento para experimentos. La utilización de lodos cecal de donante adulto para el estudio de la sepsis neonatal potencialmente podría transferir especies de bacterias presentes en la mezcla cecal que el ratón neonatal no ha sido expuesto a, pero es una estrategia que permite el estudio de la sepsis en ratones neonatales y se ha utilizado para estudiar la biología del ratón neonatal en los últimos13,14,15. Mezcla cecal se diluyó en D5W para proporcionar alimentación a las bacterias, que permitió el establecimiento de una infección activa una vez que las bacterias se inyectaron y fue hecho para imitar la disponibilidad de nutrientes en la cavidad peritoneal durante necrotizante enterocolitis. No se incluyó como un agente estabilizador de congelación las bacterias debido a los efectos secundarios negativos potenciales que podrían surgir de la inyección de glicerol solo glicerol. Si el glicerol se ha incluido en la preparación de la mezcla de ciego, entonces el daño potencial que glicerol solo podría inducir necesita comprobarse mediante la inclusión de una solo glicerol (falta cecal mezcla) inyección en ratones, que habría aumentado ratón uso. La viabilidad de las bacterias de las poblaciones de mezcla cecal fue probada después de congelar el caldo mezcla ciego sin glicerol y fue encontrada para ser constante, sin cambios en la concentración de bacterias en distintas alícuotas de la misma preparación de la mezcla cecal almacenada a-80 ° C durante 6 período de meses. Esto sugiere que el almacenamiento sin glicerol es factible en la prestación de un resultado biológico consistente. También permite la utilización de un bulto preparado, mezcla cecal caldo congelado para el uso de ratones criados en casa, reduciendo los costos y utilizando ratones machos que serían exceso de cría, reduciendo despilfarro de ratón.
La identificación de retos fallidos en ratones fue importante para evitar la adición de ruido adicional al sistema. Después de someterse a una inyección intraperitoneal de mezcla cecal, los ratones se observan la presencia de un abultamiento por debajo de la piel, que indica una inyección fallida que fue realmente subcutánea. Ratones se observaron fugas en el sitio de inyección, inmediatamente después del retiro de la aguja y después de lo que les permite dar un paso después de la inyección, ya que ratones sería a veces (raramente) fugas sólo después de mover el miembro del sitio de inyección por dar un paso. La presencia de un abultamiento o fugas después de la inyección dio lugar a quitar el ratón de los análisis. Después de todo, cualquiera de estas puede resultar en un resultado diferente debido a la cantidad incorrecta de cecal mezcla inyectada como se ha observado una diferencia de 5% en la dosis de desafío que afectan la supervivencia posterior.
Desafío de mezcla ciego experimenta a menudo requieren diferentes dosis letales de destino con diferentes dosis ajustada por peso. Debido a esto, los volúmenes de inyección pueden variar desde tan poco como 20 μl y 100 μl. El error experimental proporcional asociado con aguja muerta volumen también cambia junto con el volumen de inyección, aumentando la dificultad para comparar directamente diferentes dosis. Con la simple modificación de normalizar el volumen de inyección, se elimina esta fuente de variación del experimento.
Sistema de monitoreo conductual neonatal del ratón utilizado en este protocolo es el primero de su tipo. Intención de los investigadores en investigación ética con ratones recién nacidos a menudo se enfrentan a la desafiante falta de recursos para evaluar el bienestar de los animales a esta edad. El sistema de control intuitivo y consistente presentado comienza a abordar esta brecha de conocimiento. Lo importante, este enfoque basado en evidencia no sólo aumenta la calidad de los datos experimentales obtenidos, pero, al mismo tiempo, también reduce el sufrimiento de los animales experimentales.

La sepsis es la principal causa de muertes infecciosas recién nacido humano1. Porque recién nacida sepsis es mal entendida, poco progresos en ambos la identificación de recién nacidos en riesgo temprano durante la enfermedad y el desarrollo de tratamientos eficaces o profilaxis. Esto requiere el uso de modelos animales de sepsis para entender mejor el proceso y prueba de posibles intervenciones. Además, los roedores adultos responden de diferente manera a sepsis, con diferencias estadísticamente significativas en el número de bacterias a administrar para obtener la misma dosis letal (LD) y las diferencias en la respuesta del huésped resultante en comparación con los recién nacidos2. Así, sepsis neonatal tiene que estudiarse en los recién nacidos. Varios modelos de sepsis adultos se han utilizado en la investigación de la sepsis. Se trata de un desafío intravenoso con organismos específicos implicados en la sepsis humana adulta o ligadura cecal y de la puntura (CLP). CLP es un modelo endógeno desafío donde el ciego es quirúrgico aislado, ligado y perforado para permitir la salida del contenido intestinal al peritoneo, llevando eventualmente a la diseminación sistémica de los microbios y sus productos3. Sin embargo, el procedimiento quirúrgico para establecer CLP es letal para animales recién nacidos; por lo tanto, un método alternativo es necesario imitar el reto polimicrobial de CLP para inducir sepsis neonatal. El modelo de mezcla cecal para sepsis neonatal polimicrobiana fue desarrollado para hacer frente a esta necesidad, por el que el contenido cecal de animales es cosechado, suspendido en estéril dextrosa 5% en agua (D5W) e inyectado por vía intraperitoneal en ratones recién nacidos2. Esto se ha, convertido en un modelo cada vez más popular para el estudio de sepsis en animales recién nacidos y adultos y ha avanzado sustancialmente la visión mecanicista de la enfermedad proceso en4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Dada la creciente utilización de este modelo y el deseo de los investigadores para comparar directamente los resultados a través de publicaciones, hay una necesidad de los aspectos técnicos a ser bien descritos y estandarizados a través de estudios. Estandarización aplica a tres aspectos del modelo, es decir, i) la preparación de la acción de mezcla cecal, ii) la preparación de las alícuotas de desafío para la inyección en animales de experimentación y iii) la definición del extremo humano por el que los animales se consideran a los que no sobreviven en los experimentos de desafío. Específicamente, métodos para preparar el caldo mezcla cecal a menudo se hace referencia al artículo original introducción el modelo2. Un breve resumen de este modelo es que contenido cecal de ratones adultos era cosechado, suspendido en D5W estéril a una concentración de 80 mg/mL y dentro de 2 h inyectar los animales experimentales. Este modelo original utilizado ratones de la misma edad, de la misma ubicación del vendedor, que se encuentra en sus instalaciones de investigación respectivos para menos de 2 semanas antes de la cosecha el contenido cecal. El uso de ratones criados internos, aunque reduciendo el coste de entrega proveedor regular y permitiendo el uso de ratones exceso de una gama más amplia de sexo y edad, también sustancialmente aumentado variabilidad de donante a donante. Esto motivó el desarrollo de una técnica alternativa, por el contenido cecal de varios ratones se agruparon para preparar una acción grande, que era entonces alícuotas y almacenados a-80 ° C13. Este método alternativo fue adaptado por múltiples grupos14,15. Sin embargo, esa adaptación resultó en algunas variaciones técnicas, tanto en los medios de almacenamiento utilizados (10% o 15% de glicerol o D5W solo) como en la estrategia de filtración para eliminar partículas (filtración gradual a través de un 860 μm y, entonces, un 190 filtro o individuo filtraciones a través de 100 μm o 70 μm filtro)13,14,15. La inyección de glicerol sólo podría causar daños, dado que las inyecciones de glicerol 25% - 50% se han utilizado como un modelo de roedor de lesión renal16,17,18,19, 20. Para evitar los efectos secundarios no deseados de glicerol, la preparación de stock la mezcla ciego para los ratones en este estudio se congela en D5W sin glicerol, y se realizan pruebas de viabilidad bacteriana de almacenamiento a-80 ° C. La estrategia de filtración utilizada en este estudio es un paso a través de un filtro μm 70, que no se ha comparado directamente a las otras estrategias de filtración enumeradas.
Dosis letales ajustado por el peso de la mezcla inyectada de cecal pueden variar de planta a planta y deben ser dosificados hacia fuera a la letalidad deseada para los grupos individuales. Con dosis de desafío diferente, los volúmenes de desafío que cambian por necesidad. Sin embargo, este detalle metodológico no se ha divulgado antes. Además, estrategias para los procedimientos estándar, como la inyección intraperitoneal, se elaboran raramente en dentro de la literatura, sino técnicas individuales pueden afectar ya sea ratones recién nacidos tener fugas cuando se inyecta y el impactan de sus resultados finales.
Bienestar de los animales, incluyendo una definición del criterio de valoración humana, es un aspecto central de este modelo y en cualquier modelo de infección e inflamación en roedores21. En 1998, el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal (CCAC) publicó directrices extensas para la selección de extremo humano, definir el punto final humanitario como "cualquier actual o potencial de dolor, angustia o malestar debe ser minimizado o paliar eligiendo los primeros extremo que es compatible con los objetivos científicos de la investigación"22. Otros también precaución que deben establecerse criterios de valoración humanas basada en la justificación científica y no en una interpretación subjetiva de estado solo21 del animal. Mientras que hay una gran cantidad de recursos para clínicas, conductuales y condición corporal muestra-criterios para extremo humano, incluso en el contexto de la infección y la inflamación específicamente21,23,24, ninguno de estos , incluidas las directrices de la CCAC para punto final humanitario22, mención a ratones recién nacidos. Por lo tanto, objetivamente y científicamente justificadas extremos humanos son mucho más difíciles de establecer para los animales recién nacidos, dada su limitada capacidad de comportamiento y la falta de evidencia de criterios como la pérdida de peso, que se utiliza comúnmente para el adulto ratones. Actualmente, los criterios para el extremo humano utilizado para ratones neonatales de 5 a 12 días de edad en la literatura de cecal mezcla toda referencia al manuscrito original que introdujo el modelo2. En este trabajo original, la definición de extremo humano para animales recién nacidos se basó en dos criterios; es decir, la ubicación del ratón fuera del nido (dispersión) y la falta de manchas de leche habían sido vistos a causar la muerte dentro de horas. Un asunto que complica en asignar un extremo humano es que manchas de leche llegan a ser difíciles de ver en cepas de ratón con pelaje oscuro, como la cepa C57BL/6J comúnmente empleada, después de la primera semana de vida, mientras que los animales enfermos son monitoreados hasta el día 14 de vida (DOL). Más animales muertos pueden encontrarse postchallenge cuando al aplicar estos criterios (propia observación inédita); así, una definición más rigurosa de extremo humano es necesaria para aliviar el sufrimiento a animales de experimentación y evitar mortalidad en situaciones donde el resultado podría ser exactamente discernir antes.
Todos tres aspectos metodológicos del modelo de mezcla cecal son presentados en un procedimiento de funcionamiento de estándar que detalla la preparación de material cecal de la mezcla, un método para inyectar en animales de experimentación que mantiene la constante de volumen de inyección entre las dosis y reduce el riesgo de fugas y la definición de extremo humano para ratones de 7 a 12 días de edad basado en un sistema de modelado de comportamiento. Comportamiento información de cuentas de salud de ratón más de 240 animales recogido y agrupado por resultados de supervivencia final, demostrando una definición basada en pruebas de extremo humano. El sufrimiento de los animales de experimentación se reduce mediante la identificación de ratones neonatales moribundos en el punto posible más temprano, mientras que los resultados de supervivencia biológicamente significativas se pueden inferir mediante la observación de las variables clave. La representación visual de la preparación de la mezcla cecal y comportamientos ratón neonatal servirá como un excelente recurso para cualquier grupo de estudio de sepsis o reto recién nacido modelo animales.

<table><tbody><tr><td>0,1 - 20 &mu; Puntas de pipeta en L</td><td>VWR</td><td>732-0799</td><td></td></tr><tr><td>1,8 mL Tubo de microcentrífuga</td><td>Costar</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1000 &mu; Puntas de pipeta L</td><td>VWR</td><td>732-0801</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &mu; Puntas de pipeta</td><td>L VWR</td><td>732-0800</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo de centrífuga</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-25</td><td></td></tr><tr><td>23G1 Agujas</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>305145 solo la aguja, no la jeringa, utilizada para sujetar el ratón a la espuma de poliestireno</td></tr><tr><td>28G 0,5 mL Jeringa de insulina</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Vial criogénico</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo de centrífuga</td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 5 mL</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Ratones adultos C57BL/6J de 6 - 10 semanas de edad</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>ratones neonatos C57BL/6J de 7 + días de edad</td><td>Criados en casa</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Colador de células</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Sangre de oveja desfibrinada</td><td>Dalynn</td><td>HS30-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa 5% agua (D5W)</td><td>Baxter</td><td>JB0080</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de disección</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección, punta afilada</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 82027-592</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección, punta afilada/roma</td><td>VWR</td><td>82027-594</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (HistoPrep 95% Alcohol etílico desnaturalizado)</td><td>Fisherbrand</td><td>HC11001GL</td><td>diluido al 70% con agua doble destilada</td></tr><tr><td>Marcador a prueba de etanol; Rotulador de laboratorio</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>EZ Anesthesia Vaporizer</td><td>EZ Anesthesia</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500, Instrumento quirúrgico de esterilización en seco (Esterilizador de perlas calientes)</td><td>Braintree Scientific</td><td>GER 5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>Micro Espátula</td><td>Chemglass</td><td>CG-1983-12</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic Pipeta PR-1000</td><td>Rainin</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic Pipeta PR-20</td><td>Rainin</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic Pipeta PR-200</td><td>Rainin</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Sartorius</td><td>BL 150 S Pinzas</td><td></td></tr><tr>para<td>muestras</td><td>VWR</td><td>82027-440 / 82027-442</td><td></td></tr><tr><td>Botella de almacenamiento cuadrada de 1000 mL</td><td>Corning</td><td>431433</td><td></td></tr><tr><td>tablero de espuma de poliestireno</td><td>Cualquier</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de eutanasia Sure-Seal Mouse/Rat</td><td>Euthanex</td><td>EZ-178</td><td></td></tr><tr><td>Agar de soja tríptico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22091-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>VX-200 Mezclador de vórtice de laboratorio</td><td>Labnet International</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>Pesar papel</td><td>Fisherbrand</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón controlado para la sepsis neonatal polimicrobiana

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

La sepsis neonatal sigue siendo una carga global. Se necesita un modelo preclínico de intervenciones profilácticas o terapéuticas eficaces a la pantalla. Sepsia polimicrobial de ratón neonatal puede ser inducida por inyección mezcla cecal por vía intraperitoneal en el día de la vida 7 ratones y monitoreo para la semana siguiente. Se presentan aquí los pasos detallados necesarios para la implementación de este modelo de sepsis neonatal. Esto incluye hacer un stock homogéneo de la mezcla cecal, diluir a una dosis ajustada por peso y basura, un esbozo de la agenda de seguimiento y la definición de categorías de salud observados utilizan para definir criterios de valoración humanas. La generación de un stock homogéneo de la mezcla cecal de los donantes permite la administración en muchas camadas con el tiempo, reduciendo la variación entre los donantes y evitar el uso de glicerol potencialmente tóxico. La estrategia de control utilizada permite la anticipación de resultados de supervivencia y la identificación de los ratones que progresaría más adelante a la muerte, lo que permite una identificación anterior del extremo humano. Dos principales características de comportamiento son utilizados para definir los resultados de salud, es decir, la capacidad de los ratones neonatales a sí mismos cuando se coloca en su espalda y su nivel de movilidad. Estos criterios potencialmente podrían aplicarse a extremos humana dirección en otros estudios de enfermedad neonatal en ratones, como se realiza un estudio piloto para confirmar la exactitud. En conclusión, este enfoque proporciona un método estandardizado para sepsis neonatal modelo en ratones, mientras que proporciona recursos para evaluar el bienestar de los animales utilizado para definir principios extremos humanos para los animales desafiados.

Viabilidad de cecal lodos almacenado a-80 ° C puede ser probado en el tiempo por dilución en serie y galjanoplastia alícuotas de acción mezcla cecal en agar de soja tríptica de sangre de oveja al 5% seguido de 24 h de incubación aeróbica a 37 ° C. Posterior cuenta del contenido de unidad (UFC) forman colonias cultivables de una preparación de la mezcla cecal fue encontrado no para cambiar durante un período de 6 meses, y la viabilidad no fue afectada por un almacenamiento prolongado a-80 ° C (figura 2). Cada ratón donante resultó, en promedio, en suficiente mezcla cecal a tres o cuatro camadas (datos no mostrados).
Ratones desafiados en DOL 7 con mezcla cecal para inducir sepsis polimicrobiana comenzaron a llegar a la meta humana dentro de las 12 h del desafío, y sepsia polimicrobial sobre todo fue resuelto por postchallenge 48 h, como se observa en una curva de supervivencia de Kaplan-Meier combinada de datos de más de 200 ratones desafiados (figura 1A). La letalidad fue dependiente de la dosis de desafío administrada, con un cambio de 5% en dosis de desafío, lo que resulta en un áspero 15% de diferencia en la tasa de supervivencia (figura 1B). Se midió el peso corporal de ratón en cada visita de control. Pérdida de peso se observó en los animales desafiados, ser no discriminatoria entre ratones que sobreviven y los que no lo hizo durante la inicial 24 h postchallenge (figura 1). Después de 24 h, animales más supervivientes comenzaron a recuperar su peso, mientras que todos los que no sobreviven continuaron bajar de peso y se trasladó a su extremo humano. Sin embargo, una pequeña proporción de animales que habían conservado su righting reflex también continuado para perder peso o no aumento de peso, hasta el final del experimento, incluso perdiendo tanto como el 20% de su peso corporal inicial dentro de las 40 h del reto de sobrevivir. Como había una superposición de pérdida de peso entre ratones que sobreviven y los que no, el cambio en peso o un umbral de pérdida de peso no se podía utilizar como un criterio para extremo humano manteniendo el objetivo de dividir exactamente sobrevivientes de los que no sobreviven.
El comportamiento de los ratones fue supervisado como se indica en el protocolo y en la tabla 2. Instantáneas de la salud son categorías aparecen (Figura 3A-C). Estas fotos muestran las categorías de salud diferentes de los ratones que no ellos mismos a la derecha después de ser situados en su espalda y trazar la diferencia entre FTR-móvil y FTR-letárgico, que es una distinción importante. Ratones sanos indiscutidas de esta edad no muestran actividad FTR-letárgico; por lo tanto, esta categoría de la salud es un marcador de la enfermedad y respuesta al desafío. Enfermo ratones muestran síntomas FTR-letárgico (figura 3B) y podrían retroceder hacia Nonmobile FTR (figura 3), donde la pierna superior permanece paralela a la pierna inferior, con poca o cero cadera oscilante movimiento, que es uno de los criterios para criterio de valoración humana. Los ratones también podrían recuperarse, ganando mayor movimiento de cadera y convertirse en FTR-móvil (Figura 3A). Se determinaron la righting reflex y puntuaciones de movilidad para la izquierda y la derecha de cada ratón, y el puntaje más alto fue utilizado para determinar si el ratón había llegado a un extremo humano. Se obtuvo información conductual más de 240 animales con una dosis letal 60 (LD60) de la mezcla cecal, y 144 puntos finales fueron observados (figura 3D-F y tabla 1). Este enfoque basado en evidencia se utilizó para definir y afinar el extremo humano a través de cuatro etapas de la enfermedad, clasificadas por los experimentadores basados en ambos las diferencias conductuales entre los sobrevivientes y los que no sobreviven y por la fracción de extremos humanos alcanzadas durante cada período de tiempo. Durante los primeros experimentos, ratones Nonmobile FTR que ningún movimiento de cadera constantemente fueron encontrados muertos dentro de las 4-6 h de este comportamiento se observa. En la recolección de la información presentada, una puntuación de salud Nonmobile FTR se utilizó como criterio para un extremo humano. De postchallenge 12-21 h, mientras que ratones FTR Nonmobile fueron sacrificados, animales sobrevivientes y las muestran patrones de comportamiento muy similares y no pueden ser distinguidos de cualquier otro modo (figura 3D). De postchallenge 21-48 h, la mayoría de sobrevivir ratones recuperó su righting reflex, mientras que menos del 1% de los comportamientos FTR observados en los animales que van a sobrevivir el experimento (figura 3E). Así, los ratones que no se haga por ambos lados se convirtió en un criterio adicional para el extremo humano durante este tiempo. Entre 12 y 20 postchallenge h, 12.5% del total de puntos finales se observaron, versus 80,5% entre 20 y 48 h y 7% después de 48 h (tabla 1). Una característica distintiva entre ratones que acabó sobreviviendo y eventualmente se empeoró a un extremo humano fue la pérdida del reflejo del adrizamiento, independiente de la movilidad de cadera (figura 3F). De hecho, entre 20 y 48 h después del desafío, un total de 121 ratones había fallado a sí mismos de ambos lados, con 116 de estos ratones eventualmente progresar a un extremo humano (lo cual representa un 96% de precisión en la identificación de los ratones que no recuperaría). Más allá de 48 h después del desafío, se observaron 11 ratones para quebrar a la derecha ellos mismos de ambos lados y 10 de estos progresado a un extremo humano (un 91% de precisión). Más allá de 20 h después del desafío, el número de ratones que perdido el reflejo de adrizamiento para ambos lados predice el resultado final con una precisión de más del 90%; por lo tanto, esto se ha agregado a los criterios de punto final humano, identificar nonrecovering ratones antes y reducir ratón sufriendo (tabla 1).
La frecuencia que los ratones necesitan control cambia con el tiempo, debido a diferentes tasas de postchallenge de muerte y se describe en la tabla 1. Un ratón era considerado para estar en su punto final humanitario en cualquier momento si había fallado a sí mismo y estáticos movimiento de cadera en ambos lados, o si el ratón se encuentra dispersos de la jerarquía, podía correcto sí mismo y había aletargado movimiento hip. Ratones con cualquiera de estas condiciones no se esperaba para poder reincorporarse a la basura y se han observado que FTR Nonmobile dentro de 4-6 h. a partir 20 h después del desafío, se agregó un nuevo extremo humano porque la información presentada muestra que la gran mayoría de los ratones que FTR de ambas partes termina por sucumbir a la enfermedad.
Los videos, tablas y recursos presentados en este manuscrito son un recurso didáctico eficaz para la asignación correcta de comportamiento de ratones desafiados. Siete experimentadores pidieron ver el video de entrenamiento y leer tanto el protocolo como las mesas antes de asignar comportamientos a 60 animales desafiados. La identificación de la asignación del endpoint humana era precisa tanto para ratones de FTR-Nonmobile distintivas de los ratones que muestran otros comportamientos (Figura 4A) y ratones FTR de ratones que se haga dentro del tiempo permitido ( Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig1.jpg"> Figura 1 : Curva de supervivencia Kaplan-Meier, titulación de dosis de mezcla cecal y cambio de peso siguiendo el reto mezcla cecal. (A) resultados de supervivencia neonatal ratones C57BL/6J desafiada con una inyección intraperitoneal de mezcla cecal en DOL 7. Los datos de esta figura se combinan de experimentos independientes con desafío de múltiples dosis, que van de 0,7 a 1,3 mg de mezcla cecal por gramo de peso corporal fue administrados a los ratones. (B) Neonatal ratones desafiados con 0,80 a 0,95 mg de mezcla cecal por gramo de peso corporal de una preparación de la mezcla cecal mostrar una relación dosis dependiente entre la cantidad de mezcla ciego dado y el porcentaje de supervivencia. ()C) el porcentaje de cambio en el peso comparado con el peso del reto, con la línea de puntos que denotan un 20% de pérdida de peso desde el momento del desafío. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig2.jpg"> Figura 2 : Concentración de UFC en la acción de mezcla cecal almacenado a-80 ° C no cambia durante un período de 6 meses. El efecto de la edad de lodos cecal en concentración de UFC se evaluó mediante regresión lineal. Cada punto representa una parte alícuota de la misma preparación de la mezcla cecal, diluidos en serie y plateado durante un período de 6 meses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig3.jpg"> Figura 3 : Cadera categorías de movilidad de los ratones que no a ellos mismos y de comportamiento de los animales en diferentes épocas postchallenge. Ratones que han sido desmentidos con sepsis, cuando situados en su espalda, mostrará signos de morbilidad que se puede medir por el grado de movimiento de cadera. No (A) A la derecha (FTR)-ratón móvil muestra cadera oscilante movimiento de su pierna superior superior al ángulo de 90 ° respecto a la horizontal. (B) un FTR-letárgico muestra cadera oscilante movimiento del ratón pero no excede el ángulo de 90 ° de horizontal en cualquier momento durante los 4 s de vigilancia. (C) algunos FTR-Nonmobile ratones extenderán su pierna, flexión en la rodilla, pero muestran muy poco (menos de ángulos de 10 °) a cero cadera oscilante movimiento y las piernas permanecerán paralela entre sí. (D) comportamiento de los animales 12-21 h postchallenge mostrar que sólo comportamientos de FTR-Nonmobile separan a sobrevivientes de los que no sobreviven. (E) del 21 al postchallenge 48 h, sólo 4 de los comportamientos observados 592 de FTR (0.67%) pertenecen a los sobrevivientes, lo que permite el enderezamiento reflejo para predecir el resultado final y ser utilizado como un criterio nuevo para extremo humano. Postinfection de (F) más allá de 48 h, 6 clientes de los 131 ratones (4.55%) que tenían un reflejo adrizamiento pasó a formar parte del grupo FTR y fueron sacrificados al final del experimento, justificando el monitoreo sostenido a través del curso de recuperación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig4.jpg"> Figura 4 : Recursos educativos resultan en clasificación conductual exacta por experimentadores independientes. Experimentadores entrenados por ver el video que acompaña este protocolo categorizaron videos de 60 ratones neonatales en diferentes grupos. (A) la capacidad de distinguir un humano extremo fue determinada y un promedio de 97% de conductas fue correctamente categorizado como FTR Nonmobile o no, mientras que sólo el 1% de los ratones de FTR-Nonmobile eran mal identificado. Dos por ciento de los ratones fueron falsamente identificadas como Nonmobile FTR. (B) la identificación del segundo extremo humano criterio de distinguir correctamente entre ratones FTR o los que tienen la capacidad de ellos mismos a la derecha en 4 s de ser situados en su espalda fue asignada correctamente en el 97% de las puntuaciones, mientras que sólo 0.96% de los ratones fueron asignados incorrectamente como corregir ellos mismos y 2% de los ratones fueron asignado incorrectamente como FTR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Etapa de la enfermedad</td>
			<td>A: alta morbilidad, no mortalidad</td>
			<td>B: alta morbilidad, baja mortalidad</td>
			<td>C: alta morbilidad, alta mortalidad</td>
			<td>D: la baja morbilidad, baja mortalidad</td>
		</tr>
<tr>
<td>Horas post desafío</td>
			<td>0−12</td>
			<td>12−20</td>
			<td>20−48</td>
			<td>&gt; 48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Frecuencia de monitoreo</td>
			<td>desafío de 2 h post</td>
			<td>cada h 4−6</td>
			<td>Cada h 4−6, 8 h, sin vigilancia durante la noche</td>
			<td>1−2 veces al día, más si es necesario</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proporción de extremos humanos total observado</td>
			<td>0/144</td>
			<td>18/144</td>
			<td>116/144</td>
			<td>10/144</td>
		</tr>
<tr>
<td>Porcentaje de humanos extremos observados</td>
			<td>0%</td>
			<td>12.5%</td>
			<td>80,5%</td>
			<td>7%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Criterios de punto final humanitario</td>
			<td colspan="2">1. FTR−Nonmobile en ambos lados</td>
			<td colspan="2">1. FTR−Nonmobile en ambos lados</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2. dispersos de nido y es FTR−Lethargic</td>
			<td colspan="2">2. dispersos de nido y es FTR−Lethargic</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">3. FTR a izquierda o derecha (con cualquier grado de movilidad)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: frecuencia de monitoreo y humano criterios de punto final en las diferentes etapas de la enfermedad. Control de frecuencia, extremos humanas observa, el porcentaje de criterios de valoración humanas y criterios de punto final humanitario durante las diferentes etapas de la enfermedad.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reflejo de enderezamiento</td>
			<td>Movilidad</td>
			<td>Límite de tiempo para después ser colocado en parte posterior</td>
			<td>Límite de tiempo para medir la cantidad de movimiento (móvil / letárgico y estáticos)</td>
			<td>Criterios de puntuación de movilidad</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Derechos</td>
			<td>Móvil</td>
			<td rowspan="6">4 s</td>
			<td rowspan="3">Un 8 adicional s</td>
			<td>El ratón lleva varios pasos en una fila, mantener el impulso hacia el futuro y explora su entorno. Cachorro se caiga.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Letárgico</td>
			<td>El ratón puede dar un paso pero parada y pausa antes de tomar otro. Cachorro puede caerse.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonmobile</td>
			<td>El ratón no tiene las medidas después de corregir a sí mismo. Cachorro puede caerse.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">No derecho</td>
			<td>Caderas móviles</td>
			<td rowspan="3">El mismo 4 s utilizada para medir righting reflex</td>
			<td>Cuenta con enérgico movimiento de cadera con la pierna superior girando más allá de 90° de horizontal por lo menos una vez en 4 s.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caderas, letárgicos</td>
			<td>Movimiento de cadera para arriba pero no más allá de 90° respecto a la horizontal.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Estáticos las caderas</td>
			<td>Extremidades pueden moverse por prolongar y de contraer pero no gire las caderas. Perrito se ve muy enfermo.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: seguimiento de mesa y criterios en la determinación de la puntuación de la salud de los ratones. Se aplicaron los criterios proporcionados para definir grupos categoría a los ratones y para reducir la variación individual en la asignación de cuentas de salud.

Este protocolo proporciona los pasos necesarios para establecer y evaluar sepsis neonatal en ratones de 7 días de edad.

Un modelo de ratón controlado para la Sepsis Neonatal polimicrobiana

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

El modelo de lodos cecales para la sepsis polimicrobiana es una poderosa herramienta para diseccionar la fisiopatología neonatal única. Puede ser variable y los puntos finales humanos no están bien descritos. Aquí presentamos nuestro procedimiento altamente estandarizado para preparar un purine cecal e inyectar en animales experimentales.Además, utilizamos un enfoque basado en datos para identificar cachorros moribundos lo antes posible. Comencemos preparando un caldo de lodo cecal congelado. Esto se hace agrupando el cóncent cecal de al menos cinco ratones adultos, suspendiendo en agua dextrosa estéril, y almacenando en menos 80 para su uso posterior.Puedes usar machos o hembras, pero el sexo, la edad y el fondo de los ratones para tus experimentos deben mantenerse constantes. Primero, preparemos nuestras herramientas para la disección. Estos incluyen un conjunto de tijeras y fórceps para la piel y un segundo conjunto para los órganos internos.Encienda el esterilizador de perlas calientes al menos 30 minutos antes de su uso. Sumerja las herramientas en 70%etanol y luego sumerjalas en el esterilizador de cuentas calientes durante al menos un minuto. Rocíe una estera de toallas de papel con 70%etanol, luego retire las herramientas del esterilizador sin tocar la parte esterilizada de la herramienta a las manijas no estériles de otras herramientas.Colóquelos en la toalla de papel para enfriar. Disecciona a los ratones en un armario de seguridad biológica. Ancle las patas del ratón a una tabla de espuma de poliestireno usando agujas de calibre 23 para que el ratón esté hacia arriba.Rocíe el abdomen con 70%etanol. Usando fórceps y tijeras estériles, corta la piel del forro peritoneal con las tijeras y abre una región rectangular desde la ingle hasta el esternón y el lado izquierdo a derecho. Retire cualquier pelaje alrededor del peritoneo.Cambie a un nuevo par de herramientas estériles para cortar a través del peritoneo, haciendo también una abertura rectangular. Identifique el cecum, que debe correr de izquierda a derecha a través del cuerpo. Interrumpir el tejido conectivo para identificar las ramas de cecum de los intestinos y cortar el cecum lejos de los intestinos.Colóquelo en una hoja esterilizada de papel de pesaje. Usando herramientas estériles, cortar a través de ambos extremos del cecum. Sostenga el centro del cecum con fórceps y use una espátula plana de metal para empujar suavemente el contenido de la cecal fuera de los extremos usando un movimiento de rodadura.Recoja el contenido y colóquelo en un tubo centrífuga de 15 mililitros prepesado. A la piscina de contenido cecal de un máximo de cinco ratones en el mismo tubo. Pondera el tubo de nuevo una vez que se ha añadido todo el contenido.Para calcular el volumen de agua dextrosa para añadir al contenido de cecal en cada tubo, dividir el peso del contenido de cecal en el tubo por la concentración deseada en miligramos por mililitro. Mantenga una alícuota de agua dextrosa sobre hielo para la re-suspensión del contenido de cecal. Agregue la cantidad necesaria de agua dextrosa al tubo centrífuga de 15 mililitros que contiene contenido cecal.Vórtice el tubo vertical y horizontalmente durante aproximadamente 30 segundos. Observar la presencia de partículas de más de unos pocos milímetros de diámetro, y si está presente, continuar vórtice hasta que todas las partículas hayan desaparecido visiblemente. Coloque un tubo centrífugo de 50 mililitros sobre hielo para recoger el filtrado e instale un colador celular estéril de 70 micrómetros sobre la parte superior.Pipetear cuatro mililitros de lodos re-suspendidos de un tubo de 15 mililitros sobre el colador celular y en el tubo de recogida. Vuelva a suspender la partícula pipeteando hacia arriba y hacia abajo de dos a tres veces. Extruya suavemente las burbujas para aumentar la velocidad de filtrado mientras remueve el contenido con la punta de la pipeta hasta que no haya más líquido que se filtre.Esto debería tardar aproximadamente 30 segundos. Cambie los coladores celulares entre cada tubo de lodo cecal, pero acamle todo el contenido en el mismo tubo de recolección de 50 mililitros. Si su stock supera los 40 mililitros, entonces vórtice durante 15 segundos, y coloque 20 mililitros en un nuevo tubo de centrífuga.Divida la suspensión en viales criogénicos de 500 microlitros alícuotas cada uno. Vórtice la suspensión entre cada tres viales. Mantener el stock maestro en viales sobre hielo.Al almacenar alícuotas en menos 80, la concentración de la unidad de formación de colonias aeróbicas en una preparación de lodos cecales no cambia durante un período de seis meses. Ahora que la suspensión cecal está preparada, podemos usarla para desafiar a una camada de ratones de siete a ocho días de edad con una dosis ajustada de peso de lodo cecal. La letalidad de la suspensión depende de la dosis.Usted tendrá que determinar la dosis letal deseada en su instalación para cada nuevo stock con una nueva valoración de la dosis. Se prepara una alícuota de inyección de lodo cecal por camada. Normalizamos el inóculo a un volumen de 100 microlitros, redondeando a los 10 microlitros más cercanos para cada animal en la camada.Preparar el desafío alícuota requiere tres cálculos, el volumen de stock de lodos requeridos, volumen adicional de agua dextrosa, y el volumen redondeado para cada cachorro en la camada. Los detalles sobre cómo realizar cada cálculo se pueden encontrar en la sección tres del protocolo. Realizar estos cálculos a mano para cada experimento puede llevar mucho tiempo y contribuirá al error experimental, por lo que se puede descargar una hoja de cálculo junto con el protocolo en el que se introduce la concentración de existencias, la dosis deseada y el peso de la camada, y la cantidad de stock de lodos, el volumen de agua dextrosa y el volumen real por cachorro se devuelve automáticamente.Puede imprimir esta hoja y llevarla con usted cuando esté listo para desafiar a sus animales. Prepare la inyección alícuota en un armario de seguridad biológica y manténgala sobre hielo. Antes de cargar la jeringa, mezcle el tubo de microcentrífuga parpadeando 20 veces.Los cachorros son desafiados con una jeringa de insulina de calibre 28. Antes de elaborar los purines, mezcle la alícuota inspirando y expulsando de 300 a 500 microlitros del desafío alícuota de entrada y salida del tubo de microcentrífuga. A continuación, elaborar aproximadamente 150 microlitros del desafío alícuota.Esto debe ser mayor que el volumen de inyección para cualquier cachorro de siete a ocho días de edad. Deslice la jeringa para desalojar las burbujas del émbolo y retroceda ligeramente la jeringa para expulsar cualquier burbuja de aire. No toque la aguja ni el eje del émbolo durante este proceso.Dispensar el exceso de lodo cecal de nuevo en el tubo de microcentrífuga hasta que la cantidad calculada de lodo cecal para el ratón se cargue en la jeringa. La suspensión cecal se administra con una inyección intraperitoneal. Realice esto de acuerdo con el protocolo de su institución de cuidado animal.Para minimizar las fugas, incline al cachorro hacia abajo e inserte la aguja entre la pierna y los genitales, manteniendo la aguja superficial y subcutánea. Después de insertar la aguja alrededor de un centímetro, presione hacia abajo y hacia adelante hasta que sienta que la aguja perfora el peritoneo, luego presione lentamente el émbolo. Retire cuidadosamente la aguja siguiendo la misma ruta en la que entró, relajando el dedo medio mientras lo hace.Tenga en cuenta cualquier fuga en su cuaderno de laboratorio y considere la posibilidad de omitir animales con fugas sustanciales de su resultado final. En esta sección describiremos los diferentes niveles de salud que observamos en ratones desafiados con sepsis polimicrobiana y su correspondiente punto final humano. Para cualquier procedimiento que involucre ratones neonatales, transferimos el material de la ropa de cama a una nueva jaula.Esto transfiere el olor de la dama a sus guantes y reduce el estrés en la dama de la entrada repetida en su jaula. Hacemos un segundo nido en la nueva jaula para sostener a los cachorros monitoreados hasta el final del procedimiento o monitoreando cuando toda la camada está lista para ser devuelta a la jaula de la dama. Coloque un ratón sobre su espalda y monitoree la capacidad de la derecha dentro de cuatro segundos.Si puede hacerlo bien, espere ocho segundos más para determinar el nivel de movilidad. Un ratón indiscutible o en recuperación es más a menudo capaz de a la derecha y explorar su entorno mediante la toma de varios pasos en una fila. Reagrupar ratones que son capaces de enredarse y tomar algunos pasos para explorar su entorno como aletargado por derechos.Estos ratones pueden caerse mientras dan un paso y se ven temblorosos en sus pies. Un ratón que es incapaz de derecha y tiene movimiento de cadera que supera los 90 grados desde el horizontal que agrupamos como no a la derecha-móvil. Este ratón eventualmente se a la derecha, pero no puede en cuatro segundos.Debido a sus movimientos de cadera, se agrupa como no a la derecha-móvil. Los cachorros que fueron incapaces de la derecha y tienen movimiento de la cadera por debajo de 90 grados de horizontal se agrupan como no pueden letarfargo a la derecha. Este es otro ejemplo de un ratón cuyas caderas no superan los 90 grados de horizontal y se agrupa como no a la derecha-letárgico.Un cachorro que no esté en auto-no móvil tendrá piernas que pueden sacudirse o vibrar pero no tienen movimiento de cadera. Las extremidades pueden extenderse y retraerse, pero no tendrán movimiento lateral. El cachorro está visiblemente enfermo y ha llegado al punto final humano.Este es otro ejemplo de un cachorro que no puede ser no móvil. Sus caderas no se agitan de izquierda a derecha, pero sus patas vibran. Cuando se maneja la jaula de la dama, los cachorros pueden ser arrastrados fuera del nido si la dama de la enfermería corre.Los reemplazamos y luego buscamos otros cachorros dispersos que estén lejos de sus compañeros de nido. Si esos cachorros dispersos no se dejan letarhargic, están en un punto final humano. Aquí hay una curva de supervivencia Kaplan-Meier de nuestro modelo de sepsis.Los puntos de tiempo de monitoreo se pueden encontrar en el SOP adjunto. En cualquier punto a lo largo de la curva de supervivencia si se encuentra que un ratón no puede no ser a la derecha-no móvil, está en su punto final humano y eutanizado. Entre 12 y 21 horas después del desafío, los ratones aparecerán enfermos y aproximadamente la mitad de los ratones podrán hacerlo justo en un lado, mientras que la otra mitad no se ate en cualquiera de sus lados.Este es el período de tiempo en el que los ratones comenzarán a divagar en la puntuación de salud y alcanzar el punto final humano de no hacer el derecho-no móvil. Estos son resultados representativos de las puntuaciones de salud observadas en este período de tiempo. Los grupos de sobrevivientes y no sobrevivientes no se pueden diferenciar en este punto en función de sus puntuaciones de salud.En esta etapa de la enfermedad, de 21 a 48 horas después del desafío, observamos la mayor proporción de variables humanas. También hemos observado que la gran mayoría de los ratones que son incapaces de endar en ambos lados no terminarán recuperándose de la enfermedad, lo que se convierte en un nuevo criterio para la variable humana, además de los criterios de no hacerlo a la derecha-no móvil. Las puntuaciones de salud observadas durante esta etapa de la enfermedad dieron lugar a una separación de sobrevivientes de no sobrevivientes.La gran mayoría de los ratones que no pudieron hacerlo a ambos lados no se recuperaron de la enfermedad. Estos datos admiten que un nuevo criterio para una variable humana a partir de las 21 horas después del desafío debe ser eutanasiar a los ratones que no estén a la derecha en ambos lados. Durante 48 horas después del desafío muchos ratones comenzarán a mostrar más actividad y un mejor reflejo de correcta.A pesar de que la proporción de variables humanas es menor en este período, los ratones todavía pueden divagar y enfermarse, y todavía requieren monitoreo para la variable humana. Durante este período de tiempo, algunos de esos ratones que finalmente se agruparon como no supervivientes habían mostrado un aumento de la actividad en un momento, pero más tarde lo hicieron peor y alcanzaron un punto final humano. Esto requiere un monitoreo continuo de los animales enfermos con mayor frecuencia si comienzan a mostrar peores resultados de salud.Los experimentadores independientes que no han recibido entrenamiento en persona y que sólo observan este video instructivo fueron probados en su capacidad de asignar la misma puntuación que los investigadores usando videos de prueba grabados. Este video instructivo da como resultado una clasificación del comportamiento precisa. La capacidad de asignar la puntuación correcta para no hacerlo a los ratones neonatales no móviles, que es una medida de la variable humana, se determinó de 60 ratones neonatales, y un promedio del 97% de los comportamientos se distinguieron con precisión, con sólo el 3% identificado erróneamente.A continuación, se probó la capacidad de diferenciar los ratones neonatales que no tenían razón o que eran capaces de hacerlo en cuatro segundos. Esta es otra medida de la variable humana y fue asignada con precisión en el 97% de los ratones neonatales, mientras que el 3% de los cachorros fueron asignados incorrectamente como correctores. Aquí hay resultados representativos para el porcentaje de cambio de peso de los ratones en comparación con su tiempo de desafío.El cambio de peso promedio entre sobrevivientes y no sobrevivientes comenzó a separarse a las 24 horas después del desafío, pero hay mucha superposición entre los grupos. Hubo algunos sobrevivientes que perdieron más del 20% de peso pero todavía se recuperaron de la enfermedad. El cambio de peso no fue tan eficiente en la predicción de resultados en comparación con las diferencias en las puntuaciones de salud, razón por la cual no se utiliza como criterio para determinar si los ratones están en un punto de vista humano.Para concluir, ahora debería ser capaz de preparar un stock de lodos cecales congelados, calcular la dosis ajustada por peso. E inyecte y monitoree ratones recién nacidos para obtener puntos finales humanos. Esperamos que este sea un recurso valioso para su investigación de ratón.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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